Summary
Vi beskriver en fremgangsmåde til genetisk at modificere primære humane T-celler med et transgen hjælp af ikke-virale
Abstract
The piggyBac transposon system er naturligt aktive, oprindeligt afledt af kålmålerlarve moth 1,2. Denne ikke-viral system er plasmidet baseret, mest almindeligt at anvende to plasmider med en udtrykker piggyBac transposase-enzym og en transposon plasmid, gen (er) af interesse mellem inverterede gentagne elementer, som er nødvendige for gen-overførsel-aktivitet. PiggyBac medierer genoverførsel gennem a "cut and paste"-mekanisme, hvorved transposase integrerer transposonet segmentet i genomet af målcellen (erne) af interesse. PiggyBac har vist effektiv genadministration aktivitet i en lang række forskellige insekt 1,2, pattedyr 3-5, og human cells6 herunder primære humane T-celler 7,8. For nylig blev en hyperaktiv transposase piggyBac genereret forbedring genoverførselseffektivitet 9,10.
Humane T-lymfocytter er klinisk interest til adoptiv immunterapi af kræft 11. Af note, er det første kliniske forsøg med transposon modifikation af humane T-celler ved hjælp af Tornerose transposon systemet blevet godkendt 12. Vi har tidligere undersøgt anvendeligheden af piggyBac som en ikke-viral metode til genetisk modificering af humane T-celler. Vi fandt piggyBac at være effektiv til genetisk modifikation af humane T-celler med et reportergen og en ikke-immunogen inducerbar selvmordsgen 7. Analyse af genomiske integrationssteder afslørede en mangel på præference for integration i eller nær kendte proto-onkogener 13. Vi anvendte piggyBac til gen-modificere cytotoksiske T-lymfocytter til at bære et kimært antigen receptor rettet mod tumorantigen HER2, og fandt, at gen-modificerede T-celler medieret målrettet drab af HER2-positive tumorceller in vitro og in vivo i en orthotopisk musemodel 14. Vi har også anvendt piggyBacat generere humane T-celler resistente over for rapamycin, som skulle være nyttige i cancerbehandling, hvor rapamycin anvendes 15.
Heri, beskriver vi en fremgangsmåde til anvendelse piggyBac at gensplejse primære humane T-celler. Dette omfatter isolering af perifere mononukleære blodceller (PBMC'er) fra humant blod efterfulgt af dyrkning, genetiske modifikation, og aktivering af T-celler. Med henblik på denne rapport blev T-celler modificeret med et reportergen (eGFP) til analyse og kvantificering af genekspression ved flowcytometri.
PiggyBac kan anvendes til at modificere humane T-celler med en række forskellige gener af interesse. Selv om vi har brugt piggyBac at dirigere T-celler til tumorantigener 14, har vi også anvendt piggyBac at tilføje en inducerbar sikkerhedsafbryder for at fjerne gen modificerede celler om nødvendigt 7. Den store lastekapacitet på piggyBac har også muliggjort gen overførsel afen stor rapamycin resistent mTOR-molekyle (15 kb) 15. Derfor præsenterer vi en ikke-viral metode til stabil gen-ændring af primære humane T-celler til en lang række formål.
Protocol
Dag 0
1. Isolering af PBMC'er fra humant blod
- Collect 20 ml frisk humant blod ved hjælp af venepunktur i Na-heparin vacutainerrør.
- Mix blod og Advanced RPMI 1640 i 1:1 (v / v)-forhold.
- Der tilsættes 20 ml Lymphoprep medium til et 50 ml centrifugerør (25 ° C). Langsomt lag 25-30 ml blod-RPMI 1640 blanding oven på lymphoprep.
- Centrifuger ved 400 xg i 40 min uden bremser.
- Saml både distinkte og fuzzy lag ved hjælp af en engangs pipette 10 ml 1x PBS (25 ° C), og rumfanget bringes op til 50 ml med 1x PBS.
- Centrifuger ved 450 x g i 10 minutter.
- Aspirer supernatanten helt og tilsæt 20 ml Advanced RPMI 1.640.
