Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

في تحليل المختبر من PDZ التي تعتمد على المجمعات ضخم الجزيئات CFTR اشارة

Published: August 13, 2012 doi: 10.3791/4091
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3
1Department of Biochemistry & Molecular Biology, Wayne State University School of Medicine, 2Cardiovascular Research Institute, Wayne State University School of Medicine, 3Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Wayne State University School of Medicine

Summary

وقد أبلغ الكيسي تصرف عبر الغشاء منظم التليف (CFTR)، وقناة كلوريد الظهارية، للتفاعل مع مختلف البروتينات وتنظيم العمليات الخلوية الهامة، من بينها قد تم PDZ CFTR عزر بوساطة التفاعلات موثقة توثيقا جيدا. يصف هذا بروتوكول طرق التي قمنا بتطويرها لتجميع الجزيئات CFTR PDZ التي تعتمد على إشارات معقدة

Abstract

الكيسي تصرف عبر الغشاء منظم التليف (CFTR)، وهي قناة كلوريد تقع في المقام الأول على الأغشية قمية من الخلايا الظهارية، يلعب دورا حاسما في توازن السوائل بطريق الظهارة 1-3. وقد تورط CFTR في اثنين من أهم الأمراض: التليف الكيسي (CF) (4) وإفرازي الإسهال 5. في قوات التحالف، ويتم تقليل توليف أو النشاط الوظيفي للقناة الكلور CFTR. هذا الاضطراب يصيب حوالي 1 في 2500 القوقازيين في الولايات المتحدة 6. كما تم الإفراط في النشاط CFTR المتورطين في حالات السموم التي يسببها الاسهال إفرازي (على سبيل المثال، بواسطة بكتيريا الكوليرا والحرارة كولاي معوي مستقر) الذي يحفز المخيم أو إنتاج المركب في القناة الهضمية 7.

تراكم الأدلة تشير إلى وجود تفاعلات المادية والوظيفية بين CFTR وعدد متزايد من البروتينات الأخرى، بما في ذلك شركات النقل، والقنوات الأيونية، والمستقبلات، كاينيسات، phosphatases، إشارةوقد تبين أن الجزيئات جي، وعناصر هيكل الخلية، وهذه التفاعلات بين CFTR وبروتينات لها ملزم للمشاركة حاسمة في تنظيم CFTR بوساطة نقل أيون بطريق الظهارة في المختبر، وأيضا في الجسم الحي 8-19. في هذا البروتوكول، ونحن نركز فقط على الطرق التي تساعد في دراسة التفاعلات بين ذيل CFTR محطة الكربوكسيل، التي تمتلك عزر بروتين ملزمة [يشار إلى PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) عزر]، و وأشار مجموعة من البروتينات سقالة، والتي تحتوي على وحدة نمطية محددة وملزمة لمثل المجالات PDZ. حتى الآن، تم الإبلاغ عن عدة بروتينات مختلفة PDZ سقالة لربط محطة الذيل الكربوكسيل من CFTR مع الانتماءات المختلفة، مثل NHERF1، NHERF2، PDZK1، PDZK2، CAL (CFTR المرتبطة يجند)، Shank2، وغراسب 20-27. وعزر PDZ ضمن CFTR معترف بها من قبل البروتينات سقالة PDZ هو آخر أربعة الأحماض الأمينية في محطة C (أي، 1477، DTRL-1480 في CFTR الإنسان) 20. ومن المثير للاهتمام،يمكن CFTR ربط أكثر من واحد PDZ نطاق كل من NHERFs وPDZK1، وإن كان ذلك بدرجات متفاوتة من الانتماءات 22. وقد تبين أن هذا multivalency فيما يتعلق ملزم CFTR أن تكون ذات أهمية وظيفية، مما يوحي بأن PDZ البروتينات سقالة قد تسهل تشكيل الجزيئات CFTR يشير مجمعات لإشارات محددة / انتقائي وفعال في الخلايا 16-18.

