Summary
I macrofagi hanno un ruolo centrale nella omeostasi e patologia in molti tessuti. Il protocollo presentato qui descrive i metodi per esaurire i macrofagi
Abstract
I macrofagi hanno un ruolo critico nella risposta immunitaria innata alla sfida infettiva o lesioni, iniziando la risposta immunitaria innata e dirigere la risposta immunitaria acquisita. Macrofagi disfunzione può comportare l'impossibilità di montare una risposta immunitaria appropriata e, come tale, è stata implicata in molti processi patologici, quali le malattie infiammatorie intestinali. I macrofagi visualizzare fenotipi polarizzati che sono approssimativamente suddivise in due categorie. Classicamente macrofagi attivati, attivato dalla stimolazione con LPS o IFNy, svolgono un ruolo essenziale nella risposta alla sfida batterica che macrofagi attivati alternativamente, attivato da IL-4 o IL-13, partecipare detriti scavenging e rimodellamento tissutale e sono stati implicati nella risoluzione fase di infiammazione. Durante una risposta infiammatoria in vivo, i macrofagi si trovano in mezzo a una miscela complessa di infiltrare cellule del sistema immunitario e possono partecipare mediante l'esasperazione o resolving infiammazione. Per definire il ruolo di macrofagi in situ in un modello animale intero, è necessario esaminare l'effetto di esaurire macrofagi dall'ambiente complesso. Per porre domande circa il ruolo del fenotipo dei macrofagi in situ, fenotipicamente definite macrofagi polarizzati, può essere derivata ex vivo, da aspirati di midollo osseo e aggiunto nuovamente ai topi, con o senza previa deplezione dei macrofagi. Nel protocollo qui presentata clodronato liposomi contenenti, rispetto ai controlli iniettati PBS, sono stati utilizzati per esaurire macrofagi colon durante destrano solfato sodico (DSS)-colite indotta nei topi. Inoltre, macrofagi polarizzati sono stati ottenuti ex vivo e trasferito topi mediante iniezione endovenosa. Un avvertimento di questo approccio è che clodronato contenenti liposomi esaurire tutte le fagociti professionali, comprese sia le cellule dendritiche ei macrofagi in modo da garantire l'effetto osservato da deplezione dei macrofagi è specifico, la ricostituzione of fenotipo mediante trasferimento adottivo di macrofagi è necessario. Deplezione macrofagi nei topi possono anche essere ottenuto topi reincrocio su un CD11b-DTR fondo, che è un ottimo approccio complementare. Il vantaggio di clodronato contenente mediata da liposomi esaurimento è che non richiede il tempo ei costi legati in topi reincrocio e può essere utilizzato in topi indipendentemente dal fondo dei topi C57BL / 6, BALB / c, o sfondo mista ).
Protocol
1. I macrofagi riducono Utilizzo clodronato contenenti liposomi
- I liposomi vengono conservati a 4 ° C. Due ore prima dell'iniezione, rimuovere clodronato contenenti liposomi, PBS contenenti liposomi, o PBS sterile (iniezione controllo) dal frigorifero per consentire loro di la temperatura ambiente (18 ° C).
- Invertire le provette contenenti liposomi 8-10 volte per assicurare una distribuzione uniforme prima di caricare 200 pl in una siringa da 1 ml. Attaccare a 26 gauge all'inizio della siringa.
- Utilizzando la sinistra, nuca del mouse appena sotto le orecchie in possesso di pelle abbastanza per immobilizzare la testa e gli arti.
- Inclinare il mouse modo che la sua testa è leggermente verso il suolo in modo organi interni allontanarsi dal sito di iniezione, che si trova nel quadrante inferiore destro dell'addome.
- Arrotolare la siringa tra i palmi delle mani e capovolgere 6 volte per distribuire uniformemente la soluzione di liposomi prima dell'iniezione. <li> Inserire l'ago nella parte in basso a destra dell'addome del mouse ad un angolo di 30-40 gradi. Iniettare 200 pl di soluzione di liposomi o PBS.
