Summary
De efficiënte solid-phase peptide synthese van een gefunctionaliseerde bis-peptide trimeer gebruik te maken van een "veiligheidspal" decollete procedure vanaf HMBA hars wordt beschreven.
Abstract
In 1962, RB Merrifield gepubliceerd eerste procedure met vaste-fase peptide synthese als nieuwe route efficiënt synthetiseren peptiden. Deze techniek bleek al snel voordelig ten opzichte van zijn oplossing-fase voorganger, zowel in tijd en arbeid. Verbeteringen met betrekking tot de aard van de vaste drager, de beschermende groepen gebruikt en de koppeling methoden die in de afgelopen vijf decennia alleen maar toegenomen het nut van de oorspronkelijke systeem Merrifield's. Vandaag de dag gebruik van een Boc-gebaseerde beveiligings-en basis / nucleofiel splitsbare hars strategie of Fmoc-gebaseerde beveiliging en zure splitsbare hars strategie, ontwikkeld door RC Sheppard, worden het meest gebruikt voor de synthese van peptiden 1.
Ingegeven door vaste gedragen strategie Merrifield, hebben wij een Boc / tert-butyl vaste-fase synthese strategie voor de montage van gefunctionaliseerde bis-peptiden 2, die hierin wordt beschreven. Het gebruik van vaste-fase synthese opzichte to oplossing fase methode is niet alleen gunstig in tijd en arbeid als beschreven door Merrifield een, maar kan ook gemakkelijker in de synthese van bis-peptide libraries. De synthese die we tonen hier is uitgerust met een decollete laatste stadium dat gebruik maakt van een twee-stap "veiligheidspal" mechanisme om de gefunctionaliseerde bis-peptide vrij te maken uit de hars door diketopiperazine formatie.
Bis-peptiden stijve spiro-ladder oligomeren van bis-aminozuren die in staat functionaliteit positioneren in een voorspelbare en ontwerpbaar wijze bestuurd door het type en stereochemie van de monomere eenheden en de verbinding tussen elk monomeer. Elke bis-aminozuur is een stereochemisch zuiver cyclische steiger die twee aminozuren (een carbonzuur met een α-amine) 3,4 bevat. Ons laboratorium onderzoekt momenteel de mogelijkheden van functionele bis-peptiden in een breed scala van gebieden zoals katalyse, eiwit-eiwit interacties en nanomaterials.
Protocol
1. Setup
- De reactie opstelling voor de vaste-fase synthese is een polypropyleen filterpatroon of glazen reactor die via polypropeen buis verbonden met een gesloten kolf onder vacuum filter zoals in figuur 1. De reactie kan worden gemengd met een magnetische roerstaaf of door stikstof door de reactor.
- Een gas verdeelstuk is aangesloten op een Argon cilinder met een droogbuis en olie opvangvat wordt aanbevolen omdat hiermee het reactievat te worden opgenomen in een inerte atmosfeer en kan de verwijdering van reagentia uit gesloten containers.
- Alle handelingen worden uitgevoerd in een zuurkast en de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (veiligheidsbril, labjas en nitril handschoenen) is vereist.
2. Laden Eerste Bis-Peptide Onto Resin
- Weeg 114 mg van HMBA-AM Resin (0,88 mmol / g laden, 100 mol) in 8 ml reactievat en voeg magnetische roerstaaf. Cap boven the vat met een rubber septum en zuivering van de buis met argon tenminste 5 minuten.
- Intussen gewicht 117,3 mg verbinding 1 van figuur 3 (586,63 g / mol, 2eq) en 59,2 mg 1 - (mesityleen-2-sulfonyl)-3-nitro-1 ,2,4-triazool (MSNT, 296,0 g / mol, 2eq) in een 15 ml centrifugebuis wegwerp en oplossen in 2 ml watervrij dichloormethaan (DCM). Voeg 24 ul van 1-methylimidazool (NMI, 80,81 ml / mol, 3EQ) een oplossing, en roer tot volledig opgelost.
- Breng de geactiveerde oplossing van het reactievat via een injectiespuit en laat roeren onder argon nacht (~ 10 uur).
