Summary
העיצוב של קידוד סינטטי אופרון גם מנגנון ההפרשה ומונומרים המבניים של סיבי curli מתואר. ייצור יתר של amyloids אלה ופולימרי חסיד מאפשר מדידת רווח של היצמדות של
Abstract
השיטה המתוארת כאן מורכבת בעיצוב מחדש של ה תכונות היצמדות coli על ידי הרכבת המספר המינימאלי של גני curli תחת השליטה של אמרגן חזק והמתכת overinducible, ובהדמית וכימות הרווח כתוצאה של דבקות בקטריאלי. שיטה זו חלה עקרונות הנדסיים מתאימים של הפשטה ותקינה של ביולוגיה סינטתית, ותוצאות בBBa_K540000 Biobrick (המכשיר הכי חדש Biobrick, הנדסה, iGEM 2011).
הצעד הראשון מורכב בעיצוב של אופרון הסינטטי מוקדש לייצור יתר curli בתגובה למתכת, ולכן בהגדלת יכולות ההיצמדות של הזן הפראי הסוג. המקורי curli אופרון שונה בסיליקון ועל מנת לייעל את אותות תעתיק וtranslational ולברוח רגולציה "הטבעית" של curli. גישה זו אפשרה לבדיקה בהצלחת ההבנה הנוכחית שלנו של ייצור curli. Moreover, לפשט את רגולצית curli ידי מעבר האמרגן המורכב אנדוגני (יותר מ 10 רגולטורי תעתיק מזוהה) לאמרגן פשוט מתכת מוסדרת גורם דבקות הרבה יותר קלה לשלוט.
השלב השני כולל הערכה איכותית וכמותית של יכולות דבקות על ידי יישום של שיטות פשוטות. שיטות אלו חלות על מגוון רחב של חיידקים חסידים ללא קשר למבנים ביולוגיים המעורבים בהיווצרות biofilm. מבחן דבקות בצלחות קלקר 24 גם מספק הדמיה ראשונית מהירה של biofilm החיידקים לאחר צביעה סגולה גביש. מבחן איכותי זה יכול להיות מחודד על ידי הכימות של אחוז הדבקות. שיטה כזאת היא מאוד פשוטה אך מדויקת יותר מכתים סגולה גביש רק כפי שתואר לעיל 1 עם שתי דירות ושחזור טובים. ויזואליזציה של חיידקי ה-GFP-tagged על שקופיות זכוכית על ידי קרינה או conf הליזרמיקרוסקופיה ocal מאפשרת לחזק את התוצאות שהתקבלו במבחן הצלחת 24 היטב על ידי תצפית ישירה של התופעה.
Introduction
היצמדות חיידקים לתמיכת אביוטי ממלא תפקיד מרכזי בתאי דלק bioremediation, biocatalysis או חיידקים. תהליכי bioremediation להשתמש ביכולות של מיקרואורגניזמים לבזות חומרים אורגניים, או כדי לשנות את חלוקת המתכת (קיבוע, volatilization) או התפצלות. פעילויות מועילות אלו שנצפו במערכות אקולוגיות ימיות ויבשתיות, אלא גם במערכות המלאכותיות שפותחו לטיפול במים מזוהמים בפסולת תעשייתית וביתית. העצמה והאיכות של פעילות החיידקים תלויים בגורמים הפיסיקליים כימיים, אלא גם על אורח החיים של מיקרואורגניזמים (חסר בסיס או מוטבע לתוך biofilm). היווצרות biofilm קשורה חילוף חומרי קידום התנגדות לביוצידים ידי מנגנונים מגוונים. תופעה זו לכן יש לעודד ברוב תהליכי bioremediation. יתר על כן, תאי coli Escherichia הנדסה לשלוט על היווצרות biofilm כבר מיושמים בהצלחהחיישנים לשתק כל התאים בbiochips 2-3.
הסתגלות של מיקרואורגניזמים לריכוז גבוה של מתכות מתרחשת באמצעות מנגנונים מגוונים כגון ספיחה למרכיבים תאיים מטריקס, הפעלת משאבת זרימה או לספקים מסוגלים להתרכז המתכת לתוך התא. גברת פעילות חיידקים אלה באמצעות הנדסה גנטית מאפשרת טיפול יעיל וזול של זיהום מתכות בקנה מידת המעבדה, במיוחד במקרה של מתכות רעילות ביותר בכמות חלשה כפי שתואר על ידי הראגו et al. 2008 4. תיקון חיידקים מייצג במקרה זה שיטת חיסכון תחרותית ועלות בהשוואה לתהליכים כימיים קלסיים באמצעות רפי חילוף יונים. החוקרים תארו א מארז coli מהונדס גנטי לספיגה ואצירה 1 קובלט יפרוץ את זרימת משאבת הקידוד הגנטי rcnA, ולאחר מכן על ידי שינוי עם עותק רב המאפשרים ייצור יתר של פלסמידטרנספורטר עם ספיגה מועדפת לקובלט. כזה מתח מופיע כחלופה יעילה לרפי חילוף יונים לטיפול בשפכים רדיואקטיביים, אך בעיה לא נפתרה מפתח היא ההתאוששות של חיידקים מזוהמים בסופו של התהליך 4. המטרה של העבודה שלנו הייתה אפוא מהנדסת זן מותאם אישית מעוצב תוכל להיצמד לתומך אביוטי כגון זכוכית או פלסטיק.