- Nel corso di un modello sperimentale di infiammazione indotta, come la colite indotta da DSS, iniettare topi 4 giorni prima della comparsa di infiammazione sperimentale per garantire la deplezione dei macrofagi residenti e ogni 2 giorni durante il protocollo di esaurire nuovi macrofagi infiltranti.
- Alla fine dell'esperimento, insieme con previste analisi sperimentali, rimuovere i tessuti dal sito di interesse e fissare con paraformaldeide per confermare esaurimento macrofagi con colorazione immunoistochimica.
2. Derivazione dei macrofagi polarizzati da aspirati di midollo osseo
- Il midollo osseo di topi tra gli 8 e 12 settimane di età fornisce il più alto rendimento di midollo osseo macrofagi. Euthanize il mouse, si trovava sulla sua schiena, e definire con precisione le sue zampe, che si estende gli arti, per quanto possibile.
- Lavorare in uno sterile hood, rimuovere femore e tibia, tagliando via come muscolo più possibile.
- Midollo filo da ossa utilizzando IMDM con 10% FCS caricato in una siringa da 5 ml dotato di un ago calibro 26.
- Diluire midollo osseo aspira a 40 ml in IMDM con 10% FCS, cellule posto in un centimetro 75 2 pallone di coltura tissutale, e incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per 4 ore. Questo passaggio rimuove aderenti cellule mesenchimali o macrofagi maturi da progenitori ematopoietici.
- Trasferire il surnatante di coltura contenente non aderenti progenitori ad un tubo da 50 ml conica Falcon e centrifugare per 5 min a 1200 rpm.
- Risospendere il pellet cellulare in 5 ml di IMDM, 10% FCS e contare le cellule nucleate diluendo sospensione cellulare 1 a 20 in acido acetico. Questa procedura lisa tutte le cellule, comprese le cellule rosse del sangue e dei nuclei restante può essere contato su un emocitometro.
- Risospendere le cellule ad una concentrazione di 0,5 x 10 6 cellule / ml in mezzo completo; IMDM, 10% FCS, 150 monotioglicerolo pM (MTG), e 10 ng / ml o di MCSF, GM-CSF o IL-3. MCSF derivati da macrofagi attivati sono classicamente macrofagi, mentre i macrofagi GM-CSF o IL-3-derivati sono attivati alternativamente.
- Sostituire media al giorno 4, riducendo la velocità cellule non aderenti e restituirli al pallone, e al 7 ° giorno, scartando cellule non aderenti.
- Inoltre, IFNy (10 ng / ml) o IL-4 (10 ng / ml) può essere aggiunto a fiasche contenenti MCSF cellule derivate al giorno 7 di macrofagi un'inclinazione a un classico attivato o un fenotipo alternativa attivato, rispettivamente. Incubare le cellule per altri 3 giorni.
- Al giorno 10, rimuovere i supporti e sollevare le cellule fuori del pallone di coltura tissutale con dissociazione cellulare Buffer (Gibco-BRL). Porre 5 ml di tampone sulle cellule per 5 min a temperatura ambiente (18 ° C) e poi battere il lato del pallone con il tallone del palmo della mano più volte fino. Assicurarsi che le cellule hanno sollevato del pallone esaminando il pallone sottomicroscopio. Pipettare risospese le cellule in una provetta da 15 ml Falcon e lavare il pallone con un ulteriore 10 ml di IMDM, 10% FBS. Pool e far girare le cellule per 5 min a 300 × g.
- Contare le cellule vitali utilizzando un emocitometro e risospendere ad una concentrazione di 10 7 cellule / ml in PBS sterile pH 7,4. I macrofagi sono pronti per l'iniezione in topi.
- Riserva 1.0 × 10 6 macrofagi per la valutazione del fenotipo dei macrofagi. Classicamente macrofagi attivati stimolati con lipopolisaccaridi secernono livelli elevati di ossido nitrico e dei livelli di IL-12p70 e bassi livelli di IL-10 rispetto ai macrofagi attivati alternativamente. In alternativa macrofagi attivati esprimono costitutivamente YM1 e arginasi I (Argi), che può essere rilevato da Western immunoblotting.