- Centrifuger ved 400 x g i 5 min.
- Aspirer supernatanten. Der tilsættes 10 ml komplette T-celle-medium suppleret med 5 ng / ml rhlL-15 forvarmet ved 37 ° C.
- Tælle antallet af celler og pladen i en 24-brønds vævskulturplade coated plade ved 2 x 10 6 celler / brønd i komplet T-celle-medie suppleret med 5 ng / ml rhlL-15 Tilføj sterilt vand til omgivende brønde. Inkuber natten over i en fugtig inkubator ved 37 ° C, 5% CO2.
Dag 1
2. Coating Plader med anti-CD28 og anti-CD3-antistof til stimulering af T-celler
- Fortynd anti-CD28 og anti-CD3-antistoffer i sterilt vand ved en koncentration på 1 ug / ml hver.
- Der tilsættes 500 pi hver antistofopløsning til 5 mærkede brønde i en ikke-overtrukket vævskultur 24-brønds plade.
- Tilføj sterilt vand til resten af brøndene. Pak pladen i shrink wrap og plads i en 4 ° C køleskab.
3. Nucleofection af ustimulerede T-celler
- Forvarm T-celle-medie ved 37 ° C og supplerer med 5 ng / ml rhlL-15. Forbered komplet nucleofector opløsning ved tilsætning af 500 gl Nucleofector supplement 1 til 2,25 ml af Nucleofector opløsning.
- Aliquot 5 pg hver af transposon (Zeo-pT-CMV-EGFP) og transposase (pCMV-piggyBac) i et 1,5 ml mikrofugerør Bemærk:. kan det være nødvendigt at optimere transposasen og transposon DNA mængde for optimal genafgivelse og for at minimere cellulær toksicitet. Plasmiderne kan fås fra forfatterne ved anmodning.
- Høst PBMC'er fra de 24 brønds vævskulturplade i et 50 ml rør. Tæl antallet af celler. Gem 2 x 10 6 celler til anvendelse som kontrol under flowcytometri.
- Tilsættes 7-10 x 10 6 celler til et 15 ml rør og centrifugeres ved 400 x g, 5 min, aspireres supernatanten og finger-flick pelleten.
- Tilsættes 100 ul T-celle komplet nucleofection løsning til løsnes cellepellet.
- Tilsæt opløsningen-celleblanding til røret indeholdende plasmiderne.
- Tilsæt opløsningen-celle-plasmid blanding til bunden af nucleofection kuvette. Vær forsigtig med ikke at indføre eventuelle bobler.
- Nucleofect cellerne under anvendelse af program U-014 (Ustimulerede T-celler, humane, http://bio.lonza.com/resources/product-instructions/protocols/ ).
- Umiddelbart tilsættes 500 pi forvarmede medier med rhIL-15 til kuvetten. Overføre cellerne til en brønd i en plade med 24 brønde med 1,5 ml forvarmet medium med rhIL15.
- Inkuber natten over i en fugtig inkubator ved 37 ° C, 5% CO2.
Dag 2
4. Ikke-specifik stimulering af T-celler
- Harvest celler og bestemme celletal. Braklægning 0,5 x 10 6 celler til flowcytometri til at bestemme frekvensen af GFP-positive celler. Anvende de ikke-transficerede PBMC'er som kontroller.
- Aspirer CD3/28 antistofopløsning fra den ikke vævsdyrkning overtrukket plade og skyl hver brønd med T-celle-medierne.
- Opblande nucleofected celler ved 0,5 x 10 6 celler pr ml i komplette CTL mediersuppleret med 5 ng / ml rhlL-15. Tilsæt 2,0 ml af hver af de nucleofected celler i 4 brønde i ikke vævskulturplade. Tilsæt 0,5 x 10 6 ikke nucleofected celler til 5. godt.
- Inkubér i 3 dage i en befugtet inkubator ved 37 ° C, 5% CO2.
Dag 5
- Høste de stimulerede T-celler fra den ikke-overtrukne vævskulturplade.