בין המערך השלם של adhesins ונמצא מולת חסיד זיהתה בחיידקי גראם, בחרו לעצב מערכת המאפשרת ייצור curli. Curli הם סיבי עמילואיד דקים (2-5 קוטר ננומטר) ומדדים המאוד שבולט מE. חיידק סלמונלה ופני שטח כמטריצת גבישים שאינם מסיסה ו5-7. Curli מעורב גם בקולוניזציה של משטחי אביוטי והפיתוח של biofilms 8. Curli הוצגו לאחרונה לאגד כספיים יונים 9. Amyloids ידוע אכן להחזיק גבוהזיקה ליוני מתכות כגון Cu 2 +, Zn 2 + ו 3 + 10 פה. מאפיין זה עשוי לשפר עוד יותר את הטיהור של שפכים מזוהמים מתכת. אשכול CSG אחראי לייצור של סיבי curli והוא מכונן בשתי operons divergently תעתיקים (איור 1). CsgB, גני csgC csgA ומהווים אופרון התחושה, קידוד שתי יחידות curli, CsgA וCsgB. CsgC נראה שמעורב בפעילות חיזור בתוך מערכת biogenesis curli ולהשפיע על התנהגות CsgG נקבובית 11. עם זאת, היעדר csgC ברוב המכריע של חיידקי curli לייצור מצביע על כך שהחלבון המקביל מספק רק רמת secundary שליטת biogenesis curli. כדי לפשט את המערכת, אנחנו כבר בחרנו לעבוד עם המספר המינימאלי של גנים.
CsgDEFG operonencodes חלבונים חיוניים בוויסות והתחבורהשל CsgA וCsgB על פני התא. CsgD הוא activator תעתיק של אופרון csgBAC וממלא תפקיד מרכזי בשליטה על היווצרות biofilm על ידי שליטה על הייצור של רכיבים ונמצא מולת curli biofilm אחרים כגון 12 תאיים ועל ידי דיכוי ייצור השוטון 13. CsgE, CsgF וCsgG מהווים מנגנון הפרשה curli ספציפי ב- הקרום החיצוני שדרכו החלבון העיקרי CsgA מקטע curli מופרש כחלבון מסיס. פילמור של CsgA תלוי in vivo על nucleator חלבון CsgB קרום הנכנס (שנסקר ב14). מסלולים רגולטוריים שונים הכוללים מספר מערכות שני מרכיבים הוכחו לשלוט ביטוי curli גן 15-16. תקנות מורכבות אלה מאפשרות לחיידקי טופס biofilms העבה באמצעות ייצור curli בתגובה לאותות סביבתיים, אך קשים לשלוט עבור יישומים תעשייתיים. כדי להקל על ההתאוששות נפגשהאל ממולא חיידקים בתהליך תעשייתי, קיבוע חיידקים לתמיכה מוצקה אכן צריך להיות מבוקר על ידי פרמטר מוגדר היטב (הים). המאפיינים החסידים של curli צמודים ל17 טבע עמילואיד ויכולים לשמש כדי לשפר את תהליכי bioremediation, אבל מכשיר פשוט ובקלות מבוקר יש ליצור.
בין 7 גנים 18 אלה, קבוצה של 5 גנים נדרשת לcurli סינתזה (csgB ומונומרים סיבי קידוד csgA) ויצוא (csgE csgF וcsgG, קידוד מורכב הפרשת curli) בהחלט נבחרו לבנות אופרון הסינטטי. כדי להימלט מהרגולציה "הטבעית" של curli, אופרון סינטטי הכולל 5 גני CSG אלה תחת השליטה של אמרגן חזק וoverinducible קובלט (איור 2) תוכנן ומסונתז. ניתוח שלב אחר השלב באזור curli הקידוד ועיצוב ההליך לsyn פונקציונליהאוהד אופרון מתואר. שתי שיטות כדי לחזות ולכמת היצמדות חיידקים לקלקר וזכוכית מוסברות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. עיצוב וסינתזה של Biobrick Curli אופרון
- לקבוע את הארגון הגנטי ולמקם את אותות התעתיק וtranslational אנדוגני של גני curli. ידיעות אלו נאספים במאגרי מידע מיוחדים כגון RegulonDB או EcoGene ב והשלימו על ידי קריאה מדוקדקת של פרסומים הנוגעים לעניין. ניהול נתונים ובpreanalysis סיליקו בוצע עם תוכנת מנהל המשובטים ג.