وقد وضعت فحوصات الكيمياء الحيوية متعددة لدراسة CFTR، التي تنطوي على تفاعلات البروتين، مثل مناعي المشترك، فحص المنسدلة، زوج من الحكمة فحص ملزم، اللونية الزوج الحكيم فحص ملزمة، وفحص الجزيئات المعقدة الجمعية 16-19،28،29 . هنا نركز على الإجراءات التفصيلية لتجميع عزر التي تعتمد على PDZ CFTR المحتوية على الجزيئات المعقدة في المختبر، والذي يستخدم على نطاق واسع من قبل مختبر لدينا لدراسة البروتين البروتين أو المجال نطاق التفاعلات التي تنطوي على CFTR 16-19،28،29.

Protocol

1. التعبير وتنقية البروتينات المؤتلف المرتبطة دلاليا الانصهار في البكتيريا

  1. تضخيم مناطق محددة من C-ذيول (آخر 50-100 الأحماض الأمينية التي تحتوي على زخارف PDZ في نهاية-C) لCFTR، LPA 2، MRP2، MRP4، β 2 AR، وNHERFs (بالطول أو المجالات PDZ1 أو PDZ2 ) بواسطة PCR النهج.
  2. استنساخ المنتجات PCR إلى ناقلات-1 pGEX4T للضريبة السلع والخدمات، الانصهار البروتينات (مثل ضريبة السلع والخدمات، NHERFs، ضريبة السلع والخدمات، MRP4 CT)، pMAL-C2 ناقلا لMBP-الانصهار البروتينات (مثل MBP-CT AR β 2، MBP-CT CFTR )، وpET30 للبروتينات صاحب S-الانصهار (مثل صاحب-S-CFTR CT، صاحب-S-PDZK1).
  3. تحول في E. البروتيني التي تعاني من نقص سلالة بكتيريا (BL21-DE3) للحد من تدهور محتمل بروتين المؤتلف.
  4. تنمو ثقافة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في لوريا، Bertani المتوسط ​​(درجة الحموضة 7.0) التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة (مثل الأمبيسلين أو الكانامايسين). تمييع ثقافة بين عشية وضحاها في 1:10 وتنمو لمدة ساعة 2 في 37 درجة مئوية. فيديوس مع 0،5-1 م م IPTG لح 4 التالي في 30 درجة مئوية. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي عند 8000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  5. ليز الخلايا في الواق السكروز (50 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 1 م م EDTA، 1 م م PMSF، والسكروز 10٪) تحتوي على الليزوزيم (1 ملغ / مل)، تريتون 0.2٪ X-100، والبروتيني مثبطات. استخدم 20 مل للخلية بيليه مصدرها 1 لتر من ثقافة.
  6. خلط على دوار شاكر لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية.
  7. تدور في غرام × 20000 لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية. جمع وطاف واضح.
  8. في طاف واضح، إضافة 1 مل من الخرز الراتنج / الاغاروز التالية (الطين 50٪ في الواق السكروز):
    • الجلوتاثيون الخرز الاغاروز للبروتينات اندماج ضريبة السلع والخدمات.
    • الخرز تالون لصاحب-S بروتينات اندماج.
    • أميلوز راتنج للبروتينات اندماج MBP.
  9. المزيج لمدة 4 ساعات في 4 درجات مئوية على دوار شاكر.
  10. تغسل حبات بواسطة resuspending في برنامج تلفزيوني 1X (15 مل)، والخلط لمدة 2 ميلن، والغزل في 800 × ز لمدة 2 دقيقة، والتخلص من طاف. كرر هذه الخطوة لمدة ست مرات.
  11. أزل هذا البروتين من الخرز باستخدام كل العازلة شطف (2 العازلة شطف مل لكل 1 مل من الخرز).
    • العازلة شطف للبروتينات اندماج ضريبة السلع والخدمات: تخفيض 25 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 8.0)، 140 م م كلوريد الصوديوم، و 20 م م الجلوتاثيون.
    • العازلة شطف للبروتينات اندماج له: 20 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 8.0)، 500 م م كلوريد الصوديوم، و 200 م إيميدازول M.
    • العازلة شطف للبروتينات اندماج MBP: 20 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 8.0)، 200 م م كلوريد الصوديوم، 1 م م EDTA، 1 م م DTT، و 10 م م المالتوز.
  12. Dialyze البروتينات مزال ضد 2 ليتر من برنامج تلفزيوني 1X في 4 درجات مئوية (لتجنب احتمال تدهور البروتين). تغيير برنامج تلفزيوني كل ح (4) لأربع مرات. تركيز بروتين باستخدام فلتر Centricon (10،000 ميغاواط قطع، ميليبور) والمخزن كما aliquots صغير في -80 درجة مئوية.
  13. ديتإيرمين تركيز البروتين من خلال طريقة برادفورد. تقييم جودة البروتين بواسطة SDS-PAGE باستخدام جيش صرب البوسنة والمعايير. إذا كان سلامة من البروتين ليست مرضية، قد يتم استخدام إجراءات تنقية ثانوية مثل ترشيح الهلاميات أو التبادل الأيوني. (على سبيل المثال، استخدمنا عمود G-75 sepharose و لتنقية مزيد من ضريبة السلع والخدمات، انصهار بروتين).

