Summary
Los relojes circadianos funcionar dentro de las células individuales, es decir, son células autónomas. A continuación, se describen los métodos para la generación de células autónomas modelos de reloj de forma no invasiva, luciferasa tiempo real basado en la tecnología de bioluminiscencia. Células Reporter proporcionar sistemas manejables, modelo funcional para el estudio de la biología circadiana.
Abstract
En los mamíferos, muchos aspectos del comportamiento y la fisiología como los ciclos de sueño-vigilia y el metabolismo del hígado son regulados por relojes circadianos endógenos (revisado 1,2). El tiempo circadiano de mantenimiento de sistema es una estructura jerárquica multi-oscilador red, con el reloj central situado en el núcleo supraquiasmático (SCN) sincronizar y coordinar los relojes extra-SCN y periférico en otra parte 1,2. Las células individuales son las unidades funcionales para la generación y el mantenimiento de los ritmos circadianos 3,4, y estos osciladores de diferentes tipos de tejidos en el organismo una proporción notablemente similar mecanismo bioquímico de retroalimentación negativa. Sin embargo, debido a las interacciones a nivel de red neuronal en el SNC y por medio de señales rítmicas, sistémicas a nivel de organismos, de los ritmos circadianos en el nivel organismal no necesariamente son células autónomas de 5-7. En comparación con los estudios tradicionales de actividad locomotora in vivo y ex vivo explantes SCN, Cell-basado en los ensayos in vitro permiten el descubrimiento de células autónomas defectos circadianos 5,8. Estratégicamente, modelos basados en células son más experimentalmente tratable para la caracterización fenotípica y rápido descubrimiento de los mecanismos de reloj básicas 5,8-13.
Debido a que los ritmos circadianos son dinámicas, las mediciones longitudinales con alta resolución temporal son necesarios para evaluar la función del reloj. En los últimos años, grabación en tiempo real utilizando bioluminiscencia luciferasa de luciérnaga como reportero se ha convertido en una técnica común para el estudio de los ritmos circadianos en mamíferos 14,15, ya que permite el examen de la persistencia y la dinámica de los ritmos moleculares. Para supervisar células autónomas ritmos circadianos de la expresión génica, luciferase reporteros se pueden introducir en las células a través de la transfección transitoria 13,16,17 o transducción estable 5,10,18,19. Aquí se describe un protocolo de transducción estable utilizando lentivirus mediada por la entrega de genes. Tsistema de vector lentiviral que es superior a los métodos tradicionales tales como la transfección transitoria y transmisión de línea germinal debido a su eficiencia y versatilidad: permite una entrega eficaz y la integración estable en el genoma huésped de tanto que se dividen y no se dividen las células 20. Una vez que una línea celular reportera se ha establecido, la dinámica de la función de reloj se pueden examinar a través de grabación de bioluminiscencia. En primer lugar, describimos la generación de P (Per2)-D líneas Luc reportero, y luego se presentan datos de este y otros reporteros circadianos. En estos ensayos, los fibroblastos 3T3 de ratón y células de osteosarcoma humano U2OS se utilizan como modelos celulares. También se discuten las diversas formas de utilizar estos modelos en estudios reloj circadiano. Los métodos descritos aquí se pueden aplicar a una gran variedad de tipos de células para estudiar la base molecular y celular de los relojes circadianos, y puede resultar útil en la lucha contra los problemas en otros sistemas biológicos.
Protocol
1. Construcción de Lentiviral luciferase reporteros
Un constructo reportero circadiano de mamíferos por lo general contiene un casete de expresión en la que se fusiona un promotor circadiano con el gen de la luciferasa. Tanto las estrategias de ligación y basadas en la recombinación son comúnmente utilizados para la clonación del ADN. Como ejemplo, aquí se describe un método de Gateway recombinación basada en la clonación para generar una P (Per2)-d reportero Luc lentiviral, en la que la luciferasa desestabilizado (d Luc) está bajo el control del promotor de ratón Per2.
- Clonación del promotor Per2. El uso de PCR para amplificar el fragmento de promotor de ADN Per2 de 526 pb, aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción de un ratón Per2 clon BAC 9-13, usando un cebador directo (5'-CTCGAGCGGATTACCGAGGCTGGTCACG TC-3 ') y un cebador inverso (5' -CTCGAGTCCCTTGCTCGGCCCGTCAC TTGG-3 '), y el clon en pENTR5'-TOPO vector (Invitrogen) para generarpENTR5'-P (Per2).
- Clonación de d Luc. La Luc d contiene el gen de la luciferasa de luciérnaga y una secuencia PEST C-terminal de la degradación de proteínas rápida como se ha descrito previamente 21. El uso de PCR para amplificar el fragmento de ADN d Luc, y el clon en pENTR / D-TOPO vector (Invitrogen) para generar pENTR / Dd Luc.
- Construcción del vector reportero. Mezclar los dos plásmidos pENTR, P pENTR5'-(Per2) y Luc pENTR / DD, con el vector lentiviral destino pLV7-BSD (BSD, blasticidin gen de resistencia), y llevar a cabo la reacción de recombinación utilizando Clonase para generar un pLV7-BSD-P (Per2)-d luc (Figura 1). pLV7-BSD es una versión modificada (realizado en nuestro laboratorio) de pLenti6/R4R2/V5-DEST (Invitrogen) en el que el virus de la hepatitis de la marmota post-transcripcional elemento regulador (WPRE) 22 secuencias se insertaron inmediatamente aguas abajo de la expresión ca ssette para potenciar la expresión génica.
2. Producción de partículas lentivirales
1. Semillas células 293T (día 1)
- Grow embrionarias humanas de riñón (HEK) células 293T a 90-100% de confluencia en ordinario DMEM suplementado con FBS al 10% y 1x de penicilina-estreptomicina-glutamina (PSG) en placas de 10 cm de cultivo. (Rápidamente las células que crecen con el paso número bajo son críticos para la transfección eficiente.)