- בחר את רצפי קידוד הרלוונטיים. סט של חמישה גנים דרושים לחלוטין לcurli סינתזה (csgB ומונומרים סיבי קידוד csgA) ויצוא (csgE csgF וcsgG, קידוד מורכב ההפרשה התעגלה) נבחרו לבנות אופרון הסינטטי. חלץ את הרצפים שנבחרו ממאגר המידע בפורמט FASTA.
כצביר csgGFE הוא antisense בE. גנום חיידק, להמיר את הרצף הזה לcounterp המשלים ההפוךאמנות באמצעות כלי תפעול המנהל המשובט> מולקולת תהליך> הפוך מולקולה. הדבק את רצף csgEFG מאחורי csgBA באמצעות הפונקציה "לקשור" (Clone> לקשור). - הוסף האמרגן המתאים. על ידי צבת חמישה גני curli הנבחרים תחת שליטה של אמרגן P RCN, curli הם חזו להיות מיוצר מעל בנוכחותו של קובלט וניקל. RCN הלוקוס מקודד משאבה אחראית לסילוק הרעלים וניקל Co (rcnA) ורגולטור metallo מאותו המקור שלה (rcnR) זרימה. RcnR שולט ביטוי של rcnA וגן משלו בתגובה לניקל ולשיתוף 19. רצף RCN כולל CDS rcnR, כל אזור intergenic RCN בתוספת 41 נוקלאוטידים הראשונים של rcnA היה מול placedin של הרצף המתעתע csgBAEFG (1 איור, הרצף של כל המבנה מסופק כנתונים משלימים).
- לייעל את התעתיקאותות. אתר קישור הריבוזום מושלם (או RBS המושלם = AAGGAGGTATATA) נוסף בחזית ATG הראשון של רצף ה-DNA csgBA. RBS מושלם שני נוסף לפני רצף csgEFG. RBS אנדוגני לcsgB וגני csgF וcsgG היו נשמר.
- כדי להתאים סטנדרטי iGEM, המכשיר חייב להיות מוקף בקידומת BioBrick סטנדרטית וסיומת, המכיל אתרי הגבלה לRI אקו, PST I (קידומת) וSPE אני וXba (סיומת). הדבק את הרצפים המתאימים בכל קצה של ד המכשיר.
- לחסל כל RI אקו, PST, אני SPE ואתר ההכרה Xba במכשיר. כדי להקל על תהליך הרכבה נוסף, חלק BioBrick עצמו לא יכול להכיל כל ההגבלה של אתרים אלה. בניתוח הגבלת סיליקו של המכשיר מתגלה 1 Pst אני אתר ברצף csgA, אתר ש1 Pst ברצף rcnRואתר אחד Eco RI בגן csgE. אתרים אלה ממוקמים בהתאמה בעמדה 80 (Mut1), 1340 (Mut2) ו -1830 (Mut3) של רצף ההתקנים (נתונים משלימים) ושונו כפי בצע על ידי מוטציות שקטות.
אתר Mut1 Pst אני CTGCAG השתנה בCGTCTG
אתר Mut2 Pst אני CTGCAG השתנה בCAGCAG
GAATTC Mut3 Eco RI האתר השתנה בGAATT - הפעלה באמצעות סימולצית התרגום באמצעות תוכנת Clone Manager (המבצע> מולקולות תהליך> מולקולות תרגמו). השתמש יפציץ תכנית יישור הרצף כדי לוודא הומולוגיה המושלמת בין החלבון פרא סוג curli והחלבונים המקודדים על ידי אופרון הסינטטי.
- הזמן את אופרון הסינטטי. שירותי סינתזת גנים מסחריים זמינים מחברות רבות ברחבי העולם, השותף שלנו היה Genecust (לוקסמבורג). 4 מיקרוגרם של אופרון המלאכותי (3165 נ"ב) התקבל כעבור כמה שבועות ונוספים לpUC57 (pIG2).