2. خلية ثقافة وتحضير الخلايا المحللة

  1. ثقافة الكلى الهامستر طفل (BHK) الخلايا التي ستابلي الإفراط في التعبير عن CFTR، بالوزن وCFTR his10 أو خلايا BHK عابر أن الإفراط في التعبير عن العلم، LPA 2-بالوزن أو علم LPA-2-ΔSTL، ومدين، داربي الكلى الكلاب (MDCK ) الخلايا التي ستابلي الإفراط في التعبير عن MRP2 في المتوسط ​​النسر الأساسية الدنيا (MEM) التي تحتوي على 10٪ الجنين المصل في ربلة الساق والبنسلين / الستربتومايسين في قوارير البوليسترين في 37 درجة مئوية مع ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ 2.
  2. ثقافة الجنينية البشرية الكلى 293 (HEK293) الخلايا التي ستابلي الإفراط في التعبير عن CFTR، بالوزن وCFTR-his10 في Dulbecco'متوسطة ق تعديل النسر (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني والبنسلين / الستربتومايسين في قوارير البوليسترين في 37 درجة مئوية مع ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ 2.
  3. ليز الخلايا في الواق تحلل (PBS - 0.2٪ تريتون-X-100 تستكمل مع مزيج من مثبطات الأنزيم البروتيني يحتوي على الفلورايد phenylmethylsulphonyl 1 م م، 1 ميكروغرام / أبروتينين مل، 1 ميكروغرام / leupeptin مل، 1 ميكروغرام / pepstatin مل)، واستخدام 500 العازلة تحلل ميكرولتر لكل طبق بيتري من عيار 60 ملم، و 1000 العازلة تحلل ميكرولتر لكل طبق بيتري 100 ملم.
  4. صخرة الخلية lysates لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية، وإزالة المواد غير قابلة للحل عن طريق الطرد المركزي في 16000 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. تحديد تركيز البروتين بواسطة الفحص برادفورد.