- Antes de la siembra de las células de las placas de transfección, capa de cultivo de 6 pocillos mediante la adición de 1 ml de 0,001% de poli-L-lisina en PBS a cada pocillo e incubar a temperatura ambiente durante 20 min. Aspirar la solución y se lava una vez con 1x PBS antes de su uso.
- Disociar las células 293T con tripsina y semilla 0,75 x 10 6 células en cada pocillo de las placas pre-recubiertas con 2 ml de DMEM regular. Swirl las placas a fondo para obtener una distribución uniforme de células en cada pocillo. Cultivar las células en la incubadora a 37 ° C durante la noche.
- Observar las células sembradas a partir del día 1. La célula debe alcanzar confluencia de 80-90%.
- Preparar la mezcla de transfección del plásmido en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml mediante la adición de 2 g de un ADN plásmido reportero lentiviral (por ejemplo, pLV7-P (Per2)-d Luc; Liu laboratorio) y los vectores de empaquetamiento 3 (1,3 g Gag / Pol, 0,5 g Rev, y 0,7 g VSVG; Invitrogen). Como control de transfección tanto y la posterior infección, que por lo general incluyen un pozo adicional en la transfección de un vector de expresión GFP lentiviral, pLV156-CMV-EGFP (Figura 1A), que alberga aumento de proteína verde fluorescente (EGFP) bajo el control del promotor CMV como se ha descrito previamente 20.
- Añadir 100 l de 0,25 M de CaCl 2 (diluido con DNasa / RNasa libre ddH 2 O de 2,5 M valores) a la mezcla de plásmido en el paso 2 y mezclar bien. A continuación, añadir 100 ml de solución 2 x BBS (50 mM SERS, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na 2 HPO 4, pH 6,95) y mezclar suavemente pero a fondo. Incubar la mezcla de ADN a temperatura ambiente durante 15 min.
- Mientras espera, aspirar medio de células 293T y cambiar a 2 ml de medio fresco. Volver a la placa de la incubadora durante al menos 10 min para equilibrar el pH del medio antes de la transfección.
- Añadir la mezcla de transfección de la etapa 3 a gota células 293T a gota. Agitar la placa suavemente y observar la formación de partículas con un microscopio. Incubar a 5% de CO 2, 37 ° C durante la noche. (Formación de partículas finas de Capo 4 precipitado / ADN es esencial para la transfección eficiente.)
3. Cosecha de partículas virales (días 3-4)
- Acerca de 16 horas después de la transfección-(día 3) por el cual las células de tiempo debe alcanzar el 100% de confluencia, aspirar el medio de las células y reemplazar con 2 ml de DMEM fresco ordinario. Incubar a 37 ° C durante la noche.
- El día 4, evaluar la eficacia de transfección mediante la observación de la expresión de EGFP en transfection células control (eficacia de la transfección de 90-100%, con expresión de EGFP alta es un predictor fiable de una preparación viral bueno.)
- Se recoge el medio que contiene secretadas, las partículas virales infecciosas. Centrifugar a> 2.000 xg durante 5 minutos para eliminar las células residuales de 293T y recoger el sobrenadante de virus que contiene. Alternativamente, el medio puede ser limpiado con un filtro de 0,45 micras membrana. Las partículas virales son listos para su uso en la infección.
3. Infección de células 3T3
1. Semillas 3T3 células (día 3)
Split y número adecuados de las semillas (~ 12.000) de las células 3T3 en una placa de 12-bien para obtener 20-30% de confluencia por día siguiente. Incubar a 37 ° C durante la noche.
2. Infectar las células 3T3 (día 4)
- Observar las células sembradas. Confluencia de 20-30% (menos del 50%) es deseable para la infección.
- Añadir polibreno a una concentración final de 5 ug / ml al medio de recogida que contiene viralpartículas. Mezclar bien pipeteando.
- Aspirar medio a partir de células 3T3, y añadir 1 ml de la mezcla anterior viral por pocillo. Incubar a 37 ° C durante la noche. (Polybrene se utiliza para mejorar la eficiencia de la infección, pero no se requiere absolutamente. Como puede ser tóxica para algunas células, de un ensayo previo se recomienda.)
3. Seleccione células infectadas (día 5 en adelante)
- Veinticuatro horas después de la infección, aspirar el medio que contiene virus y polibreno de las células infectadas, se lava una vez con PBS 1x, y cambiar a un medio fresco. Incubar a 37 ° C durante la noche para la recuperación y el crecimiento.
- Cuando confluente (normalmente 1-2 días más tarde), los trozos de las células y se incuba a 37 ° C durante la noche.
- El día siguiente, el medio aspirado de células (confluencia <50% se desea) y reemplazar con medio fresco que contiene 10 mg / ml blasticidina para seleccionar para las células transducidas de forma estable. (Blasticidina matar-curva necesita ser determinado empíricamente para una línea celular particular.)
4. La bioluminiscencia Grabación de células Reporter
1. Se siembran las células indicadoras
Propagar blasticidina células resistentes a reportero y dividido en placas de cultivo de 35 mm. Incubar a 37 ° C hasta una confluencia. Por lo general, preparar ≥ 3 platos para cada línea celular reportero en cada condición para fenotipificación circadiano.
2. Sincronización y cambio de medio de grabación
- Aspirar medio de células confluentes reportero, lavar una vez con PBS, y reemplazar con DMEM que contenía 10 mM de forskolina (o 200 nM dexametasona). Incubar a 37 ° C durante 1 hora para sincronizar las células. (Alternativamente, las células pueden ser sincronizados por 23 ciclos de temperatura o choque de suero 24.)
- Mientras espera, preparar registroING medio para células 3T3 como sigue: 1x DMEM (HyClone) que contenía 10% de FBS, 1 x Pen / Strep / Gln, 1 mM de forskolina, 1 mM de luciferina, 25 mM HEPES, pH 7,4. El suero y la concentración de forscolina se puede determinar empíricamente. Para las células muy tenues, libre de rojo fenol medio puede ser utilizado.