2. המחש ולכמת חיידקי חסיד על פוליסטירן
- ממלא כל היטב של צלחת קלקר 24 היטב עם 2 מ"ל של מדיום מינימאלי M63 (0.2% גלוקוז) ולחסן כל באר עם 106 תאים של תרבות לילה. חיידקים לגדול ב 30 מעלות צלזיוס במשך שעה 18-48 בלי לרעוד. כל עמודה (4 בארות) מייצגת אופנות. הוסף את הכמות הנכונה של קובלט (לפני 25 עד 100 מ"מימ) ואנטיביוטיקה (אמפיצילין 100 μg.L -1) בעת צורך. את 3 השורות הראשונות של הצלחת 24 גם משמשות כדי לכמת את החיידקים חסידים על ידי חישוב ממוצע 3 חזרות, משמאל השורה האחרון משמש כדי להמחיש את biofilm.
- עבור 3 השורות הראשונות של הצלחת 24 היטב: לכל באר, לשחזר את supernatant המכיל את תאי פלנקטון.
- זהירות לשטוף היטב עם כל 1 מ"ל של M63 וברכה לשטוף 1 מ"ל עם supernatant הראשוני שהתקבל ב2.2). ברכה זו מכונית תאים שחייה (= S).
- שחזר biofilm במיליליטר o 1ו M63 על ידי הגירוד וpipetting למעלה ולמטה (= B). מערבולת 15 שניות. להעריך את מספר החיידקים מצורפים משטח ושחייה מהצפיפות האופטית ב 600 ננומטר (OD600) לתת את אחוז ההיענות המתאים לכל ערוץ.
- אחוז ההיענות מחושב על ידי שימוש בנוסחא: Bx100 / (3xS + B).
- רק לשורה האחרונה של הצלחת 24 היטב: למחוק תאי פלנקטון.
- לשטוף עם 1 מ"ל של M63 biofilm שהתפתח בתחתית הצלחת.
- ייבש את הצלחת הפתוחה לשעה 1 ב 80 ° C.
- הוסף 100 μl של 20% סגולים גביש עבור 2 דקות בכל אחד ואחרי כן על ידי שטיפות ענפות עם מים כדי להמחיש את חיידקי קרקע מצורפות.
שלושה מבחנים עצמאיים (צלחות) יש לבצע כדי להבטיח שחזור.
3. דמיינו חיידקים חסידים על ידי זכוכית מיקרוסקופית
- קבל מארז ניאון. ה זן דואר coli SCC1 שconstitutively מבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ללא הבדל נצפה מזן ההורה MG1655 20 הוא מארח מתאים לנושא פלסמיד הסינטטי curli אופרון.
- להפוך SCC1 עם pIG2 פלסמיד (= הסינטטי curli אופרון מוכנס בRI אקו / Pst אני אתר של pUC57 פלסמיד) כדי להשיג את מתח S23. להפוך SCC1 עם שליטת פלסמיד (pUC18) כדי להשיג את לחץ שליטת S24 21.
- לגדול precultures הלילה של S23 ושל השליטה (S24) בזני 30 ° C בM63 בינוני בתוספת סוכר (0.2%) ואמפיצילין (100 μg.L -1).
- לחסן 15 מ"ל של אותו המדיום בצלחות פטרי עם 100 μl של precultures. הוסף את הריכוז המתאים של קובלט (25 מיקרומטר כלומר) ואל תשכח את השליטה השלילית ללא קובלט. להציג את coverslip זכוכית מלבנית 3 בכל צלחת פטרי. דגירת הלילה בשעת 30 ° C בלי לרעוד.
- הסר את coverslip הלוך ושובמ 'צלחת הפטר ולנקז אותו בזהירות. זהירות לנקות את פניו הנמוכות יותר עם דברים קטנים כותנה ספוגות אתנול ° 70 על ידי ניגוב כל שאריות חיידקים. לתצפית confocal, לנקות את שני קצוות העליונים בכמה מילימטרים כדי לאפשר קיבוע נוסף של coverslip.
- חיידקי חסיד ניתן דמיינו ישירות אלא במהירות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אבל בזהירות למנוע ייבוש של המדגם.
- לתצפית confocal, להפקיד את coverslip בשקופית זכוכית עם הפנים העליונים מכוסים על ידי biofilm להציב את הפנים. אז biofilm מכוסה coverslip גדול יותר, שהוא קבוע לשקופית הזכוכית בלכה. הפוך את ההתקנה כך שbiofilm עכשיו יהיה בחלק התחתונה של פן.
- הנח את ההתקנה מתחת למיקרוסקופ הליזר confocal. Axioplan2 LSM510 מיקרוסקופ ליזר ימין (Zeiss) confocal שמש באותה הפלטפורמה F Platim.