3. Tranferring macrofagi in topi
- Macrofagi Risospendere in PBS sterile a una concentrazione di 10 7 cellule / ml. Ciò permette una intravenous iniezione di 10 6 macrofagi in un volume totale di 100 pl, che è un volume che può essere sicurezza e comodità iniettate in topi dalla vena caudale.
- Topi calda usando una piastra elettrica o di calore giro per 5-10 min per dilatare la vena della coda. Monitorare il mouse in qualsiasi momento per i segni di ipertermia.
- Trasferire il mouse per un apparecchio di contenzione che permette l'accesso alle vene della coda.
- Ruotare la coda di 90 ° in modo che la vena è rivolta verso l'alto. Vene eseguire lateralmente su entrambi i lati della coda e sia vena può essere utilizzato.
- Pulire il sito di iniezione con un tampone imbevuto di alcol e lentamente iniettare 100 microlitri (10 6 macrofagi) con una siringa da 1 ml con un ago calibro 26 o 28. Inserire l'ago con il lato smusso rivolto verso l'alto e con una leggera angolazione, quasi parallela alla vena.
- Se l'ago è inserito correttamente non resistenza dovrebbe essere sentito e la vena dovrebbe essere chiaro dopo l'iniezione. Se l'ago non è nellavena, la coda si rigonfiamento. In questo caso, rimuovere l'ago e riprovare prossimale l'ultimo tentativo o in altra vena. Un nuovo ago deve essere utilizzato per ogni iniezione, come la coda è dura e gli aghi diventare opachi rapidamente durante l'iniezione coda vena.
- Dopo l'iniezione, rimuovere l'ago, applicare una leggera pressione sul sito dell'iniezione, fino a quando il sanguinamento si arresta, e controllare il mouse di un ulteriore 5 minuti per garantire che il sanguinamento si è fermato.
- Ripetere le iniezioni macrofagi ogni 4 giorni per garantire una erogazione continua di macrofagi polarizzati durante la procedura sperimentale.
- Alla fine dell'esperimento, insieme con analisi sperimentali, rimuovere i tessuti dal sito di interesse e fissare con paraformaldeide o formalina per confermare la consegna efficace di macrofagi polarizzati mediante colorazione immunoistochimica.
4. Risultati rappresentativi
Il numero e fenotipo di macrop residentehages in ogni dato tessuto dipende dal tessuto in esame e cambierà durante l'infezione o infiammazione. Analogamente, la capacità di clodronato liposomi contenenti da esaurire macrofagi da un tessuto dipenderà dalla via di somministrazione e consegna efficace al tessuto bersaglio. Iniezione intraperitoneale di clodronato contenenti risultati liposomi in una diminuzione F4/80 + macrofagi nel colon mouse durante DSS-colite indotta evidenti dalla colorazione immunoistochimica per il marcatore macrofagi, F4/80 (Figura 1A). Colorazione istologica può anche essere usato per determinare differenze quantitative numero macrofagi e fenotipo in sezioni di tessuto. Figura 1B mostra che una media del 55% dei macrofagi è impoverito dalla clodronato liposomi contenenti rispetto al non deplezione rilevato in due punti topo quando i topi sono iniettati con PBS da solo come un controllo dell'iniezione. Ogni valore è determinato dal conteggio F4/80 e Argi macchiaEd cellule positive in sezioni di tessuto seriali topi da 6 a 3 punti, in 3 sezioni per il mouse con il conteggio viene effettuato da due individui ciechi alle condizioni sperimentali. Questi risultati dimostrano che iniezioni intraperitoneali di liposomi clodronato riducono macrofagi colon nei topi.