- Tæl og udpladning af cellerne på en 24-brønds overtrukket vævskulturplade ved 0,7 x 10 6 celler / ml i T-celle-medium med 5 ng / ml IL-15.
Dag 7
7. Analyse af genekspression
- Høst cellerne og farves med anti-humant CD8-antistof (kan også anvendes anti-CD3 og anti-CD4) og analysere med flowcytometri for% GFP-ekspression.
Dag 8 (Valgfrit)
8. Ekspansion af T-celler
- På dag 8 efter transfektion, kan T-celler genudpladet i T-Cellemediet med IL-15 ved en densitet på 0,7 x 10 6 celler pr for yderligere ekspansion 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En skematisk viser trinene i en genetisk ændring humane T-lymfocytter med et reportergen (eGFP) er vist i figur 1.. Disse plasmider er tilgængelige efter anmodning fra forfatterne. En schemtic viser trinnene i genetisk modificerede humane T-lymfocytter med et reportergen (eGFP) er showin i fig. 2. Det er nødvendigt at aktivere T-celler for at få dem til at dele sig, udvide og udbreder sig i kultur. Modificerede humane T-celler blev derpå dyrket og analyseret ved hjælp af flowcytometri for genekspression på dag 1 og dag 7. Vist er resultaterne fra en donor i fig. 3. Celler blev farvet med allophycocyanin (APC)-konjugeret anti-CD8, analyseret for eGFP (transgenet) og APC-fluorescens med et FACSCalibur udstyret med filtersæt til 4 fluorescenssignaler ved hjælp Cell Quest software (Becton Dickinson). Vi har tidligere iagttaget genetiske modifikation af både CD4 og CD8 positive T-celler og heri dæmonstrere CD8-positive celler som eksempel 7. Selv om vi analyseret for enkelt transgen ekspression heri, er piggyBac også blevet anvendt til multi-genet (eller multiplekset) gentransfer i humane celler 17. Faldet i eGFP ekspression mellem dag 1 og dag 7 er sandsynligvis skyldes, at ikke alle transficerede celler undergår stabil integration af transposon-DNA.
Fig. 1. Skematisk af plasmider, der anvendes til piggyBac medieret gen modifikation af humane T-celler. CMV, cytomegalovirus promoter, intron, SV40-intron for mRNA-stabilisering, piggyBac, transposase cDNA, SV40 pA, polyadenyleringssted, pUC, replikationsorigin, b-lactamase, ampicillinresistensgen; PB3'IR, piggyBac 3'-inverterede repeat; PB5 ' IR, piggyBac.. 5'-inverteret gentagelse, ZeoR, zeocin resistens gen; R6K Ori, replikationsinitieringssted; IVS, intervenerende sekvens, eGFP, fluorescerende reportergen Bemærk: antibiotika blev anvendt til bakteriel selektion og vækst, men blev ikke anvendt i T-cellekulturer Klik her for at se større figur .
Figur 2. Skematisk beskriver modifikation af primære humane T-celler ved hjælp af piggyBac transposon system.