- הגדרה. GFP Excite ב488 ננומטר, ולאסוף את קרינת החיידקים בטווח 500-600 ננומטר . השתמש מטרת טבילת שמן 40X לרכישת תמונות בסריקת ליזר מצב confocal. סרוק את המבנים הכוללים תלת הממדיים של biofilms ממשטח המוצק לממשק עם מדיום הגידול, תוך שימוש בשלב של 1 מיקרומטר.
- ביצוע תחזיות תלת ממדיות עם Imaris תוכנה (Bitplane, ציריך, שוויץ). לקבוע את עובי biofilm על ידי הניתוח של ערך z הממוצע לאורך חלקים אורכיים סטטיסטיים. כימות של biovolumes biofilm ניתן לחלץ מן confocal Z-ערימות כמתוארות במקום אחר 22.
RegulonDB מספק מידע על ארגון המכניסטי אופרון ופירוקם ליחידות שעתוק, יזמים וסוג סיגמא, גנים והאתרים המחייבים הריבוזום, מחסלים, אתרים מחייבים של רגולטורי תעתיק ספציפיים, כמו גם הארגון שלהם לביטויים רגולטוריים.et = "_blank"> http://regulondb.cs.purdue.edu/index.jsp
ב מסד נתוני EcoGene מכיל מידע עדכן אודות ה coli K-12 ורצפי הגנום Proteome, כולל ביבליוגרפיות גנים נרחבות. מוקד EcoGene גדול כבר ההערכה מחדש של אתרי התחלת תרגום. Http://ecogene.org/
ג http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm
ד http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix
מתנת דואר של צ'ון צ'או Sze, נאן יאנג אוניברסיטה הטכנית, סינגפור.
ו Platim המיקרוסקופי פלטפורמה UMS3444 BioSciences Gerland - Lyon Sud.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בביאור סיליקו של רצף CSG הסוג הפראי של א ' coli K12 קשור עם אופטימיזציה של אותות תעתיק וtranslational אפשר לעצב היחיד הסינטטי curli אופרון P RCN-CSG מוצג באיור 3 (רצף מלא בנתונים משלימים). פרוטוקול 2 ו 3 פרוטוקול שמשו כדי להמחיש ולכמת דבקות ייצור הקשורים לcurli. שימוש מכתים קריסטל סגול על צלחות קלקר 24 גם (פרוטוקול 2) היווצרות biofilm בתחתית כל באר יכול להיות דמיין במהירות ונראה שסוג הזן הפראי הוא פחות חסיד מהזן המהונדס כפי שמוצג על ידי ההבדל בעוצמת צבע סגולה (איור 4 א). גישה איכותית זו מתחזקת למדידת כמותית אשר מגלה כי אחוז ההיענות הוא גבוה פי 1.5 בזן המהונדס (איור 4 ב). יתר על כן, רמת דיוק של quantita גישת tive מאפשרת מדידה של חיזוק משמעותי של דבקות בנוכחות של ריכוז גדל והולך של קובלט. ואכן, בתקשורת עם ריכוזי קובלט של 0 מיקרומטר, 25 או 50 מיקרומטר מיקרומטר, אחוזי תאי חסיד להגיע 25%, 30% ו 40%, בהתאמה (איור 4 ב). יכולות הדבקות גם ניתן להשוות באמצעות מיקרוסקופ עם חיידקי ה-GFP-tagged גדלו על שקופיות זכוכית. תצפיות מיקרוסקופיות (חיידקי Epifluorescence ירוקים על רקע שחור) מגלות כי הזן המהונדס יוצר כמה שכבות מצטברת גדולות נחשב biofilm אילו סוג הזן הפראי יוצר מייקר מושבות בלבד (איור 5). ניתוח מיקרוסקופיה confocal מספק ראייה כוללת של מבנה biofilm תלת ממדים ומאשר כי הזן המהונדס הוא יותר חסיד, ויצר צפופים ועבה יותר biofilm (איור 6).
4176fig1.jpg "alt =" איור 1 "/>
איור 1. מערכת Curli פרועת סוג. curli עשויה משני מונומרים המקודדים על ידי הגנים וcsgB csgA. הודות לפפטיד האות שלהם, מונומרים CsgB curli CsgA וtranslocated פני קרום cytoplasmic באמצעות מערכת Sec. מכונות ספציפיות המורכבות של 3 מרכיבים עיקריים, כלומר CsgE, CsgF וCsgG מאפשרות טרנסלוקציה של מונומרים curli על פני הקרום החיצוני.