- Al final del tratamiento forskolina, aspirar el medio y sustituirlo por medio de grabación recién hecho.
3. Bioluminiscencia de grabación de células informadoras
- Después de cambiar el medio, cubra placas de cultivo de 40 mm cubreobjetos estériles y sellar en el lugar con grasa de vacío para evitar la evaporación.
- Coloque la vajilla en el luminómetro LumiCycle, que se mantiene dentro de una incubadora a 36 ° C sin H 2 O y CO 2.
- Iniciar grabación en tiempo real bioluminiscencia. Por lo general, registrar los ritmos durante 1 semana, seguido de cambio de medio y de grabación continua de una semana segundos (ver Savelyev et al. Para más detalles) 25. (Para la grabación de 96-queplacas ll, Synergy SL2 fue utilizado como dispositivo de grabación, ver Discusión 1.1 para detalles).
5. Análisis de datos y presentación
Reportero facilitar células de alta resolución de grabación luminiscencia cuantitativa, fundamental para determinar los efectos fenotípicos sobre la función del reloj circadiano. Para obtener los parámetros circadianos incluyendo fase, la duración del período, amplitud, ritmo y grado de amortiguación, se utiliza el programa de análisis de LumiCycle (Actimetrics) para analizar los datos de bioluminiscencia 5,14. Brevemente, los datos en bruto son línea de base, montado de primera, y la sustracción de línea de base de datos se ajustan a una onda sinusoidal, de la que los parámetros son determinados. Para ver ejemplos que muestran ritmos persistentes, de bondad de ajuste de> 90% se consigue normalmente. Debido a la bioluminiscencia alta transitoria a cambio de medio, por lo general no incluyen el primer ciclo de datos de análisis.
Para la presentación de datos, por lo general graficar datos en bruto (bioluminiscencia, cuentas / seg) en contra de time (días). Cuando sea necesario, los datos de línea de base-resta se pueden trazar para comparar la amplitud y fase.
6. Los resultados representativos
1. Fase específica periodistas circadianos
El reloj circadiano se basa en un mecanismo de retroalimentación negativa bioquímica 1. El bucle de realimentación núcleo consiste de activadores de la transcripción y BMAL1 reloj, y represores pers y Crys, que actúan sobre los circadianos E / E'-box elementos potenciadores para producir la expresión de genes rítmica (con fase mañana, por ejemplo, Rev-erb α). El lazo de núcleo regula e integra al menos otros dos circadianos cis-elementos, el elemento de unión DBP/E4BP4 (D-box; para la fase de día, por ejemplo, PER3) y el elemento de ROR / REV-ERB unión (RRE; para la fase noche, por ejemplo, Bmal1) 17. Regulación combinatoria de múltiples elementos circadianos puede generar nuevas fases intermedias. Por ejemplo, Cry1 transcripciónes mediada por los tres elementos (elementos circadianos es decir, E / E'de caja y caja D-en el promotor y RRES en el primer intrón del gen Cry1), dando lugar a la distinta Cry1 noche-tiempo de fase 13.
En base a estos mecanismos de regulación génica, hemos generado cuatro construcciones indicadoras diferentes: P (Per2)-d Luc y P (Cry1)-D Luc reporteros que contienen tanto E / E'de caja y D-box elementos en la región de regulación 17, 26,27, P (Cry1) - Intron-d Luc representa regulación combinatoria de los tres elementos (es decir, E / E'-box, D-box, y RRE) 13,17, y P (Bmal1)-d Luc regulado exclusivamente por RRE 9,17,19,21. Hemos introducido estos reporteros en células 3T3 para producir las fases previstas distintas de expresión reportero (Figura 2).
2. Gene caída a través de RNAi y farmacológicamente actiVe compuestos
Cuando la eficiencia de transfección es alta, ARNsi sintético puede ser transfectados transitoriamente en las células para derribar la expresión génica. Cuando la transfección es técnicamente difícil, un vector de expresión de shRNA puede ser de forma estable en células transducidas mediante infección lentiviral, de modo que shRNA producida por la celda se procesa para siRNA para el gen desmontables (KD). Aquí se presentan los efectos de Kd de Cry1 y Cry2 genes utilizando siRNA en células U2OS (Figura 3A) y shRNA en células 3T3 usando un vector de expresión de puerta de enlace pLL3.7 9 (Figura 3B). Además de las células 3T3, el modelo U2OS ha convertido en un modelo preeminente reloj celular en gran parte porque cumple con los requisitos fundamentales para la selección de alto rendimiento de las bibliotecas siRNA humanos disponibles en el mercado (por ejemplo, el origen humano, capaz de generar fuertes ritmos circadianos, la función de validación todos los genes conocidos despertador y susceptibles de transfección altamente eficiente ygrabación luminiscencia cuantitativo). En ambos tipos de células, RNAi mediada KD dado lugar a fenotipos de reloj consistentes con ratón knockout anterior (KO) y estudios celulares KD 5,10,11,28. Por ejemplo, Cry1 KD duración del período se acorta y disminuye la persistencia ritmo, mientras que Cry2 KD alarga período. Además, pequeñas moléculas seleccionadas se pueden utilizar para farmacológicamente objetivo y función perturbar proteína (Figura 3C).
