Summary
Мы описываем метод генетической модификации первичных Т-клетки человека с использованием трансгенных невирусных
Protocol
День 0
1. Выделение МКПК из крови человека
- Соберите 20 мл свежей человеческой крови с помощью венепункции в Na-гепарин труб Vacutainer.
- Mix крови и Advanced RPMI 1640 в 1:1 (объем / объем) отношение.
- Добавить 20 мл Lymphoprep средних и 50 мл центрифужные пробирки (25 ° C). Медленно слоем 25-30 мл крови RPMI 1640 смеси в верхней части Lymphoprep.
- Центрифуга при 400 мкг в течение 40 минут без тормозов.
- Соберите как различны и нечеткой слои с помощью одноразовой пипетки на 10 мл 1x PBS (25 ° C) и довести объем до 50 мл 1x PBS.
- Центрифуга при 450 х г в течение 10 мин.
- Аспирируйте супернатант полностью и добавить 20 мл Расширенный RPMI 1640.
- Центрифуга при 400 мкг в течение 5 мин.
- Аспирируйте супернатант. Добавить 10 мл полной среды T клетки с добавлением 5 нг / мл rhIL-15 предварительно нагретой при 37 ° C.
- Подсчитайте количество клеток и пластины в 24 и пальто культуре тканиред пластину на 2 х 10 6 клеток / лунку в полной T СМИ ячейки с добавлением 5 нг / мл rhIL-15 Добавить стерильной водой для окружающих скважин. Выдержите в течение ночи в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° C, 5% CO 2.
День 1
2. Покрытие пластин с анти-CD28 и анти-CD3 антитела для стимулирования Т-клеток
- Развести анти-CD28 и анти-CD3 антитела в стерильной воде в концентрации 1 мкг / мл каждая.
- Добавить 500 мкл раствора каждого антитела к 5 отмеченные лунки не покрытых тканевой культуре 24-луночный планшет.
- Добавить стерильную воду, чтобы отдохнуть скважин. Оберните пластину в термоусадочную пленку и положите в холодильник на 4 ° C.
3. Nucleofection стимулированных Т-клеток
- Prewarm Т-клеточной среде при 37 ° C и дополнения с 5 нг / мл rhIL-15. Подготовить всю nucleofector решение, добавив 500 мкл Nucleofector Дополнение 1 к 2,25 мл Nucleofector решение.
- liquot 5 мкг каждого из транспозонов (Zeo-PT-CMV-EGFP) и транспозазы (pCMV-PiggyBac) в 1,5 мл трубки микроцентрифуге. Примечание: это может быть необходимо для оптимизации транспозазы и транспозонов количество ДНК для оптимальной доставки генов и свести к минимуму клеточной токсичности. Плазмиды могут быть получены из авторов запроса.
- Урожай МПК от 24 луночный планшет для культивирования тканей в 50 мл трубки. Подсчитайте количество клеток. Сохранить 2 х 10 6 клеток для использования в качестве контроля при проточной цитометрии.
- Добавить 7-10 х 10 6 клеток на 15 мл и трубки центрифуги при 400 мкг, 5 мин, супернатант и пальцем движением гранул.
- Добавить 100 мкл Т-клеток полное решение для nucleofection ослабил осадок клеток.
- Добавить растворе смеси клеток в пробирке, содержащей плазмиды.
- Добавить решение клеток-плазмиды смесь на дно nucleofection кювет. Будьте осторожны, чтобы не вводить никаких пузырей.
- Nucleofect клеток с использованием программ U-014 (Нестимулированные Т-клеток, человека, http://bio.lonza.com/resources/product-instructions/protocols/ ).
- Сразу добавить 500 мкл предварительно нагретого сред с rhIL-15 в кювете. Передача клетки лунку 24-луночный планшет с 1,5 мл предварительно нагретого сред с rhIL15.
- Выдержите в течение ночи в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° C, 5% CO 2.
День 2
4. Неспецифическая стимуляция Т-клеток
- Урожай клеток и определения количества клеток. Отложите 0,5 х 10 6 клеток для проточной цитометрии для определения частоты GFP-положительных клеток. Использование не-трансфицированных МПК в качестве контроля.
- Аспирируйте CD3/28 раствор антител из культуры ткани, не покрытой пластины и промыть каждую лунку с Т СМИ ячейки.