Figur 3. Stabil transgen ekspression i T-celler modificeret med piggyBac transposonet system. Venstre paneler: eGFP udtryk på dag 1. Højre paneler:. EGFP udtryk på dag 7 Klik her for at se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den heri beskrevne fremgangsmåde giver stabil transgen ændring af primære humane T-lymfocytter. Vi har tidligere testet brugen af piggyBac transposon system til at modificere T-celler til at udtrykke et reportergen (for mere end 4 uger), en ikke-immunogen selvmordsgen, et kimært antigen receptor for adoptiv immunterapi (i mere end 100 dage), og at konstruere modstanden for immunosuppressive lægemidler 7,13-15. Ikke-viral modifikation af T-celler til adoptiv immunterapi og andre anvendelser være meget billigere og derfor mere almindeligt anvendt end retroviral transduktion. Brugen af nye hyperaktive piggyBac elementer bør øge mulighederne for fremstilling af stabil transgen modificeret humane T-celler 9. Selv om det ikke er beskrevet heri, kan man opnå de nødvendige antal stabilt transficerede T-celler til potentiel klinisk anvendelse. Under anvendelse af en kombination af piggyBac-medieret genoverførsel og AK562 (Kunstig antigenudvisende) feederceller, en første udbytte på ca 2 x 10 6 stabilt transficerede T-celler kan udvides ved 4-5 logs til over 10 10 transducerede T-celler i 4-5 uger og 10 12 i 6-7 uge 7. Analyse af piggyBac integrationssteder i humane T-celler viste ingen skævhed til protoonkogener, men det faktisk viste en forkærlighed for integreringen i højt udtrykte gener i aktiverede T-celler ved brug af nucleofection teknologien beskrevet ovenfor 13. PiggyBac repræsenterer en lovende metode til stabil genetisk modifikation af humane T-celler til en lang række anvendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
SS støttes delvis af HHMI Med ind Grad Training Grant gennem TBMM Program. MHW er delvist understøttet af en karriereudvikling pris fra Department of Veterans Affairs og den generøse støtte fra Dr. og Mrs Harold M. Selzman. Dette arbejde blev også delvist understøttet af NIH lymfom SPORE tilskud P50CA126752 og NIH R01 DK093660.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5015 | |
| Advanced RPMI 1,640 | LifeTechnologies | 12633020 | |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3008803 | |
| GlutaMAX-I Supplement | LifeTechnologies | 35050-061 | |
| Human IL-15 Recombinant Protein | eBioscience | 14-8159 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Amaxa Nucleofector | Lonza | AAD-1001S | |
| Human T Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| CD8-APC | Southern Biotech | 9536-11 | |
| Anti-Human CD3 | eBioscience | 16-0037-81 | |
| Anti-Human CD28 | BD Pharmingen | 555725 | |
| 24 Well Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 353047 | |
| 24 Well Non Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 351147 | |
| Complete T cell media composition 1x Advanced RPMI 1,640 5% Heat Inactivated Fetal Bovine Serum 2 mM GlutamaxIM-I |
|||
References
- Cary, L. C. Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses. Virology. 172 (1), 156 (1989).
- Fraser, M. J. Assay for movement of Lepidopteran transposon IFP2 in insect cells using a baculovirus genome as a target DNA. Virology. 211 (2), 397 (1995).
- Ding, S. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473 (2005).
- Saridey, S. K. PiggyBac transposon-based inducible gene expression in vivo after somatic cell gene transfer. Mol. Ther. 17 (12), 2115 (2009).
- Nakanishi, H. piggyBac transposon-mediated long-term gene expression in mice. Mol. Ther. 18 (4), 707 (2010).
- Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. Jr PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells. Mol. Ther. 15 (1), 139 (2007).
- Nakazawa, Y. Optimization of the PiggyBac transposon system for the sustained genetic modification of human T lymphocytes. J. Immunother. 32 (8), 826 (2009).
- Raja Manuri, P. V. piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for treatment of B-lineage malignancies. Hum. Gene Ther. 21 (4), 427 (2010).
- Doherty, J. E. Hyperactive piggyBac gene transfer in human cells and in vivo. Hum. Gene Ther. , In Press (2011).
- Yusa, K. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (4), 1531 (2011).
- Bonini, C.
- Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. A transposon and transposase system for human application. Mol. Ther. 18 (4), 1531 (2010).
- Galvan, D. L. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. J. Immunother. 32 (8), 837 (2009).
- Nakazawa, Y. PiggyBac-Mediated Cancer Immunotherapy Using EBV-Specific Cytotoxic T-Cells Expressing HER2-Specific Chimeric Antigen Receptor. Mol. Ther. 19 (12), 2133 (2011).
- Huye, L. E. Combining mTor Inhibitors With Rapamycin-resistant T Cells: A Two-pronged Approach to Tumor Elimination. Mol. Ther. 19 (12), 2239 (2011).
- Vera, J. F. Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex). J. Immunother. 33 (3), 305 (2010).
- Kahlig, K. M. Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343 (2010).