Figura 1. El lentivirus de genes mediada por sistema de suministro. (A) Diagrama esquemático de dos lentiviral P (Per2)-D vectores indicadores Luc y una EGFP-CMV construir. Sólo la región para la integración en el genoma de la célula huésped se muestra. En ambas construcciones indicadoras, la transcripción de d Luc está bajo el control directo del promotor Per2. En el pLV7-BSD-P (Per2)-d vector Luc (recombinación basada en la clonación), un gen de blasticidina coexpressed resistencia (BSD) facilita la selección de las células infectadas. En la pLV156-P (Per2)-d Luc vector (ligadura de un clonado), traducción EGFP está mediada por un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) aguas abajo de d Luc, lo que permite la observación visual y clasificación de FACS de las células infectadas. Además, un SV40 promotor / terminador (P / T) se utiliza como un aislador (véase la discusión 1,3). En el vector CMV-EGFP control, es la expresión de EGFP bajo el control de un fuerte promotor de CMV. (B) imágenes fluorescentes de GFP-expresando transfectadas y las células infectadas. Típicamente, se logra una alta eficiencia tanto en la transfección transitoria de células 293T y en la infección lentiviral de líneas celulares de nuestro interés, como se indica por la expresión de GFP en estas células. Haga clic aquí para ampliar la figura .
Figura 2. Fase expresión específica de los reporteros de bioluminiscencia en células 3T3 Los vectores indicadores de lentivirus utilizados en este experimento son pLV7-BSD-P (Per2)-Luc d, P (Cry1)-Luc d, P (Cry1) -. Intrón-d Luc, y P (Bmal1)-d Luc. Cada reportero exhibe una fase distinta de la oscilación, como se indica por las flechas. Mientras que el Per2 y Cry1 bioluminiscencia unidad promotores pico en fases día por la mañana y el promotor de Bmal1 en fase nocturna, la regulación combinatoria por el P (Cry1) - Intron albergar caja E, D-box, y los elementos RRE confiere fase noche de bioluminiscencia pico . Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 3. Perturbación genética y farmacológica de los ritmos circadianos de bioluminiscencia en las células indicadoras. (A) Efectos de Cry1 y Cry2 desmontables por siRNAs sobre los ritmos celulares de las células indicadoras U2OS. El luminómetro LumiCycle fue utilizado para la grabación de la bioluminiscencia de las células en placas de 35 mm. La figura está adaptada de la referencia n º 10, con permiso de Elsevier (2009). (B) Efectos de la caída por Cry2 shRNAs sobre los ritmos celulares de células indicadoras 3T3. Un vector de puerta de enlace que contiene un casete de pLL3.7 U6-shRNA se utilizó para gen desmontables Cry2. shRNA2 tiene una eficacia mejor que shRNA1 desmontables como se determina por análisis de transferencia Western (datos no mostrados). Un luminómetro Synergy fue utilizado para la grabación de la bioluminiscencia de las células en una placa de 96 pocillos. Los ajustes para la grabación son las siguientes: temperatura de la incubadora., 33 ° C, el tiempo de integración, 15 s; intervalo de tiempo, 30 min (C) Efectos de inhibidores de moléculas pequeñas en celritmos lular de células U2OS reportero. Chir99021 y roscovitina son inhibidores dirigidos contra GSK-3 y CDK, respectivamente. El sistema Viewlux (Chir99021 ensayo) y un luminómetro Tecan (roscovitina ensayo) se utilizaron para las grabaciones de bioluminiscencia de las células en 384-y placas. La figura es una adaptación de Referencia # 19 (Copyright 2008 National Academy of Sciences, EE.UU.). Haga clic aquí para ampliar la cifra .
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Discussion
1. Modificaciones al Protocolo actual
1.1 Los dispositivos de grabación y consideraciones de rendimiento
Debido a su disponibilidad comercial, la LumiCycle (Actimetrics) se ha convertido en el dispositivo más utilizado luminómetro automatizado para grabación en tiempo real 4,5,9,19,29-31. El LumiCycle emplea tubos fotomultiplicadores (PMT) como detectores de luz, que proporcionan una sensibilidad extremadamente alta y bajo ruido 14, y por lo tanto es particularmente adecuado para la adquisición de datos de muy tenue de luciferasa basado en bioluminiscencia. Otros similares PMT basados en dispositivos (por ejemplo, Kronos, Atto Co., y Polarstar Optima, BMG LabTech Inc.) también se han utilizado en muchos estudios 32,33.
El ensayo LumiCycle usando platos de 35-mm puede adaptarse a 96 -, 384 - 1152 o incluso pocillos formatos de placa de cribado de alto rendimiento (HTS) experimentos. HTS ensayo de desarrollo se centra principalmente en los siguientes dos aspectos: 1Mejor a las células) con brillante reportero luciferase y expresión / o superior reportero (ver abajo), y 2) los dispositivos de grabación de alta sensibilidad con capacidad multi-pocillos. Nosotros y otros han utilizado varios lectores de microplacas, como Synergy SL2 (BioTek), Infinite M200 (Tecan) 19, TopCount (PerkinElmer) 28, y EnVision (Perkin Elmer) 34. En nuestro laboratorio, tanto el LumiCycle y dispositivos Synergy se colocan en una habitación con temperatura y luz controladas apretado-incubadora. Alternativamente, si los recursos lo permiten, las unidades de grabación se puede colocar en una habitación de temperatura controlada. Para HTS, ajustes críticos, tales como tiempo de integración / exposición y el intervalo entre los puntos de tiempo deben ser determinadas empíricamente para un reportero dado y dispositivo de grabación.
El ensayo LumiCycle no proporciona información espacial en la celda de resolución única. Yamaguchi et al. 35 y Welsh et al. 4,5 pionero en tiempo real de imágenes de bioluminiscencia por integrating un microscopio especialmente diseñado con una alta sensibilidad y bajo ruido cámara CCD 15 para lograr la resolución única célula. En los últimos años, los sistemas de imágenes más sensibles se han convertido en comercialmente disponibles, incluyendo LV200 (Olympus) y CellGraph (AB3000-B, Atto) con un enfriada ultrasensible y electrón de iluminación trasera multiplicando filtros CCD y multicolor 36,37. Formación de imágenes también se ha utilizado en los experimentos de HTS más sofisticados, por ejemplo, un CCD de imágenes Viewlux (Perkin-Elmer) en combinación con el sistema robótico automatizado GNF (Sistemas GNF). Este sistema permitió a gran escala las pantallas de nuevos genes y moléculas pequeñas que afectan a la función de reloj 10,12,19.