- Verwijder het septum en laat het reactiemengsel. Was de hars met DCM (5x) en dimethylformamide (DMF) (5x). Voer de "methylrood test" beschreven in paragraaf 10.1 tot en met de mate van hars belasting te beoordelen. Als de hars op rood blijft staan tijdens de methylrood-test vervolgens de stappen 2.2 en 2.3 moet worden herhaald. Een gele kleur, hetgeen wijst op een negatieve methylrood test de voorkeur;kan echter omdat de resterende hydroxylgroepen wordt begrensd in de volgende stap wordt een licht positief resultaat (lichtoranje kleur hars) aanvaardbaar.
3. Verwijdering van de bescherming van de Eerste Bis-peptide en Gelijktijdige Resin Plafonnering
- Voeg 1 ml DCM het reactievat dan 1 ml 33% waterstofbromide in azijnzuur druppelsgewijs gedurende 30 seconden (borrelen plaatsvindt) en laat roer 15 minuten. Giet ze af en was de hars met DCM (5x) en herhaal nog een keer te verwerken.
- Was de hars met DCM (5x) dan DMF (5x). Neutraliseren hars door tweemaal wassen met 5% v / v oplossing van N, N-diisopropylethylamine (DIPEA) in DMF daarna wassen met DCM (5x) en DMF (5x) weer. Voer de "methylrood test" en "chloranil test" besproken in paragraaf 10.1 en 10.2. Resultaten moeten negatief zijn voor de methylrood-test en positief voor de chloranil test.
4. Koppeling Boc / tBu-Beschermd Gefunctionaliseerde Bis-Amino zuur
- Opnieuw een inerte atmosfeer aan de hars-bevattende reactievat door driemaal wassen met watervrij DCM sluit vervolgens een septum en argon lijn. Spoel en was het schip door het toevoegen van 1-2 ml watervrij DCM en te laten roer gedurende 30 seconden en het aftappen van het schip tot aan de argon lijn bubbler begint te stijgen. Doe dit minstens een keer meer.
- Een oplossing van 0,15 M gefunctionaliseerde bis-aminozuur (3EQ) en 245 mg 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAT, 136,11 g / mol, 18eq) in 2 ml 2:1 DCM: DMF in een vlam gedroogd proef buis onder argon atmosfeer. Voeg 47 ul van diisopropylcarbodiimide (DIC, 156,6 ml / mol, 3EQ) en schud gedurende 90 minuten.
- Voeg 35 ul DIPEA (174,19 ml / mol, 2eq) in 666 ul watervrije DMF de hars en laat roeren gedurende 5 minuten.
- Breng de vooraf geactiveerde bis-aminozuur oplossing reactievat via een injectiespuit en laat een nacht roeren.
- Giet het reactiemengsel en tweemaal spoelen met watervrij DCM terwijl onder argon.
- Om de afsluiting van de diketopiperazine bevorderen toevoegen 0,25 M oplossing van HOAT (136,11 g / mol, 10eq) en DIC (156,6 ml / mol, 10eq) in 4 mL van 1:1 DCM: DMF en laat roeren onder argon gedurende 1 uur.
- Verwijder het septum en laat het reactiemengsel. Was de hars met DCM (5x) en DMF (5x). Indien gewenst, voert u de "chloranil test" besproken in paragraaf 10.2.
5. Verwijdering van de bescherming van Boc / tBu-Beschermd Gefunctionaliseerde Bis-Amino Acid
- Voeg 2 ml van een oplossing van 95:5 trifluororacetic zuur (TFA) triisopropylsilaan (TIPS) aan het reactievat en laat roeren gedurende 1 uur. Giet ze af en was de hars voor ongeveer 30 seconden met DCM (5x) en herhaal proces nog een keer.
- Was de hars met DCM (5x) dan DMF (5x). Neutraliseren hars door tweemaal wassen met 5% v / v oplossing in DMF DIPEA daarna wassen DCM (5x) en DMF (5x) weer. Indien gewenst, voert u de "chloranil test" besproken in paragraaf 10.2.
7. Functionaliseren de Bis-Peptide Prolidine End
- De prolidine einde van de groeiende bis-peptide kunnen onafhankelijk van elkaar kunnen worden geacyleerd door een diketopiperazine. Ook kan daartoe worden gelaten beschermd, dat deze worden gesplitst, bieden het vrije aminozuur. Indien gewenst, voert u de "chloranil test" besproken in de paragrafen 10.2 en koppeling efficiëntie te beoordelen.