Determinazione dei macrofagi da midollo osseo in presenza di diversi fattori di crescita rese macrofagi che sono classicamente attivati (MCSF-derivato o MCSF-derivati e trattati con IFNy) o in alternativa attivato (GM-CSF o IL-3-derivato o MCSF-derivati e trattati con IL-4). Flushing midollo osseo da 2 femore e tibia 2 da un mouse 8 settimane vecchia produce tipicamente 6 × 10 7 cellule nucleate per il mouse e le rese 8 × 10 6 MCSF derivate dai macrofagi, 10 × 10 6 GM-CSF-derivate dai macrofagi, o 12 × 10 6 IL-3-macrofagi derivati. Figura 2A mostra nitrito e il rapporto IL-12p70/IL-10 in macrofagi supernatants trattati con lipopolisaccaride per 24 ore 2B La figura mostra una tipica analisi Western blot di 0,5 × 10 6 macrofagi da MCSF + / -. IL-4 condizioni di derivazione sondato con gli anticorpi per marcatori macrofagi attivati, in alternativa, Argi, i YM1, o con GAPDH come carico di controllo. Questi dati dimostrano che dal midollo osseo macrofagi può essere inclinato ad un fenotipo polarizzato durante la derivazione.
Efficace trasferimento di ex vivo macrofagi derivati polarizzate ad un tessuto dipende dalla via di somministrazione e l'accesso al tessuto. Durante DSS-indotta colite, macrofagi iniettato per via endovenosa recarsi nel sito di infiammazione e macrofagi alternativamente attivati ridurre la gravità della malattia. Figura 3A mostra il numero totale di macrofagi e il numero di macrofagi Argi + (in alternativa attivato) contate in sezioni istologiche da topi iniettati con polarizzata midollo osseo-Macrofagi derivati. L'impatto di trasferimento di macrofagi polarizzati al colon durante DSS-colite indotta è mostrato per indice di attività della malattia, un punteggio additivo basato sulla perdita di peso, emorragia rettale, e consistenza delle feci diminuita (Figura 3B). Questi risultati dimostrano che ex vivo derivato, macrofagi adoptively trasferiti può traffico al colon e infiammazione indotta impatto. Macrofagi M1 non influenzare l'infiammazione, mentre i macrofagi M2 ridurre in modo significativo Disease Activity Index.
Figura 1. Clodronato contenente liposomi in modo efficace e riducono F4/80 + F480 + + Argi cellule in due punti del mouse in vivo. Una generazione F2 di topi wild type su un C57BL misto / 6 × sfondo 129Sv è stata data al 5% DSS per 7 giorni e IP iniettato con PBS (controllo) o clodronato contenenti liposomi (clodronato) 4 giorni prima del DSS trattamentoe ai giorni 0, 2, 4 e 6 durante il trattamento DSS. (A) I due punti sono stati rimossi, fissi, e le sezioni sono state colorate da immunoistochimica per macrofagi maturi F4/80) e il marcatore dei macrofagi M2, Argi. (B) La determinazione quantitativa di F4/80 Argi + + e macrofagi. Cellule colorate positivamente sono stati contati da due persone in cieco per condizione sperimentale a 40 × ingrandimento in 6 campi da 3 sezioni / mouse e da 6 topi / gruppo. * P <0,01.
Figura 2. MCSF-macrofagi derivati esprimere un fenotipo classicamente attivato e MCSF derivati macrofagi trattati con IL-4 esprimere un fenotipo macrofagi attivati alternativamente. (A) In accordo con un fenotipo classicamente attivato, MCSF derivati macrofagi producono alti livelli di ossido nitrico in risposta al lipopolisaccaride e può essere misurata con il test Griess, che rileva il suo metabolita valle, nitrito. Essi alsO produrrà un rapporto IL-12p70/IL-10, che può essere misurata mediante ELISA. * P <0,01 per n = 3. (B) In accordo con un fenotipo alternativamente attivato, MCSF derivati macrofagi trattati con IL-4 esprimono costitutivamente YM1 e Argi, che può essere rilevato dal immunoblotting occidentale. I dati sono rappresentativi di 3 esperimenti indipendenti con risultati simili.