איור 2. חזק וקובלט מושרה-אמרגן (BBa_K540001). אמרגן P rcnA נשלט על ידי RcnR מדכא השעתוק. גן rcnR עבד מאמרגן אנדוגני P rcnR, divergently מP rcnA. הנוכחות של גן rcnR מבטיחה יחס נכון של עותקים לעומת מדכאי P rcnA רגולציהאזור. בהעדרו של קובלט, RcnR נקשר לתיבת RcnR על ה-DNA ומונע את הפעלת תעתיק המלאה של הגנים במורד הזרם. אם הריכוז התאי של עליות קובלט, עקידת קובלט לחלבון RcnR מונעת קיבעון של repressor לאמרגן ופעילות התעתיק של עליות PrcnA 19.
איור 3. אופרון curli הסינטטי. גני Curli מונחים תחת השליטה של P rcnA. גן rcnR הביע מהאמרגן שלו אמור לספק מספיק מדכא כדי לשלוט על הביטוי של גני curli באופן תלוי קובלט. כדי להימנע מפקק התנועה periplasmic בשל ייצור יתר curli מונומר (CsgB וCsgA), רכיבים של מנגנון ההפרשה הספציפית curli (CsgE, CsgF וCsgG) צריכים להיות overproduced מדי. אותות traductional מוספים הם ב dicated באפור (RBS = המושלם RBS). E = RI אקו X = Xba אני S = SPH אני P = Pst I. חלק סינטטי זה מכונה Bba_K540000 מאפשר הזן המהונדס הפך לחסיד לזכוכית, חול או פלסטיק באמצעות ייצור יתר curli.
איור 4. ויזואליזציה וכימות של חיידקי החסיד על צלחת קלקר 24 כן. biofilm המוכתם הסגול קריסטל א נוצר על ידי חיידקי חסיד בקלקר. האחוז ב 'של דבקות בקלקר מהסוג הפרוע והזנים המהונדסים בעלי ריכוזים שונים של קובלט. הבדלים סטטיסטיים בין טיפולים מצוינים עם אותיות קטנות (ניתוח של בדיקת ההבדל המשמעותית לפחות של פישר שונות ו, P <0.05).
76/4176fig5.jpg "alt =" איור 5 "/>
איור 5. תמונות מיקרוסקופיה Epifluorescence של GFP-tagged חיידקים בשקופיות זכוכית. חיידקי חסיד הן ירוקות על רקע שחור. חיצים מצביעים על microcolonies.
איור 6. מיקרוסקופים confocal סייע שחזורים תלת ממדיים של מבנה biofilm בשקופיות זכוכית: א עמוד הצג שחזורי לוואי שחזורי נוף B..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שלבים קריטיים
השלב הקריטי ביותר בגישת הביולוגיה הסינטתית הזה הוא עיצוב הגן. עיצוב גן סינטטי יש להקפיד על מנת להבטיח ייצור מערכת יעילה. שני גנים המקודדים את מונומרים סיבים ושלושה גני מקודדי חלבונים מעורבים במערכת ההפרשה שלהם כבר התאסף עם אמרגן חזק ומתכת מושרה כדי ליצור יחידה חדשה פונקציונלית ליישום רומן: ביו טיהור שפכים גרעיניים. כמתוכנן וחזוי, מכשיר זה גורם לייצור מוגבר גבוה curli, שמתחזק על ידי הגדלת כמות של קובלט במדיום. כך תוצאות הצלחה מנוכחותם של שני האותות המתאימים התעתיק באמרגן שנבחר (P rcnA), ואת אותות translational היעילים הוסיפו בחזית של כל סט של גני curli (csgBA וcsgEFG) (ראה איור 3). בנוסף, כאשר עובדים עם, תשומת לב multicopy פלסמיד יש לשלם למספר העותק של הרגולטור (הים) המעורב בשליטת היזם. כאן, multicopies של RcnR הרגולטור הראשי של אמרגן שימוש (P rcnA) סופק מאותו (האיור 3) פלסמיד.
מגבלות, שינויים אפשריים
כדי להבטיח reproductibility מושלם, במבחן הדבקות יש תמיד שיש לבצע באותו המותג של לוחות קלקר (ראה טבלה). מיקרוסקופ פלואורסצנטי קל יותר עם זני ניאון מתויגים-, אך דרישה זו ניתן להתגבר על ידי שימוש בצבעי ניאון כגון Syto, או fusions פלסמיד שנשא Lac-GFP 23. קובץ מצורף חיידקים למשטחי אביוטי כמו קלקר וזכוכית תלוי בחוזק או אוסמולריות היוני של המדיום. התוצאות הטובות ביותר מתקבלות בדרך כלל בLB המינימאלי בינוני או מדולל 22, 24.