- Ресуспендируют nucleofected клетки на уровне 0,5 х 10 6 клеток на мл в полной CTL СМИс добавлением 5 нг / мл rhIL-15. Добавить 2,0 мл каждого из nucleofected клеток в 4 скважинах без планшета для культуры ткани. Добавить 0,5 х 10 6 клеток, не nucleofected на 5-е хорошо.
- Выдержите в течение 3 дней в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° C, 5% CO 2.
День 5
- Урожай вынужденного Т-клеток от не-покрытием планшета для культуры ткани.
- Граф и replate клеток в 24 хорошо покрытием планшета для культуры ткани на уровне 0,7 х 10 6 клеток / мл в средствах массовой информации Т-клеток с 5 нг / мл IL-15.
День 7
7. Анализ экспрессии генов
- Урожай клеток и пятна с анти-CD8 антител человека (может также использовать анти-CD3 и анти-CD4) и проанализировать с помощью проточной цитометрии для выражения GFP%.
День 8 (необязательно)
8. Расширение Т-клеток
- На 8 день после трансфекции, Т-клетки могут быть replated в T-Клеточной среде с IL-15 при плотности 0,7 х 10 6 клеток на лунку для дальнейшего расширения 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Схема демонстрирует шаги в генетической модификации человека Т-лимфоцитов с корреспондентом гена (EGFP) показан на рисунке 1. Эти плазмиды могут быть предоставлены по просьбе авторов. Schemtic демонстрирует шаги в генетически измененных человеческих Т-лимфоцитов с корреспондентом гена (EGFP) является показанные на Рисунке 2. Необходимо активировать Т-клетки для того, чтобы заставить их разделить, расширение и распространение в культуре. Измененные Т-клетки человека затем культивировали и анализировали с помощью проточной цитометрии для экспрессии генов на 1 день и 7 день. Показаны результаты от одного донора на рисунке 3. Клетки окрашивали аллофикоцианин (APC)-сопряженных анти-CD8, проанализированы EGFP (трансгенных) и APC флуоресценции FACSCalibur оснащен набором фильтров для 4 сигналов флуоресценции с использованием программного обеспечения Cell Quest (Becton Dickinson). Ранее мы уже наблюдали генной модификации как CD4 и CD8 положительных Т-клеток и здесь демоназывают, CD8-положительных клеток в качестве примера 7. Хотя мы анализировали на одну здесь выражение трансгена, PiggyBac была также использована для мульти-ген (или мультиплексированных) переноса генов в клетках человека 17. Снижение УЗФБ выражение между 1 день и 7-й день, скорее всего, связано с тем, что не все трансфекции клетки подвергаются стабильной интеграции ДНК-транспозонов.
Рисунок 1. Схематическое изображение плазмиды используются для PiggyBac опосредованное модификация гена человеческого Т-клеток. ЦМВ, цитомегаловирус промоутер, интрон, SV40 интрон для стабилизации мРНК; PiggyBac, транспозазы кДНК; SV40 рА, сайт полиаденилирования; PUC, начало репликации, б-лактамаз, устойчивость к ампициллину гена; PB3'IR, «инвертированный повтор; PB5" PiggyBac 3 IR, PiggyBac.. Инвертированного повтора 5 '; ZeoR, зеоцин ген устойчивости; R6K Ори, начало репликации; ИВС, промежуточные последовательности; EGFP, люминесцентные гена-репортера Примечание: антибиотики были использованы бактериальные отбора и роста, но не были использованы в культурах клеток Т Нажмите здесь чтобы увеличить показатель .
Рисунок 2. Схема описывающих изменение первичных Т-клетки человека с помощью системы PiggyBac транспозонов.
