Icke-plasma Limning av PDMS för billig Tillverkning av mikroflödessystem enheter

Summary

I denna video visar vi hur du använder neuron mikroflödessystem enheten utan plasma bindning.

Abstract

I denna video visar vi hur du använder neuron mikroflödessystem enheten utan plasma bindning. I vissa fall kan det vara önskvärt att reversibelt band enheter till Corning Nr 1 skyddsglas. Detta kan bero, kanske, till en plasma renare inte är tillgänglig. I andra fall kan det vara önskvärt att ta bort enheten från glaset efter odling av nervceller för vissa typer av mikroskopi eller för immunfärgning, men det är inte nödvändigt att ta bort enheten för immunfärgning eftersom nervceller kan färgas i enheten. Vissa forskare är dock fortfarande föredrar att ta bort enheten. I det här fallet är reversibel bindning av enheten till att omfatta glas som möjligt. Det finns vissa nackdelar med icke-plasma bindning av enheterna i den inte lika stram av ett sigill bildas. I vissa fall axoner kan växa under spåren snarare än genom dem. Också, eftersom glaset och PDMS är hydrofoba, inte vätskor inte lätt in i apparaten gör det nödvändigt ibland för att tvinga media och andra reagenser i enheten. Vätskor kommer in i enheten via kapillärkraften, men det tar betydligt längre jämfört med enheter som har plasma limmas. Plasma renare skapar temporära hydrofila avgifter på glaset och enhet som underlättar flödet av vätskor genom enheten efter limning inom några sekunder. För icke-plasma bundet enheter, tar vätskeflödet genom de anordningar flera minuter. Det är också viktigt att notera att de enheter som skall användas med icke-plasma limning måste steriliseras först, medan plasma behandlade enheter inte behöver steriliseras före användning eftersom plasma renare kommer att sterilisera dem.

Protocol

Förbereda mikroflödessystem enheter för Neuron Cell Culture

1) Rengör Corning No.1 24 mm x 40 mm glasskivor

• Sonikera glaset glider i ett vattenbad sonicator i 30 minuter
• Skölj objektglas med 70% EtOH
• Tvätta diabilder tre gånger med dH ₂ O
• Torka objektglasen i en vävnadsodling huva i flera timmar, gärna över natten

OBS: Vi har speciell metall brickor som vi last med bilderna. Bilderna är separerade individuellt och placeras i spår i denna metall rack. Vi kan då placera dessa brickor av metall lastning i en glasskål som vi fyller med vatten, lägg i vattenbadet sonicator och Sonikera i 30 minuter. Efterföljande tvättar utförs i denna maträtt.

2) Förberedelse av PDMS-enheter

• Klipp ut PDMS mögel från kiselskiva, stansa hål i PDSM rösterna kvartalet
• Rengör PDMS-enheter genom att först blåsa inert gas (argon eller kvävgas) över dem. Använd sedan 3M Scotch Brand 471 tejp för att lyfta bort eventuell kvarvarande skräp

OBS: Det är viktigt att hålla enheter uppåt. Inledningsvis när vi sänkte PDMS bort från kiselskiva, är sidan i kontakt med rånet den rena sidan: den innehåller mikroflödessystem kanaler. Vi försöker att vara så försiktiga vi kan inte skada enheten och hålla rena sidan uppåt tills vi är redo för plasma bindning.

• Autoklav enheter i plastbehållare
• Efter autoklavering, ren Nr 1 Corning Glass diabilder och plasma-treat enheter med en Harrick renare varumärke plasma, www.harrickplasma.com
• Placera enheterna rena nedåt på glaset bilden.

Enheten är nu plasma bundet till objektglas.

3) Beläggning Enheter med Poly L-lysin (PLL)

• PLL läggs till en bra bit på vardera sidan av enheten och tillåtas att flöda genom till nästa väl

=> 150 l av PLL för de stora brunnarna och 30 μ l PLL för de mindre brunnar. Det behöver inte vara exakt så länge brunnarna är fulla.