Figura 3. Iniettato per via endovenosa, ex-vivo derivato in alternativa il traffico macrofagi attivati al colon e ridurre l'infiammazione intestinale. Una generazione F2 di topi wild type su un C57BL misto / 6 × 129Sv sfondo sono stati dati 5% nel DSS l'acqua da bere per sei giorni. Macrofagi M1 e M2 sono state iniettate ev ai giorni 0 e 4 durante il trattamento DSS. (A) I due punti sono stati rimossi, fissi, e le sezioni sono state colorate da immunoistochimica per macrofagi maturi F4/80) e un indicatore dei macrofagi M2 (Argi).La quantificazione dei macrofagi per il controllo PBS topi iniettati (C), topi iniettati con macrofagi M1 (+ M1) e topi iniettati con macrofagi M2 + M2) sono stati eseguiti da conteggio delle cellule colorate positivamente a 40 × ingrandimento in 6 campi da 3 sezioni / del mouse e da 6 topi / gruppo. Il conteggio è stato eseguito da due individui ciechi alla condizione sperimentale. (B) L'attività della malattia è stata monitorata e ha segnato tutti i giorni durante il trattamento ed è un punteggio additivo a base di perdita di peso, sanguinamento rettale, e la consistenza delle feci è diminuito. * P <0,05 per n = 6 topi in 2 esperimenti indipendenti.
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Discussion
I macrofagi sono cellule fagocitiche che svolgono un ruolo importante nel sistema immunitario. Essi sono responsabili per l'avvio della risposta immunitaria innata e dirigere la risposta immunitaria acquisita. Tipicamente, macrofagi attivati classicamente vengono attivati da IFNy o LPS e sono responsabili per eliminare patogeni e montare una risposta infiammatoria 1. Viceversa, in alternativa macrofagi attivati sono attivati da IL-4 o IL-13 e gioca un ruolo in detriti di lavaggio e rimodellamento del tessuto durante la risoluzione di infiammazione 1. Macrofagi specializzati nell'intestino conservano la loro attività battericida, ma non montare un pro-infiammatoria 2 risposta. Questa tolleranza alla flora ed alla antigene alimentare permette di liquidazione di materiale che supera la barriera epiteliale senza avviare una risposta inappropriata e potenzialmente patologica immunitario 3. Aberrante funzione dei macrofagi del colon può contribuirea condizioni patologiche tra cui malattie infiammatorie croniche intestinali, sindrome del colon irritabile, e il cancro colorettale 3-5. Fenotipo dei macrofagi dipende dal microambiente locale in modo da definire il loro ruolo nella salute o la malattia può essere impegnativo. Il protocollo qui descritto consente di esaurimento macrofago dal complesso ambiente in vivo. In aggiunta, per esaminare il ruolo di fenotipo macrofagi in situ, fenotipicamente definite macrofagi polarizzate possono essere derivati ex vivo da aspirati di midollo osseo e adoptively trasferiti topi, con o senza preventiva deplezione di macrofagi.
Clodronato liposomi contenenti promuovere macrofagi "suicidio" e sono stati utilizzati per esaurire macrofagi in una varietà di tessuti 6. Macrofagi fagocitare clodronato contenenti liposomi, che sono successivamente degradata dalla fosfolipasi lisosomiali rilasciando il clodronato nella cella 12 e apoptosi 12. I liposomi devono essere distribuiti uniformemente in soluzione prima di caricare nella siringa e prima dell'iniezione nel topo, indipendentemente dalla via di somministrazione o tessuto bersaglio. PBS iniezioni e iniezione di PBS contenenti liposomi sono necessari controlli quando riducono macrofagi in vivo con clodronato liposomi contenenti 7. PBS-liposomi contenenti sembrerebbe essere un controllo migliore di PBS da solo iniezioni. Tuttavia, è importante notare che mentre alcuni rapporti hanno utilizzato PBS contenenti liposomi come un controllo, noi, ed altri, hanno riferito che PBS contenenti liposomi possono esaurire macrofagi in alcune condizioni sperimentali 8, 9. Inoltre, solo liposomi sono stati riportati per inibire temporaneamente fagocitosi 10. Esaurimento macrofagi da PBS liposomi contenenti può dipendere pcapacità hagocytic e possono variare a seconda ceppo di topi, background genetico, il tessuto, e / o condizione sperimentale. L'uso di PBS contenenti liposomi come controllo e il loro effetto sulla riduzione di macrofagi in un'applicazione specifica deve essere determinato sperimentalmente. Pertanto, si consiglia di liposomi sia PBS e PBS contenente essere utilizzati come controlli di iniezione durante gli esperimenti iniziali.