1,2 luciferase reporteros
Luciferasas se utilizaron primero en luminiscencia grabación en tiempo real de la expresión génica circadiano en la década de 1990 en las plantas y las cianobacterias, y se han usado comúnmente en el sistema de los mamíferos desde 2000 29,35,38-40 (also reseñas 14,15). Luciferase reporteros son generalmente menos tóxicos y más sensible que los reporteros fluorescentes, tales como GFP, debido a fondo mucho menor 41. El reportero más comúnmente utilizado es bioluminiscente luciérnaga (Photinus pyralis) luciferasa (Luc +) construida en el vector pGL3 serie (Promega), en la que se modificó la región de codificación de la nativa Luc optimizado para la transcripción y la traducción. La combinación de la luciferasa de luciérnaga y su sustrato altamente estable y células permeables-, D-luciferina, es ideal para grabaciones a largo plazo. d Luc es una versión modificada de Luc + con una secuencia PEST fusionado en su extremo C-terminal para permitir la rápida degradación de la proteína. Una versión aún más mejorada, Luc2, está disponible en la serie de vectores pGL4 (Promega) con la expresión más alta y menos anómala. Sin embargo, no se observó una diferencia significativa en el rendimiento entre Luc + y Luc2 en transfectadas transitoriamente Las células 3T3 y U2OS (datos no mostrados). En un informe reciente, el brasileño clic escarabajo luciferasa (Luc E) fue demostrado para exhibir una señal mucho más brillante que Luc +, adecuado para obtener imágenes de células individuales 42.
Muchos estudios recientes han aprovechado la mPER2 :: LUC fusión knock-en ratones reportero 4,5,9,19,25,29-31,43. Este sistema permite que el reportero circadiano fenotipado de las células y los explantes de tejido, incluyendo el SCN. En nuestros estudios anteriores, se cruzó esta línea de ratón reportero con muchos de los knockouts de genes comportamiento caracterizados reloj y se examinó la dinámica de los ritmos de bioluminiscencia en SCN, hígado y pulmón explantes cultivados ex vivo, y, en las neuronas del SCN disociadas y fibroblastos cultivados in vitro 4 5,9,31. Estos estudios nos permitió obtener importantes conocimientos sobre los detalles moleculares de funcionamiento del reloj a nivel celular y del organismo.
1,3 métodos de administración de genes
e_content "> basados en vectores reporteros de reloj proporcionan una gran versatilidad, ya que puede ser introducido en varios tipos de células por medio de transfección transitoria 11,13,16,17 o transducción lentiviral 5,9,18. aunque engorroso y menos reproducible, las células transfectadas transitoriamente puede también ser cultivadas en la presencia continua de antibióticos para generar líneas celulares estables. Lentiviral vectores se prefieren debido a su integración estable en el genoma de la célula, así como una mayor eficiencia y versatilidad. Además el vector pLV7 presentado anteriormente en el que las células infectadas pueden ser seleccionado con antibióticos, se han utilizado otros vectores. Por ejemplo, la pLV156-P (Per2)-d Luc vector contiene un P (Per2)-d Luc-IRES-EGFP casete de expresión en el que está mediada traducción EGFP por una entrada de ribosoma interno sitio (IRES) aguas abajo de d Luc, lo que permite la observación visual y activada por fluorescencia de células de clasificación (FACS) de las células con intevectores ed 5 (Figura 1) (ver más abajo). Para proteger el reportero de efectos de sitio de integración, un promotor constitutivo y el terminador (P / T) se puede introducir como un aislante o señuelo inmediatamente aguas arriba de la P (Per2)-d casete de expresión de luc (por ejemplo, inferior construir en la Figura 1A ), como se informó por Brown et al. 18 y Liu et al. 5Estudios previos han establecido las bases para la exploración de tejidos específicos de perturbación genética, tanto in vivo y / o ex vivo 44-48. Por ejemplo, las partículas víricas pueden ser inyectados en la región SCN seguido por la preparación SCN rebanada. Como alternativa a esto in vivo seguido de ensayo ex vivo, rebanadas SCN puede ser diseccionado primera y cultivadas ex vivo, seguido de incubación con alto título de virus. Sin embargo, debido a la eficiencia de la infección de bajo rodajas de tejido relativamente gruesas,un ex altamente consistente protocolo in vivo queda por desarrollar.
1,4 Elección de líneas de células y las condiciones de grabación
Mucho de lo que sabemos acerca de la bioquímica y la biología celular del mecanismo del reloj se basa en tres modelos de celulares: los fibroblastos 3T3 de ratón, células U2OS 16,17 osteosarcoma humano 10,11,19,28 y fibroblastos de ratón derivados de ratones 9,13 , 34. El sistema de vector lentiviral permite el suministro eficaz y la integración estable en el genoma huésped de tanto que se dividen y no se dividen las células de mamífero, y por lo tanto no está limitada a ciertos tipos de células como en la transfección transitoria. Dadas las funciones de los relojes circadianos en la regulación de una amplia variedad de respuestas celulares y fisiológicas, los estudios futuros ciertamente se extenderá a una amplia variedad de tipos de células, o bien líneas celulares disponibles en el mercado o células primarias derivadas de ratones. Estos estudios reloj células autónomas ayudará a descubrir los tejidos ubiquitous, así como los tejidos específicos, propiedades de los relojes circadianos.
Vale la pena señalar que la generación de células indicadoras pueden requerir pruebas empíricas de los reporteros diferentes (por ejemplo, varios tipos de vectores y promotor), y a veces una mayor optimización. No todos los tipos de células tienen células autónomas ritmos. Para mejorar la salud de las células y la persistencia de los ritmos celulares, la optimización del medio de grabación es a menudo necesario. Por ejemplo, como alternativa al medio de grabación 3T3, el medio de grabación utilizado para las células U2OS es el siguiente: 1x DMEM (Invitrogen), 2% de B-27, 1 mM de forskolina 1 mM, luciferina, 14,5 mM de NaHCO3, 10 mM HEPES (pH 7,2). 1 mM de luciferina es generalmente suficiente, pero una concentración final (0,1-1 mM) se puede determinar para cada tipo de célula / reportero. Forskolin puede no ser necesario y su concentración puede ser determinada empíricamente para cada tipo celular.