8. Verwijdering van de bescherming van Fmoc en acylering van het Kwartair Einde van de Bis-Peptide
- Een 2 ml oplossing van 20% piperidine in DMF toegevoegd en de reactie gedurende 20 minuten gemengd. Giet ze af en was de hars met DMF (5x) en herhaal proces nog een keer.
- Was de hars met DCM (5x) dan DMF (5x).
- Bereid een 0,15 M oplossing van aminozuur (3EQ) in 2 ml N-methylpyrrolidon (NMP) bij 114 mg 2 - (7-aza-1H-benzotriazool-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorfosfaat (HATU, 380,2 g / mol, 3EQ) en 104,5 ul DIPEA (174,19 ml / mol, 6eq) en goed mengen. Toevoegen reactievat en laat roeren gedurende 6 uur.
- Was de hars met DCM (5x) dan DMF (5x).
9. Verwijder de BOC Group van de hars Bound Amino Acid en Cleave van Resin
- Voeg 2 ml van een 1:1 TFA: DCM oplossing van het reactievat mogelijk roeren gedurende 30 minuten. Giet ze af en was de hars met DCM (5x) en herhaal nog een keer te verwerken.
- Was en laat de hars gedurende 30 seconden met DCM (5x) en vervolgens DMF (5x).
- Voeg 2 ml van een oplossing van 10% DIPEA in watervrije DMF en laat 24-48 uur roeren.
- Verzamelen reactiemengsel in voorgewogen rondbodemkolf. Overdracht 30 pi van deze oplossing tot 450 ul van THF in een LC-MS flacon dienen voor analyse. Was de hars met extra porties van DMF en verzamelen in de rondbodemkolf dan oplosmiddel te verwijderen in vacuüm.
10. Zuivering van Bis-Peptide
- Los ruwe bis-peptide in een minimale hoeveelheid dimethyl sulfoxide (100-250 pi) en overdracht HPLC flacon inzetstuk. Plaats het inzetstuk in het autosampler van semi-prepitive HPLC-systeem (Hewlett Packard 1100 serie) uitgerust met een XTerra Prep MS C18 5 micrometer 7.8x150 mm kolom en een 100 ul injectie lus.
- Voer meerdere injecties 50 ul van het monster met een gradiënt programma van 5-95% acetonitril in water met 0,1% mierezuur 30 minuten terwijl de controle bij 274 nm. Verzamel het product piek in een vooraf gewogen wegwerp centrifugebuis en vries droog met een vriesdroger. Voorzichtigheid moet worden genomen met de eerste run als een lichte verschuiving van de piek-retentietijd in vergelijking met analytische LCMS wordt meestal waargenomen.
11. Assessment Methods
- METHYLROOD TEST 7: Verwijder ~ 1 mg droge hars via disposable pipet en spoel ze in 4 ml reactievat. Voeg een oplossing van 20 mg methyl rood, 50 ul N, N'-diisopropylcarbodiimide (DIC) en 5 mg 4-dimethylaminopyridine (DMAP) in 500 pi watervrij DCM en laat roeren gedurende 5-10 minuten. Giet af en was hars met DCM totdat het filtraat kleurloos is. Positieve indicatie is de hars kralen resterende oranje of rood.
- Chloranil TEST 12: Transfer ~ 1 mg droge hars in een kleine flacon via disposable pipet. 3 druppels van zowel 0,8 mM chloranil in DMF oplossing en 2% aceetaldehyde in DMF oplossing laten staan bij kamertemperatuur gedurende 5-10 minuten. Positieve indicatie is de hars kralen draaien blauw / paars.
- ACTIVERING TRAP TEST: Actieve verbindingen tijdens de synthese kan worden beoordeeld door de overdracht van een kleine hoeveelheid (5-10 pi) van de geactiveerde oplossing voor een vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) flacon met 50 ul van pyrrolidine. Meng met de hand voor een paar seconden (solutiop zou moeten worden geel) verdun vervolgens met 450 ul van tetrahydrofuran (THF) en in te dienen voor LC-MS-analyse.