יישומים או כיוונים כאשר תשלטו בטכניקה זו בעתיד
תוכן "> השיטה המתוארת כאן לכמת היצמדות חיידקית היא זולה ומהירה. עם זאת, כדי לאפיין מספר רב של זנים או תנאי התרבות, ו / או לקבל אפיון מפורט מבני של biofilms, שיטת תפוקה גבוהה המבוססת על מיקרוסקופ סריקת ליזר confocal בשילוב עם השימוש בצלחות microtiter 96-כן יש לשקול 25.מערכת הקרנת MBEC, התקני Biofilm לשעבר קלגרי 26 יכולה לשמש גם. מערכת זו מבוססת על השימוש בצלחת microtiter עם מכסה נשלף, שמחזיק 96 תשתית יתדות המאפשרות תצפיות מיקרוסקופיות של מבנה biofilm 27, או כימות של תאים בbiofilm לאחר שיבוש ידי sonication על sonicator שולחן מים (MBEC תפוקה גבוהה ( ) Assay HTP, Innovotech, אדמונטון, קנדה). מערכת אחרת, מבחן טבעת Biofilm, עוקבת אחר כמה חרוזים פאראמגנטיים אינרטיים כלולים במדיום תרבותם משותקות במהלך ההיווצרותשל 28 biofilm, וניתן להשתמש בו כדי לכמת היווצרות biofilm. MBEC ומבחן טבעת Biofilm דורשים חומרים ספציפיים שהם יקרים יותר ממוצרים צריכים בסיסיים ששמשו במחקר זה.
משמעות של הטכניקה ביחס לשיטות קיימות
כדי ליצור curli אופרון עצמאי יחיד, שניסינו שתי שיטות במקבילות: גישה סינטתית שתוארה כאן, ושיטה קלסית המעורבת mutagenesis להסיר אתרי הגבלת I PST RI הפנימי ואקו, וצעדי PCR אחרי ligations. שני הגישות היו ביוזמת באותו הזמן, אך ניתוח רצף של אופרון הושג בשיטה הקלסית גילו מוטציות לא רצויות. לכן, הסינתזה של המכשיר כבר לא יעילה יותר ומהיר יותר משיבוט קלסי ונהלי mutagenesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
אנו מודים לחברים אחרים בצוות INSA-ENS iGEM ליון (ויויאן Chansavang, מתילדה דומונד, אלכסנדר Duprey, מלאני ז'פרואה, קלמנס Gonthier, מרגו Jaulin, Aurélie Haag, קונג Goki, תומאס Poinsot, תרשיש Royer ברטרנד, ג'ולי Soula, מיכאל Vonzy הפיר איב זונדל, Soufiane Bouhmadi, אוליבייה Brette, גאל Chambonnier, לורה אייזךד, Aurianne Kroiss, פיליפ ג'ן, Agnès רודריג, ארנו Rondelet, סילבי Reverchon וואלרי Desjardin), הספונסרים שלנו לתמיכה הכספית שלהם (bioMérieux, Assystem, EDF, Fondation INSA, ENS-ליון והמחלקה לBiosciences INSA-ליון), פ Wisniewski-דיי לקריאה ביקורתית של כתב היד הזה וSze CC ד"ר למתנת לחץ. ב 'שרוול עוגן מקבל תואר דוקטור מלגה מאזור Rhône-Alpes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pIG2 | pUC57(pMB1 ori, 2710 bp) with a 3165 bp EcoRI/PstI fragment containing the synthetic Prcn-csgBAEFG operon ; Ampr | ||
| pUC18 | Multicopy plasmid (pMB1 ori, 2686 bp), Ampr | ||
| S23 | SSC1 (= GFP-tagged MG1655, gift of C.C. Sze)/pIG2 | ||
| S24 | SSC1/pUC18 | ||
| CoCl2 | Sigma | 0,1M stock solution kept at Room Temperature | |
| M63 | 29 | ||
| 24-well plate | Nunc | 55429 | Polystyrene 24-well plates |
References
- O'Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), e2437 (2011).
- Melamed, S., Elad, T., Belkin, S.
- Melamed, S. A printed nanolitre-scale bacterial sensor array. Lab Chip. 11, 139-146 (2011).
- Raghu, G., Balaji, V., Venkateswaran, G., Rodrigue, A., Maruthi Mohan, P. Bioremediation of trace cobalt from simulated spent decontamination solutions of nuclear power reactors using E. coli expressing NiCoT genes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 81, 571-578 (2008).
- Olsen, A., Jonsson, A., Normark, S. Fibronectin binding mediated by a novel class of surface organelles on Escherichia coli. Nature. 338, 652-655 (1989).