Una considerazione importante nella progettazione esperimenti deplezione macrofagi è la via di somministrazione di clodronato liposomi contenenti. Abbiamo di mira con successo macrofagi del colon nei topi utilizzando iniezione intraperitoneale 8. Altri hanno usato somministrazione intrarettale o endovenosa iniezioni 9, 11. Somministrazione intrarettale e intraperitoneale entrambi sono stati segnalati per esaurire circa il 50% dei macrofagi colon che l'iniezione endovenosa è stato riportato che riducono fino al 90% dei macrofagi dalla laminapropria 8, 9, 11. Abbiamo scelto di effettuare iniezioni intraperitoneali per fornire liposomi grazie alla semplicità della tecnica contenenti clodronato e perché simili ai nostri studi hanno utilizzato questa via di somministrazione 7. Tuttavia, se livelli più elevati di esaurimento nel colon sono necessari per un esperimento, iniezione endovenosa può migliorare esaurimento.
Via di somministrazione è una considerazione importante per deplezione dei macrofagi in diversi tessuti. Iniezioni intraperitoneali sono stati utilizzati per esaurire peritoneale, omento, linfonodi parathymic, fegato e macrofagi splenici 12. Iniezioni endovenose sono stati utilizzati per esaurire macrofagi nel fegato, milza, midollo osseo e 12. Somministrazione intraventricolare di clodronato contenenti liposomi è stato usato per esaurire macrofagi perivascolari e meningeo dal cervelletto, cervello e il midollo spinale 12. Intratrachealee la somministrazione intranasale di clodronato contenenti liposomi sono stati utilizzati per esaurire macrofagi alveolari. Infine, l'amministrazione locale è stata utilizzata con successo per esaurire i macrofagi testicolari e vitreale 12, 13. L'efficacia della deplezione macrofagi in un tessuto bersaglio deve essere determinato sperimentalmente e convalidato da tessuti di colorazione immunoistochimica (Figura 1A) o mediante citometria di flusso. In alcuni casi può essere necessario aumentare il tasso di macrofagi esaurimento. Le variabili che possono essere ottimizzate per aumentare esaurimento comprendono la modifica il percorso di clodronato-liposomi contenenti somministrazione, la quantità di clodronato liposomi contenenti per iniezione e / o della frequenza di iniezione.
Una considerazione importante nella interpretazione dei dati quando si riducono i macrofagi con clodronato contenenti liposomi è che tutti i fagociti professionali sono esaurite, comprese le cellule dendritiche. Per garantire che unaeffetto biologico è macrofagi-dipendente, esperimenti di ricostituzione complementari sono obbligatori. Derivazione macrofagi da aspirati di midollo osseo è uno strumento utile per esperimenti di ricostituzione così come la funzione dei macrofagi di ricerca che indaga. Abbiamo usato con successo questo protocollo per studi in vitro esplorare il ruolo della via di segnalazione PI3K in alternativa l'attivazione dei macrofagi 14. Ci sono due fasi critiche del processo di derivazione. In primo luogo, l'impoverimento passo rispetto è fondamentale per rimuovere le cellule aderenti provenienti da aspirati di midollo osseo, o contaminando cellule mesenchimali adulte o cellule ematopoietiche. In secondo luogo, fenotipo dei macrofagi deve essere confermata prima del loro utilizzo nelle procedure sperimentali. Una modifica di questo protocollo è che diversi modelli genetici possono essere utilizzati per la derivazione macrofagi e ricostituzione, permettendo indagine del ruolo di geni specifici in fenotipo macrofagi e funzione in vitro unod in vivo. Per esperimenti di ricostituzione, iniezione endovenosa è il modo più comune di consegna macrofagi ma sia la quantità delle cellule e la frequenza di iniezione può essere ottimizzata per uno studio specifico. Retro-orbitale iniezioni possono essere utilizzati per la ricostituzione e dovrebbe fornire risultati simili. Da notare, macrofagi sono assunti per siti di infiammazione e loro fenotipo può essere modificata in risposta a segnali dal loro microambiente. Infine, il trasferimento adottivo può essere sufficiente per fornire macrofagi ad un tessuto bersaglio, ma prima di esaurimento macrofagi del tessuto residenti può essere necessario per consentire creazione di macrofagi adoptively trasferiti.