- ANALYTISCH LC-MS: Het uiteindelijke product en geactiveerde tussenproducten kunnen worden beoordeeld met behulp van een HP 1200 serie LC-MS-systeem uitgerust met een Waters Xterra MS C18 3,5 micrometer 4,6 mm x 150 mm kolom en een gradiënt systeem van 5-95% acetonitril in water met 0,1% mierenzuur gedurende 30 minuten.
12. Representatieve resultaten
Een voorbeeld van zowel ruwe (figuur 4) en gezuiverd (figuur 5) LCMS sporen zijn aangebracht. Gezuiverd opbrengst van ongeveer 10% verwacht volgens de methoden zoals hierboven beschreven.
Figuur 1. Schema van experimentele set-up voor vaste-fase synthese.
Figuur 2.Relevante nomenclatuur van de Bis-aminozuren / Bis-peptiden.
Figuur 3. Algemene synthetische Scheme. Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 4a. HPLC-Trace van het ruwe product op 274 nm.
Figuur 4b. MS spectrum van ruwe product Peak.
Figuur 5a. HPLC-Trace van de gezuiverde product op 274 nm.
Figuur 5b. MS Spectrum van gezuiverd Product Peak.
Discussion
De synthetische benadering die hierin in een werkwijze voor de synthese van gefunctionaliseerde bis-peptiden van bis-aminozuur bouwstenen gebruikelijke vaste-fase peptide synthese technieken. Het monomeer synthese van deze "Pro4" bouwstenen van trans-4-hydroxyproline 3 is zeer schaalbaar en is met succes afgerond aan de hydantoïne stadium bij een 600 mmol (234 g) schaal (niet gepubliceerd). Zodra de monomeren in de hand, het gebruik van vaste-fase techniek geeft een snellere methode bis-peptidesynthese dan de huidige oplossing fase methode 4 door overbodig reactie werk-ups en tussenliggende reinigingen.
De primaire uitdaging vaste-fase synthese diagnose synthetische vooruitgang en oplossen aangezien geen tussenproducten worden geïsoleerd. Dit heeft geleid tot de ontwikkeling van vele colorimetrische testen waaronder die dat aangeeft of gratis amines (Kaiser Test 10) of gratis hydroxYLS (Methyl Red Test 7) worden blootgesteld op de hars. Helaas is de gebruikte Kaiser Test 10 niet algemeen toepasbaar in vaste-fase synthese door de vrijwel uitsluitend gebruik van secundaire aminen of aminen aan een quaternair koolstof. Andere opties voor beoordeling op HMBA hars onder andere breuklijnen-test met behulp van een nucleofiel, zoals hydrazine 11, kwantitatieve Fmoc decollete gecontroleerd door UV / Vis 1,11, en vangen en analyseren van binnenkomende geactiveerd verbindingen.
Een ander over het hoofd gezien probleem in vaste-fase synthese is het repetitieve karakter van synthetische stappen die nodig zijn door de operator. Met dit in het achterhoofd, de auteurs raden het gebruik van een spreadsheet of een checklist bij het uitvoeren van handmatige vaste-fase peptide synthese.