- Prigent-Combaret, C., et al. Developmental pathway for biofilm formation in curli-producing Escherichia coli strains: role of flagella, curli and colanic acid. Environ. Microbiol. 2, 450-464 (2000).
- Chapman, M. R., et al. Role of Escherichia coli curli operons in directing amyloid fiber formation. Science. 295, 851-855 (2002).
- Vidal, O. Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression. J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).
- Hidalgo, G., Chen, X., Hay, A. G., Lion, L. W. Curli produced by Escherichia coli PHL628 provide protection from Hg(II). Appl. Environ. Microbiol. 76, 6939-6941 (2010).
- Garzon-Rodriguez, W., Yatsimirsky, A. K., Glabe, C. G. Binding of Zn(II), Cu(II), and Fe(II) ions to Alzheimer's A beta peptide studied by fluorescence. Bioorg. Med. Chem. Lett. 9, 2243-2248 (1999).
- Taylor, J. D., et al. Atomic resolution insights into curli fiber biogenesis. Structure. 19, 1307-1316 (2011).
- Brombacher, E., Dorel, C., Zehnder, A. J., Landini, P. The curli biosynthesis regulator CsgD co-ordinates the expression of both positive and negative determinants for biofilm formation in Escherichia coli. Microbiology. 149, 2847-2857 (2003).
- Pesavento, C., et al. Inverse regulatory coordination of motility and curli-mediated adhesion in Escherichia coli. Genes Dev. 22, 2434-2446 (2008).
- Dueholm, M. S., et al. Fibrillation of the major curli subunit CsgA under a wide range of conditions implies a robust design of aggregation. Biochemistry. 50, 8281-8290 (2011).
- Jubelin, G., et al. CpxR/OmpR interplay regulates curli gene expression in response to osmolarity in Escherichia coli. J. Bacteriol. 187, 2038-2049 (2005).
- Ogasawara, H., Yamamoto, K., Ishihama, A. Role of the biofilm master regulator CsgD in cross-regulation between biofilm formation and flagellar synthesis. J. Bacteriol. 193, 2587-2597 (2011).
- Mostaert, A. S., Higgins, M. J., Fukuma, T., Rindi, F., Jarvis, S. P. Nanoscale mechanical characterisation of amyloid fibrils discovered in a natural adhesive. J. Biol. Phys. 32, 393-401 (2006).
- Hammar, M., Arnqvist, A., Bian, Z., Olsen, A., Normark, S. Expression of two csg operons is required for production of fibronectin- and congo red-binding curli polymers in Escherichia coli K-12. Mol. Microbiol. 18, 661-670 (1995).
- Blaha, D. The Escherichia coli metallo-regulator RcnR represses rcnA and rcnR transcription through binding on a shared operator site: Insights into regulatory specificity towards nickel and cobalt. Biochimie. 93, 434-439 (2011).
- Miao, H., Ratnasingam, S., Pu, C. S., Desai, M. M., Sze, C. C. Dual fluorescence system for flow cytometric analysis of Escherichia coli transcriptional response in multi-species context. J. Microbiol. Methods. 76, 109-119 (2009).
- Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 2172-2175 (1989).
- Perrin, C. Nickel promotes biofilm formation by Escherichia coli K-12 strains that produce curli. Appl. Environ. Microbiol. 75, 1723-1733 (2009).
- Bloemberg, G. V., Wijfjes, A. H., Lamers, G. E., Stuurman, N., Lugtenberg, B. J. Simultaneous imaging of Pseudomonas fluorescens WCS365 populations expressing three different autofluorescent proteins in the rhizosphere: new perspectives for studying microbial communities. Mol. Plant Microbe Interact. 13, 1170-1176 (2000).
- Landini, P., Jubelin, G., Dorel, C. Biological Adhesives. Callow,, J., Smith, A. M. , Springer-Verlag. (2006).
- Bridier, A., Dubois-Brissonnet, F., Boubetra, A., Thomas, V., Briandet, R. The biofilm architecture of sixty opportunistic pathogens deciphered using a high throughput CLSM method. J. Microbiol. Methods. 82, 64-70 (2010).
- Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
- Harrison, J. J., et al. The use of microscopy and three-dimensional visualization to evaluate the structure of microbial biofilms cultivated in the Calgary Biofilm Device. Biol. Proced. Online. 8, 194-215 (2006).
- Chavant, P., Gaillard-Martinie, B., Talon, R., Hebraud, M., Bernardi, T. A new device for rapid evaluation of biofilm formation potential by bacteria. J. Microbiol. Methods. 68, 605-612 (2007).
- Miller, J. E. Experiments in molecular genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, N.Y. (1972).