1.5 Transfección eficiencia en la preparación lentiviral
Alta transfection eficiencia de las células 293T es crítico para una buena preparación viral. Consideraciones importantes incluyen la salud de las células 293T y la elección de un reactivo de transfección. 293T células pueden ser muy quisquillosos y requieren un manejo cuidadoso. Por lo tanto, la tasa de crecimiento de las células y la morfología debe ser cuidadosamente monitoreado. Por razones de coherencia, se recomienda que el suero se probó por primera vez y el mismo lote comprobada utilizada en lo sucesivo para el mantenimiento de las células. Siempre probar nuevas BBS 2x y CaCl 2 soluciones stock y optimizar la concentración de trabajo de CaCl 2 alrededor de 0,25 M. Las células de número de paso alto y / o mostrar lenta tasa de crecimiento no debe ser utilizado. Células 293T son fácilmente transfectables con un número de reactivos de transfección. Además de CaPO 4, que también se logra una excelente eficiencia de la transfección con Fugene 6 (Roche o Promega) o Lipofectamine 2000-(Invitrogen). Estos basadas en lípidos de transfección (lipofección) reactivos son más caras, pero dan una mayor consistencia de la transfección de CaPO 4. For grandes preparaciones lentiviral, se recomienda utilizar CaPO4 para la transfección debido a su menor costo.
1,6 Generación de líneas celulares clonales
Un-partículas virales concentradas crudo son de título relativamente bajo (10 6 partículas virales / ml), y la expresión de reportero en células transducidas es bajo. Aunque esto es suficiente para la mayoría de aplicaciones como la grabación LumiCycle, más brillantes periodistas son a menudo necesarios, por ejemplo, en ensayos de alto rendimiento utilizando un dispositivo de grabación sea menos sensible. Reportero de la expresión se puede aumentar mediante el uso de mayores preps título viral. Para ello, se recomienda el uso de grandes recipientes de cultivo tales AS15 cm de platos para la transfección y la recolección de los medios de comunicación dos veces en el día 4 y el día 5. Por concentración de 10 veces (10 7 partículas virales / ml), realizar la filtración usando centrífugas dispositivos de filtro (Millipore). Por concentración de 100x o más (≥ 10 8 partículas virales / ml), realizar ultracentrifugación como se ha descrito previamente
2. La aplicación de células autónomas de modelos Reporter Reloj
A diferencia de los modelos de tejido o animal, modelos basados en células son susceptibles a las perturbaciones genéticas y farmacológicas, y cuando sea necesario, utilice también en formatos HTS. La perturbación de la función de genes se puede lograr por la sobre-expresión o RNAi desmontables mediada. Selectivas moléculas pequeñas se pueden utilizar para interferir con la función de la proteína. Aquí un breve dDiscuta algunos de los usos de los modelos de reloj de células autónomas de estudios circadianos.
2.1 Estudio de los mecanismos de reloj de núcleo
Por células autónomas modelos de reloj han facilitado en gran medida los estudios mecanicistas. Hogenesch y sus colegas utilizaron el modelo 3T3 para demostrar que la represión retroalimentación por Crys se requiere para la función de reloj 16, y el modelo U2OS para sondear las propiedades de nivel de sistema de función de reloj 11. Se empleó el Cry1-/ -: Cry2-/ - modelo de fibroblastos derivados de ratones para demostrar que la represión retroalimentación retardada es necesaria para la función del reloj 13, y el Bmal1-/ - fibroblastos modelo para mostrar que Rev-erbα y β juegan papeles redundantes en RRE regulación mediada por la expresión de genes rítmico, y que el ritmo Bmal1 no es crítica requerida para la función de reloj del núcleo 9. Por otra parte, la detección química en las células reportero permitió la identificación y / o aclaración de las funciones de GSK-3 β (período acortamiento cuando perturbado) 19, CK1σ y ε (periodo de alargamiento cuando perturbado) 49, y CK1α 12. Como se discute a continuación, estos modelos de facilitar la identificación de los componentes de reloj adicionales. Estratégicamente, estos modelos celulares son más manejables para el descubrimiento rápido de los mecanismos básicos, que a su vez proporcionan nuevos puntos de entrada para la validación in vivo y la exploración.
2.2 Identificación de los factores de reloj
Además del bucle de realimentación principal, el mecanismo de reloj también se integra diversas señalización y factores reguladores. Para la identificación de los componentes de reloj adicionales y modificadores, células autónomas modelos de reloj son ventajosos sobre cribado genético en ratones debido a la letalidad inherente, efectos pleiotrópicos, y la compensación de desarrollo genético asociado con modelos animales mutantes 50. Cell basado en pantallas, en combinación con la genómica funcional aprodolores, se han llevado a cabo eficazmente con alto rendimiento de los sistemas de grabación de pantalla genoma siRNA y shRNA bibliotecas para la identificación de los factores novedosos 10,28 reloj. Del mismo modo, se pueden emplear métodos biológicos y químicos de pantalla para diversas pequeñas moléculas para estudiar sus efectos sobre la función de reloj 12,19,34,49. Aunque los principales genes de reloj y sus funciones han sido identificadas, estas pantallas han identificado componentes adicionales o modificadores que están implicados en la regulación o modulación del reloj. Muchos de estos modificadores representan modalidades particulares de la integración de la señal de transducción de señales síncronas o asíncronas (entradas de reloj).