3. في الجمعية المختبر من مجمع ضخم الجزيئات CFTR التي تحتوي على (CFTR-PDZK1-MRP4)

  1. إلى 200 ميكرولتر من العازلة تحلل (PBS - 0.2٪ تريتون-X 100 + مثبطات الأنزيم البروتيني)، إضافة 20 ميكروغرام المطهرون ضريبة السلع والخدمات، MRP4-C محطة50 AA (CT50) انصهار بروتين.
  2. إضافة كميات مختلفة (0-40 ميكروغرام) من تنقية صاحب-S-PDZK1 انصهار بروتين.
  3. مزيج من البروتينات اثنين على خلاط دوار عند 22 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعات.
  4. إضافة 20 حبات الجلوتاثيون ميكروليتر (50٪ الطين) إلى خليط من البروتين، والاستمرار في خلط لآخر ح 1. ويشار أيضا إلى هذه الخطوة على أنها زوج من الحكمة ملزم.
  5. خلال هذا الوقت، وإعداد lysates خلية HEK293 التي overexpress العلم، CFTR (وزن) كما هو موضح أعلاه في الخطوة 2).
  6. غسل المجمع مرتين مع عازلة تحلل. تدور في ز × 800 لمدة 1 دقيقة لكل غسل ونضح بعناية طاف بعد كل غسيل. كن حذرا لا لتمتص قبالة الخرز في القاع.
  7. إضافة أعلاه معدة lysates خلية HEK293 إلى الخرز، وتخلط بلطف في 4 درجة مئوية لمدة 3 ساعة (أو بين عشية وضحاها).
  8. تغسل حبات ثلاث مرات على نطاق واسع مع تحلل العازلة كما هو موضح في الخطوة 3.6).
  9. أزل البروتينات باستخدام الاحتياطي 30 عينة ميكرولتر (5 ×): 0.6 م تريس، حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 6.8)، 50٪ الجلسرين، SDS 2٪، و 0.1٪ زرقة البروموفينول، تحتوي على 5٪ β-المركابتويثانول.
  10. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة حمام ماء 10-15 دقيقة، وتدور في 5000 × ز لمدة 30 ق لترسيب الخرز.
  11. تحميل جميع شطافة على هلام 4-15٪.
  12. تشغيل SDS-PAGE لنحو دقيقة 30-40.
  13. نقل نطاقات البروتين إلى الغشاء PVDF، مقابل 1.5 ساعة.
  14. منع الغشاء في TBS-توين التي تحتوي على 5٪ من الدهون غير الحليب.
  15. احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الأولية (مثل مكافحة CFTR مفتش الحكومة، R1104) في 4 درجات مئوية، بين عشية وضحاها.
  16. غسل الغشاء مع TBS-توين لمدة 5 دقائق، ست مرات.
  17. احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الثانوية (مثل الماعز لمكافحة فأر HRP، مترافق الضد الثاني 2) لمدة 45 دقيقة في 22 درجة مئوية.
  18. غسل الغشاء مع TBS-توين لمدة 5 دقائق، ست مرات.
  19. تصور الفرق بروتين عبر ECL.
  20. وتظهر بيانات ممثل في الشكل 1.
jove_title "> 4. النتائج الممثل

ويرد مثال على مجمع الجزيئات CFTR التي تحتوي على إشارات التي تم تجميعها في المختبر في الشكل 1. وأشار إلى تشكيل مجمع الجزيئات بين MRP4 الأحماض 50 C-محطة الأمينية (MRP4-CT50)، PDZK1، وكامل طول CFTR (الشكل 1، أسفل). زيادة في تشكيل مجمع الجرعة بشكل تابع مع ​​كميات متزايدة من البروتين وسيط، PDZK1 (الشكل 1، أسفل) 18.

الشكل 1
الشكل 1. عرضا مصورا لفحص الجزيئات المعقدة (أعلى). تم الكشف عن الجزيئات المعقدة في المختبر مع ثلاثة من البروتينات (GST-MRP4-CT50، صاحب-S-PDZK1، وعلم CFTRwt-) بطريقة تعتمد على الجرعة (أسفل) 18.