OBS: Om du tittar på en enhet ser du 4 brunnar: varje två är anslutna. Du vill sätta PLL i en väl så att det kommer att flöda genom enheten i nästa väl.

• Låt PLL att flödet genom enheten i ca 10 minuter och sedan lägga till fler PLL till brunnarna för att fylla upp dem
• Placera produkter som innehåller PLL i en inkubator vid 37 ° C i minst 4 timmar (över natten är att föredra)
• Dammsug ut överflödigt PLL efter behandlingen, men var noga med att inte suga all vätska ur enheten

Observera: Du vill inte införa luftbubblor till kanaler eller kammaren. Bara vakuum ut överflödigt PLL i brunnarna.

• Lägg autoklaveras dH ₂ O i varje brunn på vardera sidan av enheten och låt den strömma till andra bra genom kapillärkraft

Figur 1 är ett diagram över en mikroflödessystem enhet. Lägg märke till hur den blåa (Soma sida) är ansluten och den röda (axonal sidan) är anslutna. När vi säger sätter PLL, eller vatten eller media, en bra bit på vardera sidan av enheten, vad vi menar, till exempel: Placera 150 ul av autoklaveras dH ₂ O i en blå Nåväl plats 150 ìl autoklaveras dH ₂ 0 i en röd Well. Det vatten (eller PLL, eller Media eller celler) kommer att flöda genom enheten till andra motsvarande väl.

Figur 1

Obs: Observera att från och med nu, när jag säger "plats medier, celler, vatten eller PLL i TOP brunnar", jag hänvisar till diagrammet ovan där Soma skulle vara till vänster och axoner kommer att växa till rätt.

• Sug av vattnet (igen försiktigt så att inte helt ta bort all vätska från enheten), sedan lägga till ytterligare 150 ìl autoklaveras dH ₂ O till en av varje ansluten väl och låt den flöda genom till motsvarande väl.
• Placera enheten innehåller dH ₂ O i en inkubator vid 37 ° C i 1 timme, upprepa sedan tvätta steg igen. Tvätta enheter tre gånger med dH ₂ O i en timme vardera, vilket är den totala.

OBS: På grund av möjligheten att borat från PLL kan ta in i PDMS, några i Jeon Lab rekommenderar inkubering av enheter över natten med autoklaveras dH ₂ O efter ett par initial snabb sköljningar. Detta kommer att säkerställa att alla fria borat kommer att läcka ut från PDMS före lastning av celler. Om detta inte görs kan det finnas ett utsläpp av borat i media över tid, vilket kan leda till cytotoxicitet.

• Lägg Neural Basal Media (NBM) med nödvändiga faktorer (glutamax, B27, PenStrep) till toppen brunnar

OBS: enheterna kan inkuberas över natten och klädd med celler nästa dag, eller inkuberas minst 3 timmar med NMB + faktorer innan bordläggning cellerna.

Förbereda nervceller för påfyllning av Enheter

Vi använder 18 dagar gamla foster råtta cortex att vi antingen köper från ett företag som heter Brain bitar som är beredd här på campus för oss. Vi föredrar att få vävnaden fräsch.

1. Skaffa ett foster hjärnbarken (2 stycken av vävnad) lagras i Hibernate E
2. Ta 3 långa glas pipetter och eld dem varje i successivt mindre storlekar med en alkohol-lampa
3. bort vävnad från viloläge E med ett glas pipett och lägg i 2 ml NMB + Faktorer i ett sterilt 15 ml rör.
4. Trituration: Med hjälp av en glödlampa och glaspipett cortex förs upp och ner cirka 5 till 10 gånger. Sedan är nästa mindre pipett som används för att pipettera upp och ned i vävnaden. Slutligen är det minsta pipett som används för att pipettera upp och ned i vävnaden. Vi vill se till att det inte finns några synliga bitar.
   
   Obs: Nyligen började Jeon Lab jämföra celler från vävnad lagras i Hibernate E till celler som var beredda från vävnad från början behandlades med 0,125% Trypsin i 50% Ca + + gratis och Mg + + gratis dissektion buffert. Enighet råder om att vävnad prepareras med trypsin ger mer livskraftiga celler än vävnad placeras först i Hibernate E. Om du INTE ska använda vävnaden direkt, måste du lagra vävnad i Hibernate E.
   