2.3 Estudio de salidas de reloj
Aunque prácticamente todas las células in vivo tienen relojes circadianos, las células cultivadas in vitro no muestra necesariamente evidentes ritmos circadianos. En este contexto, el enfoque reportero proporciona una herramienta útil para probar si lamecanismo de reloj existe en un tipo de célula particular. Presencia de mecanismos de reloj células autónomas justificar estudios de salidas de reloj en estas células, así como en tejidos in vivo, incluyendo el transcriptoma por microarray o la secuencia de ARN 51,52, redes de regulación transcripcional, el proteoma, y el metaboloma. Estos estudios examinan todo el genoma de RNA y los patrones de expresión de proteínas y, por tanto complementaría a base de células reportero ensayos de luminiscencia, que no necesariamente reflejan la expresión endógena.
3. Importancia de los modelos con reloj en células autónomas
Coordinación de la función circadiano en el SNC y en células diferentes y tipos de tejido es un aspecto crítico de la fisiología normal 30. El SCN central y relojes periféricos son partes esenciales de la organización circadiana en general. El SCN recibe la entrada de luz directamente de la retina para arrastrar al ciclo de luz / oscuridad, y sirve como un coordinador parasincronizar los relojes de periféricos a través de conexiones neuronales y hormonal. Además de la sincronización interna, el reloj molecular dentro de los tejidos periféricos y las células también orquesta una miríada de redes de salida de la transcripción, que en definitiva gobierna evidentes ritmos circadianos en la fisiología y el comportamiento.
Por lo tanto, ambas señales sistémicas y locales regula fisiología circadiana, y hay una necesidad de descubrir los genes circadianos regulados directamente por células autónomas relojes vs los indirectamente regulada por señales sistémicas que emanan del SCN. El papel de los relojes periféricos pueden ser estudiados en modelos de reloj células autónomas, en el que se eliminan las influencias sistémicas. En el caso de que el hígado, los tejidos específicos de las redes de regulación generar ritmos en locales fisiología 51,53. Mediante la comparación in vitro e in vivo de los ritmos circadianos, que será capaz de discriminar entre las funciones de reloj células autónomas y sistémica impulsadas cue-. En efecto, recent estudios han empezado a revelar un papel importante para el reloj del hígado en la expresión génica hepática 6,51,52. La investigación futura en el campo del desarrollo garantiza de varios modelos de tejidos y de células específicas del tipo de reloj que representan diferentes salidas fisiológicas.
Los estudios previos de la bioquímica y biología celular del mecanismo del reloj han basado en gran medida en un número limitado de tipos de células y tejidos, incluyendo particularmente 3T3, U2OS, fibroblastos de ratón, y el hígado. Una suposición implícita en la mayoría de los estudios circadianos es que el reloj funciona de la misma manera en todas las células y tipos de tejidos, y la función del gen determinado en una célula o tipo de tejido se considera generalmente que se aplican universalmente en todas las células 7. Sin embargo, mediante el establecimiento y caracterización de células autónomas más modelos de reloj, los estudios futuros se espera que descubrir propiedades de los tejidos específicos que subyacen a la biología circadiana del reloj local.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación Nacional de Ciencia (IOS-0920417) (ACL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | HyClone | SH30243FS | For regular cell growth |
| DMEM | Invitrogen | 12100-046 | For luminometry |
| FBS | HyClone | SH3091003 | |
| Pen/Strep/Gln(100x) | HyClone | SV3008201 | |
| B-27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| D-Luciferin | Biosynth | L-8220 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| All other chemicals | Sigma | ||
| Equipment | |||
| Tissue culture incubator | 5% CO2 at 37 °C | ||
| Tissue culture hood | BSL-2 certified | ||
| Light & fluorescent microscope | Phase contrast optional | ||
| LumiCycle | Actimetrics | ||
References
- Reppert, S. M., Weaver, D. R.
- Hastings, M. H., Reddy, A. B., Maywood, E. S. A clockwork web: circadian timing in brain and periphery, in health and disease. Nat. Rev. Neurosci. 4, 649-661 (2003).
- Nagoshi, E. Circadian gene expression in individual fibroblasts: cell-autonomous and self-sustained oscillators pass time to daughter cells. Cell. 119, 693-705 (2004).
- Welsh, D. K. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Curr. Biol. 14, 2289-2295 (2004).
- Liu, A. C. Intercellular coupling confers robustness against mutations in the SCN circadian clock network. Cell. 129, 605-616 (2007).
- Kornmann, B. System-driven and oscillator-dependent circadian transcription in mice with a conditionally active liver clock. PLoS Biol. 5, e34 (2007).
- Hogenesch, J. B., Herzog, E. D. Intracellular and intercellular processes determine robustness of the circadian clock. FEBS Lett. 585, 1427-1434 (2011).
- DeBruyne, J. P., Weaver, D. R., Reppert, S. M. Peripheral circadian oscillators require CLOCK. Curr. Biol. 17, 538-539 (2007).
- Liu, A. C. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genet. 4, e1000023 (2008).
- Zhang, E. E. A genome-wide RNAi screen for modifiers of the circadian clock in human cells. Cell. 139, 199-210 (2009).
- Baggs, J. E. Network features of the mammalian circadian clock. PLoS Biol. 7, e52 (2009).
- Hirota, T. High-throughput chemical screen identifies a novel potent modulator of cellular circadian rhythms and reveals CKIalpha as a clock regulatory kinase. PLoS Biol. 8, e1000559 (2010).
- Ukai-Tadenuma, M. Delay in feedback repression by cryptochrome 1 is required for circadian clock function. Cell. 144, 268-281 (2011).
- Yamazaki, S., Takahashi, J. S. Real-time luminescence reporting of circadian gene expression in mammals. Methods Enzymol. 393, 288-301 (2005).
- Welsh, D. K., Imaizumi, T., Kay, S. A. Real-time reporting of circadian-regulated gene expression by luciferase imaging in plants and mammalian cells. Methods Enzymol. 393, 269-288 (2005).