2 (المرجع 14) CFTR-NHERF2 LPA-2 (المرجع: 15) CFTR-PDZ البروتينات-MRP 2 (المرجع: 17) CFTR-PDZK1-MRP4 (المرجع 16)
تقارب الخرز أميلوز الراتنج S-بروتين الاغاروز أميلوز الراتنج الجلوتاثيون الاغاروز
تنقية البروتين-1 MBP β-2 AR CT له-S-CT CFTR MBP-CT CFTR ضريبة السلع والخدمات، MRP4 CT
تنقية البروتين-2 ضريبة السلع والخدمات، NHERF1 ضريبة السلع والخدمات، NHERF2 ضريبة السلع والخدمات، PDZ البروتينات له-S-PDZK1
تنقية البروتين-3 (أو lysates الخلية) CFTR-بالوزن أو CFTR-his10 (BHK أو lysates خلية كلوة الجنين البشري) علمLPA-2-بالوزن أو علم LPA-2-ΔSTL (lysates خلية BHK) MRP2 (lysates خلية MDCK) تنقية العلم، CFTR-بالوزن أو CFTR his10-(أو lysates الخلية)
الجسم المضاد المضادة للمفتش CFTR المضادة للعلم HRP المضادة للمفتش MRP2 المضادة للعلم HRP

الجدول رقم 1. ملخص لمختلف المجمعات الجزيئات CFTR التي تحتوي على تجميعها في المختبر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذا البروتوكول أثبتنا وسيلة لتجميع في المختبر والكشف عن CFTR التي تحتوي على مجمع الجزيئات يشير الى استخدام البروتين النقي (أو أجزاء بروتين) و / أو lysates خلية كما ذكرت سابقا 16-19،29،30. لتحقيق أفضل النتائج في النقاط التالية الحاسمة خلال عملية الإعداد تتطلب اهتماما خاصا:

  • من المهم أن يتم تعديل الرقم الهيدروجيني للالعازلة شطف إلى 8.0 بعد إضافة الجلوتاثيون انخفاض عندما تنقية البروتين ضريبة السلع والخدمات، الانصهار كما هو موضح في الخطوة 1). لا يمكن للدرجة الحموضة تكون منخفضة مثل 3.0 بعد إضافة الجلوتاثيون مخفضة. إذا لم يتم ضبط درجة الحموضة قبل شطف، وقلل بشكل كبير من الكفاءة من شطف.
  • عندما يتم مزال البروتين من الخرز، وأنها بحاجة إلى مدال على الفور، وإلا فإن البروتين النقي قد يخرج من الحل. إذا غسيل الكلى بروتين غير ممكن مباشرة بعد عملية شطف، لا أزل البروتين وتركهم مع اله الاغاروز / الخرز.
  • فمن المستحسن أن لا تغلي عينات الجزيئات CFTR التي تحتوي على مجمع أعدت للغرب النشاف كما CFTR تجميع مشكلة شائعة. بدلا من ذلك، ينبغي تسخين العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة قبل تحميلها في هلام.
  • للمجمع البروتين التفاعل مع تقارب منخفضة، ويمكن للطخة مناعية يمكن تصور استخدام SuperSignal الغرب فيمتو (أو بيكو) الحد الأقصى الركيزة الحساسية (بيرس) لزيادة إشارة.

هذا الاسلوب أثبت هنا يوفر فحص مريحة وقابلة للتكرار لتحديد كيميائيا 1 CFTR المحتوية على بروتين مجمع العالي. هناك طرق متعددة لتجميع المختبر في المجمعات الجزيئات CFTR على النحو المبين في الجدول رقم 1.