   Om du ska använda vävnaden direkt och vill öka lönsamheten, då behandla vävnaden med Trypsin före mekanisk trituration som följande: 1) Späd 1 ml 0,25% Trypsin (Gibco, Invitrogen) med 1 ml av Ca + + gratis Mg + + gratis dissektion buffert (sista Trypsin = 0,125%) i ett 15 ml rör (hålla iskallt), 2) plats vävnad i buffert och inkubera omedelbart vid 37 ° C i 8 minuter, 3) tillsätt 10 ml DMEM/10% FBS att stoppa Trypsin reaktion och fortsätter protokoll nedan.
   
   
5. Centrifugera cellerna vid 1100 rpm i 1 minut
6. Aspireras medier försiktigt bort cellpelleten
7. Tillsätt 1 ml NMB + faktorer till pelleten och resuspenderas det genom att pipettera upp och ned
8. Passera resuspenderas celler genom självfall genom ett filter för att ta bort klumpar (BD Falcon cell sil 40 um nylon)
9. Räkna och celler skylt:
   • I ett mikrofugrör, tillsätt 60 l NMB + faktorer, 20 l cellsuspension och 20 l trypan blå och blanda sedan
   • Tillsätt ca 10 l av denna lösning till en hemocytometer och räkna levande celler (inte blå)
   • Justera koncentrationen till 2,5 till 4,5 x10 ⁶ celler / ml
     
     Observera: Vi brukar få en koncentration av ca 2,5 till 4,5 x 106 celler / ml. beroende på volymen cellerna är suspenderade i (normalt 1 ml NBM + B27/Glutamax/PenStrep percortex). Om vävnaden var beredd med trypsin, kommer avkastningen sannolikt ökas.

Plating Enheter

1. Lastceller (primära neuroner) i en brunn av enheten
2. Plate 5 l per liten enhet och 20 l per stor enhet
   
   Notera: Du kan ladda 10 ìl av celler på toppen av enheten och 10 l på undersidan av enheten (halv totala volymen), eller direkt alla 20 ìl av celler i övre somal bra (5 l i topp somal väl för små enheter).
   
   
3. Inkubera i 10 minuter i en 37 ° C inkubator så cellerna kan börja att fästa
4. Tillsätt ungefär 150/30 ìl NMB + faktorer i varje brunn beroende på enhetens storlek
   
   Anm: Volymerna kan variera beroende på tjockleken på PDMS. Allt som räknas är att brunnarna är fulla.

Kompletterande Använda den enheter utan Plasma Bonding

Utan plasma-behandling, säger Christina Tu, en tekniker, som gör det med framgång varje vecka utan plasma för att bara ladda cellerna direkt.

Kom ihåg att ta bort media från båda brunnarna på Soma sidan (axonet sida ingen roll om du lämnar media i). Det är vätskeflödet som gör att cellerna att gå in i kanalen. Om du har media i brunnar, kommer du inte få strömning.

Discussion

Här har vi visat hur du använder neuron mikroflödessystem enhet utan att behöva en plasma renare. Vi kallar detta för icke-plasma bindning.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Reagent	Dow Corning		Sylgard 184 with curing agent Please consult Dow Corning to find a vendor near you
Cornig No. 1 Cover Glass	Cover Glass	Corning	Corning No. X2935 244	Available through Fisher Scientific, Fish Catalog number 12-531D
B27	Reagent	Invitrogen	17504-044	B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
Glutamax	Reagent	Invitrogen	35050-061	Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents.
60 mm Petri Dish	Tool	Fisher Scientific	08-757-13A	60 mm polystyrene sterile petri dishes are used to house the device bound to glass.
Poly-L-Lysine	Reagent	Sigma-Aldrich	P-1274
BD Falcon 50 ml Tube	Tool	BD Biosciences	Falcon No. 352098	Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-49A
BD Falcon 15 ml tube	Tool	BD Biosciences	Falcon No. 352097	Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C