- Sato, T. K. Feedback repression is required for mammalian circadian clock function. Nat. Genet. 38, 312-319 (2006).
- Ueda, H. R. System-level identification of transcriptional circuits underlying mammalian circadian clocks. Nat. Genet. 37, 187-192 (2005).
- Brown, S. A. The period length of fibroblast circadian gene expression varies widely among human individuals. PLoS Biol. 3, e338 (2005).
- Hirota, T. A chemical biology approach reveals period shortening of the mammalian circadian clock by specific inhibition of GSK-3beta. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20746-20751 (2008).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat. Protoc. 1, 241-245 (2006).
- Ueda, H. R. A transcription factor response element for gene expression during circadian night. Nature. 418, 534-539 (2002).
- Zufferey, R., Donello, J. E., Trono, D., Hope, T. J. Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element enhances expression of transgenes delivered by retroviral vectors. J. Virol. 73, 2886-2892 (1999).
- Buhr, E. D., Yoo, S. H., Takahashi, J. S. Temperature as a universal resetting cue for mammalian circadian oscillators. Science. 330, 379-385 (2010).
- Balsalobre, A., Damiola, F., Schibler, U.A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue culture cells. Cell. 93, 929-937 (1998).
- Savelyev, S. A., Larsson, K. C., Johansson, A., Lundkvist, G. B. S. Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus. J. Vis. Exp. (48), e2439 (2011).
- Akashi, M., Ichise, T., Mamine, T., Takumi, T. Molecular mechanism of cell-autonomous circadian gene expression of Period2, a crucial regulator of the mammalian circadian clock. Mol. Biol. Cell. 17, 555-565 (2006).
- Ohno, T., Onishi, Y., Ishida, N. A novel E4BP4 element drives circadian expression of mPeriod2. Nucleic Acids Res. 35, 648-655 (2007).
- Maier, B. A large-scale functional RNAi screen reveals a role for CK2 in the mammalian circadian clock. Genes Dev. 23, 708-718 (2009).
- Yoo, S. H. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 5339-5346 (2004).
- Liu, A. C., Lewis, W. G., Kay, S. A. Mammalian circadian signaling networks and therapeutic targets. Nat. Chem. Biol. 3, 630-639 (2007).
- Ko, C. H. Emergence of noise-induced oscillations in the central circadian pacemaker. PLoS Biol. 8, e1000513 (2010).
- Izumo, M., Johnson, C. H., Yamazaki, S. Circadian gene expression in mammalian fibroblasts revealed by real-time luminescence reporting: temperature compensation and damping. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16089-16094 (2003).
- Izumo, M., Sato, T. R., Straume, M., Johnson, C. H. Quantitative analyses of circadian gene expression in mammalian cell cultures. PLoS Comput. Biol. 2, e136 (2006).
- Chen, Z. Identification of diverse modulators of central and peripheral circadian clocks by high-throughput chemical screening. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 101-106 (2011).
- Yamaguchi, S. Synchronization of cellular clocks in the suprachiasmatic nucleus. Science. 302, 1408-1412 (2003).
- Akashi, M., Hayasaka, N., Yamazaki, S., Node, K. Mitogen-activated protein kinase is a functional component of the autonomous circadian system in the suprachiasmatic nucleus. J. Neurosci. 28, 4619-4623 (2008).
- Hoshino, H., Nakajima, Y., Ohmiya, Y. Luciferase-YFP fusion tag with enhanced emission for single-cell luminescence imaging. Nat. Methods. 4, 637-639 (2007).
- Asai, M. Visualization of mPer1 transcription in vitro: NMDA induces a rapid phase shift of mPer1 gene in cultured SCN. Curr. Biol. 11, 1524-1527 (2001).
- Wilsbacher, L. D. Photic and circadian expression of luciferase in mPeriod1-luc transgenic mice in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 489-494 (2002).
- Yamazaki, S. Resetting central and peripheral circadian oscillators in transgenic rats. Science. 288, 682-685 (2000).
- Welsh, D. K., Noguchi, T. Cellular bioluminescence imaging. Imaging: A Laboratory Manual. Yuste, R. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 369-385 (2011).
- Nakajima, Y. Enhanced beetle luciferase for high-resolution bioluminescence imaging. PLoS One. 5, e10011 (2010).
- Guilding, C. A riot of rhythms: neuronal and glial circadian oscillators in the mediobasal hypothalamus. Mol. Brain. 2, 28 (2009).
- O'Neill, J. S. cAMP-dependent signaling as a core component of the mammalian circadian pacemaker. Science. 320, 949-953 (2008).
- Fuller, P. M., Lu, J., Saper, C. B. Differential rescue of light- and food-entrainable circadian rhythms. Science. 320, 1074-1077 (2008).
- Mukherjee, S. Knockdown of Clock in the ventral tegmental area through RNA interference results in a mixed state of mania and depression-like behavior. Biol. Psychiatry. 68, 503-511 (2010).
- Saijo, K. A Nurr1/CoREST pathway in microglia and astrocytes protects dopaminergic neurons from inflammation-induced death. Cell. 137, 47-59 (2009).
- Elias, G. M. Synapse-specific and developmentally regulated targeting of AMPA receptors by a family of MAGUK scaffolding proteins. Neuron. 52, 307-320 (2006).
- Isojima, Y. CKIepsilon/delta-dependent phosphorylation is a temperature-insensitive, period-determining process in the mammalian circadian clock. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 15744-15749 (2009).
- Bucan, M., Abel, T. The mouse: genetics meets behaviour. Nat. Rev. Genet. 3, 114-123 (2002).
- Hughes, M. E. Harmonics of circadian gene transcription in mammals. PLoS Genet. 5, e1000442 (2009).
- Atwood, A. Cell-autonomous circadian clock of hepatocytes drives rhythms in transcription and polyamine synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 18560-18565 (2011).
- Panda, S. Coordinated transcription of key pathways in the mouse by the circadian clock. Cell. 109, 307-320 (2002).