  • من أجل الحصول على نتائج مقنعة، ينبغي للمرء محاولة لتجميع المعقدة في كلا الاتجاهين، أي أنا) CFTR - PDZ سقالة بروتين (ق) - البروتين الثالثة؛ الثاني) للبروتين 3 - PDZ سقالة بروتين (ق) - CFTR.
  • من أجل إثبات PDZ عزر تبعية لتشكيل الجزيئات المعقدة، CFTR-his10 (CFTR-his10 يحتوي على 10 صاحب المخلفات في ذيل C-محطة، وهذا البروتين لديه فكرة PDZ الداخلية ولا يمكن ربط NHERFs 29)، والبروتينات مع بهم زخارف PDZ تحور أو حذف (مثل β 2 AR-L413A؛ LPA 2-ΔSTL، الخ) يمكن استخدامها في موازية في فحص الجزيئات المعقدة كذلك.
  • بدلا من استخدام lysates كامل من الخلايا التي تحتوي أيضا على العديد من المكونات الأخرى، ونحن يمكن لأحد أن استخدام البروتينات النقية (مثل بروتين 3) في 3.7 خطوة) (كما هو الحال في جمعية CFTR-MRP4-PDZK1، وتستخدم أيضا في تنقية العلم CFTR؛ المرجع 18). يوفر هذا نتيجة مقنعة للمجمع فقط ثلاثي بروتين، كما أن هناك فقط 3 البروتينات النقية الواردة في نظام الجمعية العامة بكامل هيئتها.

ومع ذلك، كشف للمجمع الجزيئات CFTR في المختبر باستخدام purifiالبروتينات إد (أو أجزاء البروتين) أو lysates من الخلايا التي overexpress CFTR أو البروتينات المتفاعلة لا يشير إلى ما إذا كانت معقدة الجزيئات يشير الى وجود خلايا في أن التطور الطبيعي التعبير عن هذه البروتينات المتفاعلة. لمعالجة هذه المسألة، يمكن تنفيذ التعاون مناعي لتقييم المجمعات CFTR الذاتية في الخلايا مثل الخلايا الظهارية الهوائية 16 والقناة الهضمية الخلايا الظهارية 17،18. وعلاوة على ذلك، يمكن إجراء تحليل الطيف كتلة و 2 الأبعاد الكهربائي للهلام 29 إلى تحديد الشركاء ملزم غير معروف لCFTR. ومع ذلك، فإنه يقع خارج نطاق هذا البروتوكول لإثبات هذه التقنيات.

وبالإضافة إلى ذلك، يجوز للتوطين التحت خلوية للتفاعل البروتينات في الجسم الحي تؤثر أيضا على التفاعلات الجزيئية. على سبيل المثال، فقد تبين MRP4 أن أعرب في الأغشية على حد سواء وbasolateral قمي، في حين يكون موضعيا CFTR في المقام الأول إلى غشاء قمي، على الرغم من أنها كانت ديmonstrated للتفاعل جسديا وظيفيا مع بعضها البعض عن طريق بروتين سقالة PDZ PDZK1 18. وعلاوة على ذلك، overexpression من البروتينات المؤتلف، كما هو مستخدم في بروتوكول الحالي، قد تؤثر على توطين هذه التحت خلوية وبالتالي تمكين التفاعلات التي لولاها لم يحدث. وينبغي أيضا هذه إمكانية أن تؤخذ في الاعتبار عند تفسير البيانات واستقراء النتائج.