Рисунок 3. Стабильная экспрессия трансгенов в Т-клетках модифицированных PiggyBac транспозона систем. Левая панель: УЗФБ выражении на 1 день. Правая панель:. УЗФБ выражении на 7 день Щелкните здесь, чтобы увеличить показатель .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод, описанный здесь позволяет устойчивая модификация трансгенного первичных человеческих Т-лимфоцитов. Ранее мы уже тестировали использование системы PiggyBac транспозона изменить Т-клеток, чтобы выразить ген-репортер (более 4 недель), неиммуногенных ген самоубийства, химерный рецептор антигена для приемных иммунотерапия (более 100 дней), и инженер сопротивление иммуносупрессивных препаратов 7,13-15. Non-вирусные модификации Т-клеток для приемных иммунотерапии и других приложений должны быть намного дешевле и, следовательно, более широко используются, чем ретровирусной трансдукции. Использование новых гиперактивных элементов PiggyBac должна увеличить возможности производства стабильных трансгенов измененные клетки человека T 9. Хотя это и не описанные здесь, можно добиться необходимого числа стабильно трансфицированных Т-клеток для потенциального клинического применения. Используя комбинацию PiggyBac-опосредованного переноса генов и аК562 (искусственная антигенпрезентирующих) фидерных клеток, начальная доходность около 2 х 10 6 стабильно трансфицированные Т-клеток может быть расширена от 4 до 5 журналов в более чем 10 10 трансдуцированных Т-клеток в 4 до 5 недель и до 10 12 в 6 до 7 недель 7. Анализ PiggyBac сайтов интеграции в Т-клетках человека показали, никакой предвзятости по отношению к прото-онкогенов, однако, это было показано пристрастие к интеграции в экспрессируется на высоком уровне генов в активированных Т-клеток при использовании технологии nucleofection описано выше 13. PiggyBac представляет собой перспективный методологии для стабильной генетическая модификация человека Т-клетки для широкого спектра приложений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
СС при частичной поддержке HHMI Med в Град Обучение Грант через TBMM программы. MHW поддерживается частично награду развития карьеры от Департамента по делам ветеранов и щедрой поддержке доктора и миссис Гарольд М. Selzman. Эта работа также была частично поддержана NIH грант лимфомы SPORE P50CA126752 и NIH R01 DK093660.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5015 | |
| Advanced RPMI 1,640 | LifeTechnologies | 12633020 | |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3008803 | |
| GlutaMAX-I Supplement | LifeTechnologies | 35050-061 | |
| Human IL-15 Recombinant Protein | eBioscience | 14-8159 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Amaxa Nucleofector | Lonza | AAD-1001S | |
| Human T Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| CD8-APC | Southern Biotech | 9536-11 | |
| Anti-Human CD3 | eBioscience | 16-0037-81 | |
| Anti-Human CD28 | BD Pharmingen | 555725 | |
| 24 Well Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 353047 | |
| 24 Well Non Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 351147 | |
| Complete T cell media composition 1x Advanced RPMI 1,640 5% Heat Inactivated Fetal Bovine Serum 2 mM GlutamaxIM-I |
|||
References
- Cary, L. C. Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses. Virology. 172 (1), 156 (1989).
- Fraser, M. J. Assay for movement of Lepidopteran transposon IFP2 in insect cells using a baculovirus genome as a target DNA. Virology. 211 (2), 397 (1995).
- Ding, S. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473 (2005).
- Saridey, S. K. PiggyBac transposon-based inducible gene expression in vivo after somatic cell gene transfer. Mol. Ther. 17 (12), 2115 (2009).
- Nakanishi, H. piggyBac transposon-mediated long-term gene expression in mice. Mol. Ther. 18 (4), 707 (2010).
- Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. Jr PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells. Mol. Ther. 15 (1), 139 (2007).
- Nakazawa, Y. Optimization of the PiggyBac transposon system for the sustained genetic modification of human T lymphocytes. J. Immunother. 32 (8), 826 (2009).
- Raja Manuri, P. V. piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for treatment of B-lineage malignancies. Hum. Gene Ther. 21 (4), 427 (2010).
- Doherty, J. E. Hyperactive piggyBac gene transfer in human cells and in vivo. Hum. Gene Ther. , In Press (2011).
- Yusa, K. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (4), 1531 (2011).
- Bonini, C.
- Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. A transposon and transposase system for human application. Mol. Ther. 18 (4), 1531 (2010).
- Galvan, D. L. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. J. Immunother. 32 (8), 837 (2009).
- Nakazawa, Y. PiggyBac-Mediated Cancer Immunotherapy Using EBV-Specific Cytotoxic T-Cells Expressing HER2-Specific Chimeric Antigen Receptor. Mol. Ther. 19 (12), 2133 (2011).
- Huye, L. E. Combining mTor Inhibitors With Rapamycin-resistant T Cells: A Two-pronged Approach to Tumor Elimination. Mol. Ther. 19 (12), 2239 (2011).
- Vera, J. F. Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex). J. Immunother. 33 (3), 305 (2010).
- Kahlig, K. M. Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343 (2010).