Il protocollo qui presentato ha un numero di vantaggi rispetto ai metodi esistenti. Un metodo alternativo per esaurire macrofagi è quello di utilizzare il condizionale topo transgenico ablazione, CD11b-DTR 15. In questo mouse, l'umano tossina difterica (DT) recettore viene espresso sotto il controllo of il macrofago specifico promotore CD11b. Questo conferisce sensibilità tossina iniezione DT e causano una diminuzione macrofagi 15. Sebbene la deplezione macrofago percentuale è maggiore in questo modello, clodronato liposomi contenenti offre due importanti vantaggi. Clodronato contenente iniezione liposoma può essere utilizzato per esaurire macrofagi in qualsiasi ceppo di topo. I macrofagi possono essere impoverito da topi geneticamente modificati senza il tempo ei costi necessari per backcrossing che è necessario per utilizzare il CD11b-DTR metodo di mouse. Per la stessa ragione, macrofagi può essere svuotata da topi su qualsiasi fondo, che è una considerazione importante se il modello indagato richiede un unico sfondo o mista. Analogamente, gli esperimenti di trasferimento adottivo utilizzando ex vivo macrofagi derivati da una linea di topi evita problemi con alloreattività.
I protocolli descritti qui può essere applicato ad una varietà di domande di ricerca. Abbiamo usato thEse tecniche per studiare il ruolo dei macrofagi nel processo infiammatorio nel colon. Clodronato contenente mediata da liposomi deplezione macrofagi e trasferimento adottivo di macrofagi può essere usato per indirizzare un grande numero di tessuti. Macrofagi trasferimento adottivo può essere utilizzato per ricostruire impoverito macrofagi o macrofagi diretti ai siti di infiammazione in modelli genetici o inducibile di infiammazione. Questo protocollo fornisce anche una piattaforma per l'esame macrofagi terapie mirate in modelli di malattia in cui sono associate macrofagi o la loro polarizzazione con la patologia.
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Disclosures
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da un 'Grant in Aid di Ricerca' dal morbo di Crohn e Colite Foundation del Canada LMS, che è supportato da una Canadian Association of Gastroenterology / Canadian Association of Health s Research / Crohn 'e Colite Fondazione Premio Canada Investigator Nuovo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clodronate-containing liposomes | Clodronateliposomes.org | ||
| PBS-containing liposomes | Clodronateliposomes.org | ||
| Sterile PBS pH7.4 | Invitrogen | 14190 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Invitrogen | 12483 | |
| acetic acid | BDH Aristar | BDH3092-500MLP | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | 96-275 | |
| Recombinant murine MCSF | Stemcell Technologies | 02951 | |
| Recombinant murine GM-CSF | Stemcell Technologies | 02935 | |
| Recombinant murine IL-3 | Stemcell Technologies | 02903 | |
| Recombinant murine IFNγ | Stemcell Technologies | 02746 | |
| Recombinant murine IL-4 | Stemcell Technologies | 02714 | |
| Cell Dissociation Buffer | Invitrogen | 13150-016 | |
| Rat anti-F4/80 Antibody | AbD Serotec | MCA497GA | |
| Mouse anti-ArgI Antibody | BD Transduction Laboratories | 610708 | |
Table 1. Specific reagents used in this protocol. |
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References
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