على الرغم من أن بروتوكول الحالي يركز على إجراءات لتجميع PDZ التي تعتمد على المجمعات الجزيئات CFTR التي تحتوي على هذا البروتوكول أيضا التطبيقات المحتملة في تجميع غير CFTR تشارك متعددة بروتين معقد (إما PDZ التي تعتمد على أو مستقلة). في الآونة الأخيرة، وذلك باستخدام هذا الفحص الجمعية الجزيئات، وقد أثبتنا أن CXCR2 مستقبلات chemokine يشكل بدنيا مجمع بروتين له مع المصب المستجيب بوساطة 2 PLCβ عبر NHERF1 في العدلات، وهذه الجزيئات المعقدة CXCR2 لديه وظيفيأهمية وتعطيل مجمع (عن طريق استخدام الخارجية CXCR2 الببتيد) الموهن بشكل كبير وظائف العدلات 31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وقد تم دعم عملنا من المنح المقدمة من جمعية القلب الأميركية (جنوب شرق الكبرى التابعة ل) 0765185B البداية للمنح في والمعونة، وU. باردي إلسا مؤسسة منح البحوث، وجامعة واين ستيت صندوق بدء التشغيل ضمن الجدران والقلب والأوعية الدموية بحوث مبادرة إيزيس جائزة المعهد. وكان في الأصل هذه الطريقة في المختبر من الجزيئات CFTR الجمعية المعقدة التي بدأها الدكتور AP نارين (جامعة تينيسي مركز علوم الصحة).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pGEX4T-1 vector GE Healthcare 28-9545-49 formerly Amersham Biosciences
pMAL-C2 vector New England BioLabs
pET30 vector EMD Chemicals 69077-3 formerly Novagen
Glutathione agarose beads BD Biosciences 554780
Amylose resin New England BioLabs E8021S
Talon beads Clontech 635501
reduced glutathione BD Biosciences 554782
imidazole Fisher BP305-50
maltose Fisher BP684-500
S-protein agarose EMD Chemicals 69704-3 formerly Novagen
Anti-Flag HRP Sigma A8592
Anti-CFTR IgG Custom-made R1104 mAb recognizing CFTR epitope at a.a. 722-734
Anti-MRP2 IgG Chemicon International MAB4148 Now a part of Millipore