De moeilijkheid met in bis-peptiden voor vaste-fase synthese opzichte gemeenschappelijke α-aminozuren bevat de mogelijke moeilijker koppelingen door sterische hindrance, de behoefte aan on-hars diketopiperazine sluitingen, en gelijktijdige deprotections (Boc / tBu; Cbz / tBu). Een andere moeilijkheid ligt in het bereiken van kwantitatieve vrijlating uit de hars met behulp van deze "veiligheidspal" methode in vergelijking met meer conventionele middelen. Met deze factoren in het achterhoofd, is het heel goed mogelijk dat een verdere optimalisatie van deze methode kan worden bereikt en de huidige inspanningen zijn aan de gang in onze groep om de methode hier gepresenteerde verbeteren.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Dr Zachary Z. Brown en Jennifer Alleva bedanken voor de initiële ontwikkeling van deze vaste fase synthese techniek en Matthew FL Parker voor nuttige discussies. Dit werk wordt ondersteund door de Defense Threat Reduction Agency (DOD-DTRA) (HDTRA1-09-1-0009) en de Horst Witzel Fellowship Award wordt ondersteund door Cephalon, Inc
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HMBA-Am Resin | Novabiochem, EMD Millipore | 855018 | |
| MSNT | Novabiochem, EMD Millipore | 851011 | |
| NMI | Sigma-Aldrich | 336092 | Toxic, Corrosive |
| DCM | Sigma-Aldrich | D65100 | Carcinogenic |
| Anhydrous DCM | Acros Organics | 34846 | Carcinogenic |
| 33% Hydrogen Bromide in Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 248630 | Toxic, Corrosive, Fumes when open |
| DIPEA | Sigma-Aldrich | 387649 | Flammable, Toxic, Corrosive |
| DMF | Fisher Scientific | AC27960 | Flammable, Toxic |
| Anhydrous DMF | Acros Organics | 34843 | Flammable, Toxic |
| HOAt | GenScript | C01568 | |
| DIC | Acros Organics | BP590 | Flammable, Toxic, Corrosive |
| TFA | Sigma-Aldrich | T6508 | Toxic, Corrosive |
| TIPS | Acros Organics | 21492 | Flammable, Toxic |
| Piperidine | Sigma-Aldrich | 104094 | Flammable, Toxic, Corrosive |
| HATU | GenScript | C01566 | Toxic |
| NMP | Acros Organics | 36438 | Toxic |
| DMAP | Novabiochem, EMD Millipore | 851055 | Toxic |
| Methyl Red | Sigma-Aldrich | 250198 | |
| THF | Sigma-Aldrich | 401757 | Flammable, Toxic, Peroxide Forming |
| Pyrrolidine | Sigma-Aldrich | P73803 | Flammable, Toxic, Corrosive |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | D1281 | |
| SPPS Reaction Vessels | Grace | 211108 | |
| LCMS | Agilent Technologies | 1200 Series | |
| Semi-Prep LC | Hewlett-Packard | 1100 Series | |
| Lyophilizer | Labconco Corp. | 7934027 | |
| Rotovapor | Buchi | R-210 Series | |
| Argon | Airgas | AR PP300CT |
References
- Atherton, E., Sheppard, R. C. Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. , Oxford University Press. (1989).
- Brown, Z. Z., Alleva, J., Schafmeister, C. E.
- Schafmeister, C. E., Brown, Z. Z., Gupta, S.
- Brown, Z. Z., Schafmeister, C. E. Synthesis of Hexa- and Pentasubstituted Diketopiperazines from Sterically Hindered Amino Acids. Org. Let. 12, 1436-1439 (2010).
- Nielson, J., Lyngso, L. O. Combinatorial Solid-Phase Synthesis of Balanol Analogues. Tet. Lett. 37, 8439-8442 (1996).
- Blankemeyer-Menge, B., Nimtz, M., Frank, R. An Efficient Method for Anchoring Fmoc-Amino Acids to Hydroxyl-Functionalized Solid Supports. Tet. Lett. 31, 1701-1704 (1990).
- Komba, S., Sasaki, S., Machida, S. A New Colorimetric Test for Detection of Hydroxyl Groups in Solid-Phase Synthesis. Tet. Lett. 48, 2075-2078 (2007).
- Demner, O., Dijkgraaf, I., Schottelius, M., Wester, H. J., Kessler, H. Introduction of Functional Groups into Peptides via N-Alkylation. Org. Lett. 10, 2015-2018 (2008).
- Plas, S. E. V. ander, Van Hoeck, E., Lynen, F., Sandra, P., Madder, A. Toward a New SPE Material for EDCs: Fully Automated Synthesis of a Library of Tripodal Receptors Followed by Fast Screening by Affinity LC. Eur. J. Org. Chem. 11, 1796-1805 (2009).
- Kaiser, E., Colescot, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. Color Test for Detection of Free Terminal Amino Groups in Solid-Phase Synthesis of Peptides. Anal. Biochem. 34, 595-598 (1970).
- Chan, W. C., White, P. D. Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. , Oxford University Press. (2000).
- Vojkovsky, T. Detection of Secondary Amines on Solid-Phase. Peptide Research. 71, 236-237 (1995).