Table 2. Specific reagents and equipment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anderson, M. P. Demonstration that CFTR is a chloride channel by alteration of its anion selectivity. Science. 253, 202-205 (1991).
  2. Bear, C. E. Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR. Cell. 68, 809-818 (1992).
  3. Quinton, P. M. Chloride impermeability in cystic fibrosis. Nature. 301, 421-422 (1983).
  4. Cheng, S. H. Defective intracellular transport and processing of CFTR is the molecular basis of most cystic fibrosis. Cell. 63, 827-834 (1990).
  5. Gabriel, S. E., Brigman, K. N., Koller, B. H., Boucher, R. C., Stutts, M. J. Cystic fibrosis heterozygote resistance to cholera toxin in the cystic fibrosis mouse model. Science. 266, 107-109 (1994).
  6. Li, C., Naren, A. P. CFTR chloride channel in the apical compartments: spatiotemporal coupling to its interacting partners. Integr. Biol (Camb). 2, 161-177 (2010).
  7. Chao, A. C. Activation of intestinal CFTR Cl- channel by heat-stable enterotoxin and guanylin via cAMP-dependent protein kinase. Embo. J. 13, 1065-1072 (1994).
  8. Gabriel, S. E., Clarke, L. L., Boucher, R. C., Stutts, M. J. CFTR and outward rectifying chloride channels are distinct proteins with a regulatory relationship. Nature. 363, 263-268 (1993).
  9. McNicholas, C. M. Sensitivity of a renal K+ channel (ROMK2) to the inhibitory sulfonylurea compound glibenclamide is enhanced by coexpression with the ATP-binding cassette transporter cystic fibrosis transmembrane regulator. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 8083-8088 (1996).
  10. Schreiber, R., Nitschke, R., Greger, R., Kunzelmann, K. The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator activates aquaporin 3 in airway epithelial cells. J. Biol. Chem. 274, 11811-11816 (1999).
  11. Shumaker, H., Amlal, H., Frizzell, R., Ulrich, C. D. 2nd, Soleimani, M. CFTR drives Na+-nHCO-3 cotransport in pancreatic duct cells: a basis for defective HCO-3 secretion in CF. Am. J. Physiol. 276, 16-25 (1999).
  12. Ahn, W. Regulatory interaction between the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and HCO3- salvage mechanisms in model systems and the mouse pancreatic duct. J. Biol. Chem. 276, 17236-17243 (2001).
  13. Sugita, M., Yue, Y., Foskett, J. K. CFTR Cl- channel and CFTR-associated ATP channel: distinct pores regulated by common gates. Embo. J. 17, 898-908 (1998).
  14. Naren, A. P. Regulation of CFTR chloride channels by syntaxin and Munc18 isoforms. Nature. 390, 302-305 (1997).
  15. Naren, A. P. Syntaxin 1A is expressed in airway epithelial cells, where it modulates CFTR Cl(-) currents. J. Clin. Invest. 105, 377-386 (2000).
  16. Naren, A. P. A macromolecular complex of beta 2 adrenergic receptor, CFTR, and ezrin/radixin/moesin-binding phosphoprotein 50 is regulated by PKA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 342-346 (1073).
  17. Li, C. Lysophosphatidic acid inhibits cholera toxin-induced secretory diarrhea through CFTR-dependent protein interactions. J. Exp. Med. 202, 975-986 (2005).
  18. Li, C. Spatiotemporal coupling of cAMP transporter to CFTR chloride channel function in the gut epithelia. Cell. 131, 940-951 (2007).
  19. Li, C., Schuetz, J. D., Naren, A. P. Tobacco carcinogen NNK transporter MRP2 regulates CFTR function in lung epithelia: implications for lung cancer. Cancer Lett. 292, 246-253 (2010).
  20. Hall, R. A. A C-terminal motif found in the beta2-adrenergic receptor, P2Y1 receptor and cystic fibrosis transmembrane conductance regulator determines binding to the Na+/H+ exchanger regulatory factor family of PDZ proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 8496-8501 (1998).
  21. Short, D. B. An apical PDZ protein anchors the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator to the cytoskeleton. J. Biol. Chem. 273, 19797-19801 (1998).
  22. Wang, S., Yue, H., Derin, R. B., Guggino, W. B., Li, M. Accessory protein facilitated CFTR-CFTR interaction, a molecular mechanism to potentiate the chloride channel activity. Cell. 103, 169-179 (2000).
  23. Sun, F. E3KARP mediates the association of ezrin and protein kinase A with the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in airway cells. J. Biol. Chem. 275, 29539-29546 (2000).
  24. Cheng, J. A Golgi-associated PDZ domain protein modulates cystic fibrosis transmembrane regulator plasma membrane expression. J. Biol. Chem. 277, 3520-3529 (1074).
  25. Scott, R. O., Thelin, W. R., Milgram, S. L. A novel PDZ protein regulates the activity of guanylyl cyclase C, the heat-stable enterotoxin receptor. The Journal of biological chemistry. 277, 22934-22941 (1074).
  26. Lee, J. H. Dynamic regulation of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator by competitive interactions of molecular adaptors. The Journal of biological chemistry. 282, 10414-10422 (2007).
  27. Gee, H. Y., Noh, S. H., Tang, B. L., Kim, K. H., Lee, M. G. Rescue of DeltaF508-CFTR trafficking via a GRASP-dependent unconventional secretion pathway. Cell. 146, 746-760 (2011).
  28. Naren, A. P. Methods for the study of intermolecular and intramolecular interactions regulating CFTR function. Met. Molecul. Med. 70, 175-186 (2002).
  29. Li, C., Roy, K., Dandridge, K., Naren, A. P. Molecular assembly of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in plasma membrane. The Journal of biological chemistry. 279, 24673-24684 (2004).
  30. Li, C., Naren, A. P. Analysis of CFTR Interactome in the Macromolecular Complexes. Met. Molecul. Med. 741, 255-270 (2011).
  31. Wu, Y. A chemokine receptor CXCR2 macromolecular complex regulates neutrophil functions in inflammatory diseases. J. Biol. Chem. , (2011).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 66، البيولوجيا الجزيئية، الكيمياء، CFTR ومعقدة الجزيئات، والتفاعل البروتين، PDZ سقالة البروتين، والخلايا الظهارية، والتليف الكيسي
<em>في</em> تحليل <em>المختبر</em> من PDZ التي تعتمد على المجمعات ضخم الجزيئات CFTR اشارة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, Y., Wang, S., Li, C. In… More

Wu, Y., Wang, S., Li, C. In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes. J. Vis. Exp. (66), e4091, doi:10.3791/4091 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter