Compact Quantum Dots für Einzelmolekül-Imaging

Summary

Wir beschreiben die Herstellung von kolloidalen Quantenpunkten mit minimierter hydrodynamische Größe für Einzel-Molekül-Fluoreszenz-Imaging. Im Vergleich zu herkömmlichen Quantenpunkte sind diese Nanopartikel in der Größe ähnlich zu globularen Proteinen und sind für Einzel-Molekül-Helligkeit, Stabilität gegen Photodegradation und Beständigkeit gegen unspezifische Bindung an Proteine ​​und Zellen optimiert.

Abstract

Single-Molecule Imaging ist ein wichtiges Instrument für das Verständnis der Mechanismen der biomolekularen Funktion und zur Visualisierung der räumlichen und zeitlichen Heterogenität der molekularen Verhaltensweisen, die Zellbiologie ^1-4 zugrunde liegen. Zum Abbilden eines einzelnen Moleküls von Interesse, ist es typischerweise konjugiert an einen fluoreszierenden Marker (Farbstoff, Protein, Kügelchen oder Quantenpunkt) und beobachtet mit Epifluoreszenz oder Totalreflexion Fluoreszenz (TIRF)-Mikroskopie. Während Farbstoffe und fluoreszierende Proteine ​​gewesen die Hauptstütze der Fluoreszenz-Bildgebung Jahrzehnten ist ihre Fluoreszenz unter hohem Photonenflüsse notwendig, einzelne Moleküle zu beobachten instabil, was nur wenige Sekunden der Beobachtung vor dem vollständigen Verlust des Signals. Latexkügelchen und Farbstoff-markierten Kügelchen eine verbesserte Signalstabilität aber auf Kosten drastisch größere hydrodynamische Größe, die nachteilig zu verändern, kann die Diffusion und das Verhalten des untersuchten Moleküls.

ntent "> Quantum Dots (QDs) bieten eine Balance zwischen diesen beiden problematischen Regime. Diese Nanopartikel aus Halbleitermaterialien bestehen und kann mit einem hydrodynamisch kompakte Größe mit außergewöhnlicher Beständigkeit gegen Photodegradation ⁵ konstruiert werden. So ist in den letzten Jahren QDs wurden in ermöglicht instrumental Langzeitbeobachtung von komplexen makromolekularen Verhalten auf der Ebene einzelner Moleküle. Allerdings sind diese Teilchen noch gefunden zu einer Beeinträchtigung der Diffusion in überfüllten molekularen Umgebungen wie dem Zytoplasma und der neuronalen synaptischen Spalt, wo ihre Größen sind immer noch zu groß ^4,6 aufweisen ^{, 7.}

Vor kurzem haben wir die Kerne und Oberflächenbeschichtungen von QDs für minimierte hydrodynamischen Größe ausgelegt, während Balancing Offsets kolloidalen Stabilität, Photostabilität, Helligkeit und unspezifische Bindung, die den Nutzen der kompakten QDs behindert haben in der Vergangenheit ^8,9. Das Ziel dieses Artikels ist es zu zeigendie Synthese, Modifizierung und Charakterisierung dieser optimierten Nanokristalle aus einem legierten Hg _x Cd _1-x Se-Kern mit einer isolierenden Cd _y Zn _1-y S Schale, weiter mit einem mehrzähnigen Liganden mit kurzer Polymer Polyethylenglykol modifiziert beschichtet ist ( PEG)-Ketten (Abbildung 1). Verglichen mit herkömmlichen CdSe-Nanokristalle, bieten Hg _x Cd _1-x Se-Legierungen größer Quantenausbeuten der Fluoreszenz Fluoreszenz bei rotem und nahes Infrarot-Wellenlängen für verbessertes Signal-zu-Rauschen in Zellen, und Anregung bei nicht zytotoxische sichtbaren Wellenlängen. Mehrzähnigen Polymerbeschichtungen binden an den Nanokristalloberfläche in einem geschlossenen und flache Konformation hydrodynamischen Größe zu minimieren, und PEG neutralisiert die Oberflächenladung auf unspezifische Bindung an Zellen und Biomolekülen zu minimieren. Das Ergebnis ist ein hell fluoreszierende Nanokristall mit Emission zwischen 550-800 nm und insgesamt hydrodynamische Größe der Nähe von 12 nm. Dies ist in der same Größenbereich so viele lösliche globuläre Proteine ​​in Zellen, und wesentlich kleiner als bei konventionellen PEGylierte QDs (25-35 nm).

Protocol

Die folgenden Synthese-Verfahren beinhalten Standard luftfreien Techniken und die Verwendung einer Vakuum / Inertgas Verteiler; detaillierte Methode können in Referenzen 10 und 11 gefunden werden. MSDS für alle potenziell toxischen und brennbaren Stoffen sollten vor Gebrauch konsultiert werden und alle brennbaren und / oder Luft-labile Verbindungen sollten in Septum verschlossenen Fläschchen in einem Handschuhfach oder Handschuhsacks aliquotiert werden.

Ein. Synthese von Mercury Cadmium Selenide (Hg _x Cd _1-x Se) Quantum Dot Cores

1. Bereiten Sie eine 0,4 M Lösung von Selen in Trioctylphosphin (TOP). Fügen Selen (0,316 g, 4 mmol) in einem 50 ml-3-Halskolben, dann evakuieren und füllen mit Argon mit einem Schlenk Linie. Unter Luft-freien Bedingungen (trockener Stickstoff oder Argon), 10 ml TOP und Hitze bis 100 ° C unter Rühren für 1 Stunde, um eine klare, farblose Lösung ergeben. Kühlen Sie die Lösung auf Raumtemperatur und stellen Sie die Flasche beiseite.
2. In einem 250-ml-3-Halskolben, fügen Cadmiumoxid (CdO 0,0770 g, 0,6 mmol), Tetradecylphosphonsäure (TDPA, 0,3674 g, 1,32 mmol) und Octadecen (DGL, 27,6 ml) und evakuieren die Lösung mit dem Schlenk Linie unter Rühren. Erhöhen der Temperatur auf 100 ° C und Evakuieren für weitere 15 min auf niedrig siedende Verunreinigungen zu entfernen.
3. Unter Argon oder Stickstoff, erwärmt das Gemisch auf 300 ° C für 1 Stunde vollständig auflösen CdO. Die Lösung wird von einer rötlichen Farbe klar und farblos ändern. Die Lösung wird auf Raumtemperatur.
4. Hinzufügen Hexadecylamin (HDA, 7,0 g) zu der Cadmium-Lösung, erwärmt auf 70 ° C, und zu evakuieren. Sobald ein konstanter Druck erreicht ist, erhöht die Temperatur auf 100-110 ° C und Rückflußtemperatur der Lösung für 30 min. Schalten Sie das Schlenk-Ventil Inertgas und legen Sie das Thermoelement direkt in der Lösung.
5. Unter Luft-freien Bedingungen, fügen Diphenylphosphin (DPP, 100 ul) zu der Lösung und erhöhen die Temperatur auf 310 ° C. Entfernen Sie 7,5 ml der 0,4 M TOP-Se-Lösung(3 mmol Selen) in einem Einweg-Kunststoff-Spritze mit einer 16-Gauge-Nadel.
6. Sobald die Temperatur äquilibriert bei 310 ° C, stellen Sie den Temperaturregler auf 0 ° C und schnell spritzen den TOP-Se-Lösung direkt in die Cadmium-Lösung. Die Lösung wird von farblos bis gelb-orange zu ändern und die Temperatur schnell sinken und erhöhen erneut auf ~ 280 ° C. Nach 1 min Reaktionszeit, entfernen Sie den Kolben aus dem Heizmantel und rasche Abkühlung mit einem Luftstrom, bis die Temperatur weniger als 200 ° C.
7. Wenn die Temperatur ~ 40 ° C erreicht, mit 30 ml Hexan verdünnt, die meisten der verbleibenden Kadmium-Vorläufer wird sich aus der Lösung. Entfernen dieses Präzipitat durch Zentrifugation (5.000 × g, 10 min).
8. In jeder der sechs 50 ml Polypropylen konische Zentrifugenröhrchen, verdünnen 12 ml des rohen Nanokristall-Lösung mit 40 ml Aceton, Zentrifuge (5.000 xg für 10 min), und vorsichtig dekantieren und den Überstand verwerfen.
9. Lösen Sie die nanocrystal Pellets in Hexan (25 ml Gesamtvolumen). Extrahieren diese Lösung 3 mal mit dem gleichen Volumen Methanol, Halten der oberen Phase. Zum dritten Extraktion kann das Volumen von Methanol zu ~ 15 ml eingestellt werden, um eine konzentrierte Lösung von reinem Hexan CdSe QDs bei etwa 200 um zu erhalten. Die typische Ausbeute dieser Reaktion ist 3 pmol von CdSe-Nanokristallen mit einem Durchmesser von 2,3 nm (50-60% Reaktionsausbeute).
10. Bestimmen Sie die Nanokristall Durchmesser und Konzentration durch Messung der UV-Vis-Absorptionsspektrum und Anhörung der Größe sitzende Diagramm der Mulvaney und Kollegen ¹² und die vom Aussterben Korrelationen Bawendi und Mitarbeiter ^13. Siehe Anhang für weitere Details.
11. Mercury Kationenaustausch: die Nanokristalle können teilweise mit Quecksilber ausgetauscht werden, um Rot-Verschiebung der Absorption und Fluoreszenz-Emission. Mischen der folgenden zusammen, um in einem 20 ml Glasfläschchen mit einem Rührstab (diese Reaktion kann wie gewünscht skaliert): 3 ml Hexan, 2 ml Chloroform, 1 ml 200 uM CdSe QD-Lösung (200 nmol), 15 ul Oleylamin (OLA), und 500 ul einer 0,1 M Lösung von Hg (OT) ₂ in Chloroform. Mercury octanethioate (HgOT ₂₎ kann durch Umsetzung Quecksilberacetat und Octanthiol in Methanol (siehe Anhang) hergestellt werden. Da die Kationenaustauschreaktion fortschreitet, kann der Umfang der Rotverschiebung mit UV-Vis-Absorptionsspektrophotometrie überwacht werden. Nachdem die gewünschte Absorptionsbande erreicht ist, Messen der Absorption des Nanokristalls Lösung bei 350 nm und bestimmen den neuen Extinktionskoeffizient der Annahme, dass der Nanokristall Konzentration nicht verändert hat (30,7 uM in diesem Beispiel). Die Reaktion wird durch Entfernen des nicht umgesetzten Quecksilber: 5 ml Decan, 10 ml Hexan und 7 ml Methanol und extrahieren Sie die Lösung, indem die obere Phase, die die Nanokristalle. Auszug zweimal mit Hexan und Methanol, und die Lautstärke von Methanol, so dass die obere Phase ist ~ 7 ml. Wenn die Phasen langsam zu trennen sind, kann die Lösung zentrifugiert (5000 xg werden,10 min). Fügen Sie 100 ul TOP 100 ul OLA und 100 ul Ölsäure zu den Nanokristallen mit 40 ml Aceton, um die Ausfällung zu induzieren. Sammeln Sie die Nanokristalle durch Zentrifugation und verteilen in 3 ml Hexan. Zentrifugieren, um unlösliche Bestandteile zu entfernen und bestimmen den Nanokristall Konzentration wieder unter Verwendung des neuen Extinktionskoeffizienten bei 350 nm auf. Lassen Sie die Nanokristall-Lösung auf das Alter von mindestens 24 Stunden bei Raumtemperatur, bevor Sie den nächsten Schritt.

2. Wachstum von Cadmium Zinksulfid (Cd _y Zn _1-y S) Shell

1. Bereiten 0,1 M-Schale Precursorlösungen in 50 ml 3-Hals-Kolben. Cadmium Vorläufer: Cadmiumacetat Hydrat (230,5 mg, 1 mmol) und 10 ml Oleylamin (OLA). Zinkvorläufer: Zinkacetat (183,5 mg, 1 mmol) und 10 ml OLA. Sulfur Vorstufe: Schwefel (32,1 mg, 1 mmol) und 10 ml ODE. Unter Vakuum erwärmt jede Lösung bis zum Rückfluss für 1 Stunde, um klare Lösungen ergeben, und dann kostenlos mit Argon. Die Lösung kann Schwefelauf Raumtemperatur abgekühlt werden, wobei die Cadmium-und Zink-Vorläufer werden bei ca. 50 ° C gehalten Berechnungen von Shell Vorstufe Mengen können in Bezug 14 gefunden werden.
2. Zu einer 3-Halskolben: Hg _x Cd _1-x Se QD (120 nmol, 2,3 nm Durchmesser), DGL (2 ml) und Trioctylphosphinoxid (TOPO, 250 mg). Evakuierung aus dem Hexan bei Raumtemperatur mit der Schlenk Linie. Erhöhen der Temperatur auf 100 ° C und Rückfluß für 15 min. Ändern Sie den Schlenk-Ventil Argon oder Stickstoff und legen Sie die Thermoelement in der Nanokristall-Lösung.
3. Erhöhen Sie die Temperatur auf 120 ° C, mit 0,5 Monolagen von Schwefel Precursorlösung (140 ul), und lassen Sie die Reaktion für 15 min gehen. Kleine Aliquots (<50 ul) kann unter Verwendung einer Glasspritze, um den Fortschritt der Reaktion unter Verwendung von Fluoreszenz und / oder UV-Vis-Absorptionsspektrophotometrie überwachen. Erhöhen Sie die Temperatur auf 140 ° C, mit 0,5 Monolagen von Cadmium Precursorlösung (140 ul) und um die Reaktion für 15 min gehen. Fügen Sie 500 ul wasserfreiem OLA zu der Reaktionslösung.
4. Bei 160 ° C mit 0,5 Monolagen von Schwefel Precursorlösung (220 ul) durch eine gleiche Menge Zink Precursorlösung bei 170 ° C mit 15 min zwischen jeder Zugabe. Dann bei 180 ° C hinzuzufügen 0,25 Monoschichten von Schwefel Vorläuferlösung (150 ul) und Zinkvorläufer Lösung in 15 min Intervallen.
5. Man kühlt die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt und erneut berechnet eine neue Extinktionskoeffizienten für diese Teilchen unter Verwendung eines UV-Vis-Spektrum, unter der Annahme, dass die Anzahl von Nanokristallen nicht geändert hat (120 nmol in 3,8 ml Reaktionslösung). Speichern die Reaktionslösung als Rohgemisch in einem Gefrierschrank, die Nanokristalle kann aufgetaut und gereinigt werden nach Bedarf unter Verwendung desselben Verfahrens in den Abschnitten 1.8 und 1.9 beschrieben.
6. Die Nanokristalle kann dadurch mittels Elektronenmikroskopie, UV-Vis-Absorption-Spektroskopie und Fluoreszenz-Spektroskopie werden. Quantenausbeute kannabsolut Verwendung eines Ulbricht-Kugel oder relativ im Vergleich zu einem bekannten Standard unter Verwendung der Verfahren von Referenz 15 berechnet.

3. Phase Transfer

1. Zugabe von gereinigtem Core / Shell Hg _x Cd _1-x Se / Cd _y Zn _1-y S QDs (5 ml, 20 uM) zu einem 50 ml 3-Halskolben und Entfernen des Hexans unter Hochvakuum, um einen trockenen Film zu ergeben. Füllen des Kolbens mit Argon, hinzuzufügen wasserfreiem Pyridin (3 ml) zu dem Nanoteilchenfilm und Wärme die Aufschlämmung auf 80 ° C. Im Laufe von 1 bis 2 h die Nanopartikel vollständig aufzulösen.
2. Add 1-Thioglycerin (1 ml) zu der Lösung zugegeben und bei 80 ° C für 2 Stunden. Dann kühlen die Lösung auf Raumtemperatur und fügen Triethylamin (0,5 ml) Thioglycerin deprotonieren. Rühre 30 Minuten. Die Lösung kann sich nach der Zugabe von Triethylamin aufgrund der schlechten Löslichkeit polarer Nanokristalle in diesem Lösungsmittelgemisch bewölkt.
3. Übertragen Sie die QD-Lösung in einem 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen containing eine Mischung aus 20 ml Hexan und 20 ml Aceton und gut mischen. Isolieren Sie die gefällten Nanokristalle durch Zentrifugation (5.000 xg, 10 min), und waschen Sie das Pellet mit Aceton.
4. Man löst den QD Pellet in DMSO (5 ml) mit Bad Ultraschallbehandlung, und dann zentrifugiert (7000 × g, 10 min), um mögliche Aggregate zu entfernen. Ermitteln der Konzentration Nanopartikel aus einem UV-Vis-Absorptionsspektrum. Diese Lösung des reinen QDs sollte innerhalb von 3 h verwendet werden, da die Oberfläche Thiole können langsam unter Umgebungsbedingungen an der Luft oxidieren.
5. Verdünnen Sie die QD-Lösung bis 10 uM oder weniger mit DMSO und übertragen auf eine 50 ml Flasche. Bereiten Sie eine 5 mg / ml Lösung von thiolierten Polyacrylsäure (Synthese in Anhang beschrieben) in DMSO. Hinzufügen der Polymerlösung (0,15 mg Polymer pro nmol QDs) tropfenweise zu der Lösung unter Rühren QD und entgast die Lösung bei Raumtemperatur für 5 min.
6. Bereinigen des QD / Polymer-Lösung mit Argon und auf 80 ° C für 90 min. Dann kühlen die Lösung auf Raumtemperatur eind tropfenweise das gleiche Volumen von 50 mM Natriumborat, pH 8. Rühre 10 Minuten.
7. Reinigen die QDs mittels Dialyse (20 kDa Cutoff) in 50 mM Natriumborat, pH 8, und dann konzentrieren sich die Partikel mit einem Zentrifugen-Filtereinheiten (10 kDa Cutoff). Bestimmung der Konzentration von einem UV-Vis-Absorptionsspektrum.

4. PEG Coating

1. In einem 4 ml Glasfläschchen mit einem Rührstab, mischen 1 nmol QDs in Boratpuffer mit einem 40.000 x molaren Überschuss von 750 Da mono-Polyethylenglykol (30 mg, 40 pmol). Wenn eine bestimmte chemische Funktionalität ist den Nanokristallen (zB Hydrazid oder Maleimid) zugesetzt werden, kann es durch Ersetzen eines Anteils der Amino-PEG mit einem heterobifunktionellen Amino-PEG (30% Stoffmengenanteil typischerweise gut funktioniert) eingeführt werden. Verdünnen Sie die Nanokristall-Lösung zu 1 uM mit Boratpuffer. Diese Reaktion kann beliebig skaliert werden.
2. Bereiten Sie eine frische Lösung von DMTMM (20 mg, 72 mmol) in DMSO (144 ul). Diese Lösung kann kurzzeitig erhitzt werden unter einen Strom von warmem Leitungswasser oder untergetaucht in einem Ultraschallbad vollständig auflösen DMTMM. Schnell eine 25.000 x molaren Überschuss dieser 0,5 M DMTMM Lösung (50 ul) der QD-Lösung zugegeben und bei Raumtemperatur für 30 min.
3. Wiederholen Sie Schritt 4,2 vier weitere Male, um den Nanokristall Oberfläche mit PEG zu sättigen. Schließlich, fügen Sie 200 ul 1 M Tris-Puffer, um die Reaktion zu stoppen und Reinigung der Nanokristalle mittels Dialyse, zentrifugale Filter oder Ultrazentrifugation.
4. Die Nanokristalle kann Monodispersität, hydrodynamische Größe und Oberflächenladung mit Flüssigkeitschromatographie, Agarose-Gelelektrophorese, und Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Hydrodynamische Größe und Größenverteilung mit einem automatisierten Flüssigkeits-Chromatographie-System (GE AKTAprime Plus) zu bestimmen, verwenden eine Superose 6 Säule, einer Flussrate von 0,5 ml / min mit PBS-Puffer Eluent und Absorption Detektion bei 260 oder 280 nm beträgt. Vergleichen Nanopartikel Elutionszeiten mit denen von Molekulargewichtsstandards. Für Agarosegel ElektrophoreseWider bereiten ein 0,5% iges Agarosegel in 50 mM Natrium-Borat-Puffer (pH 8,5) oder 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,4), 1 pM mischen Proben mit 10% Glycerin und Last in Bohrlöcher, und führen bei 100 V für 30 min . Bild der Nanokristalle in dem Gel mit Hilfe eines UV Hand Zauberstab oder UV-Transilluminator und Fluoreszenzanregung. Um das Bild der Nanokristalle auf der Ebene einzelner Moleküle mittels Fluoreszenzmikroskopie, verdünnen die Partikel bis 0,2 nM in 10 mM Phosphat-Puffer, fallen 2,5 ul der Lösung auf einem Deckglas, und vorsichtig ein zweites Deckglas auf der Oberseite des flüssigen Kügelchen zu verbreiten ein Film zwischen den Deckgläsern. Bild der Oberfläche gebundenen Partikel mit einer hohen numerischen Apertur Objektiv (idealerweise mindestens 1,40) oder in beiden Epifluoreszenz TIRF-Modus mit einer Anregung bei Wellenlängen zwischen 400 bis 580 nm und einer Elektronen-multiplizierenden CCD-Kamera. Exact Bildparameter werden zwischen Mikroskopie Setup variieren.

Representative Results

2 zeigt repräsentative Absorptions und Fluoreszenzspektren für CdSe-Nanokristalle, Hg _x Cd _1-x Se-Nanokristallen nach Kationenaustausch und Hg _x Cd _1-x Se / Cd _y Zn _1-y S-Nanokristallen auf Granate Wachstum. Die Kern CdSe-Nanokristalle eine Quantenausbeute der Fluoreszenz der Nähe von 15% (einschließlich langwelligen tief-Trap-Emission), aber dieser Wirkungsgrad sinkt auf weniger als 1% nach Quecksilber Austausch, wahrscheinlich aufgrund Träger Traps durch eine Oberflächen-Atom Unterbrechungen ⁹ eingeführt aufzuladen. Jedoch das Wachstum einer dünnen Hülle aus Cd _y Zn _1-y S steigert diese Effizienz um mehr als 70%, die weitgehend nach der Übertragung in Wasser (50% ist typisch) aufrechterhalten wird. Im Gegensatz dazu verlieren CdSe / Cd _y Zn _1-y S-Nanokristalle ohne Quecksilber Einarbeitung einen wesentlichen Bruchteil ihrer Quantenausbeute in Wasser nur eine dicke Schale gezüchtet wird. Somit durch Einbringen von Quecksilber in den Kern nanocrystal, die geringe Größe der Nanokristalle können beibehalten (siehe TEM in Abbildung 3), ohne dabei die Helligkeit erfolgen. Es ist wichtig anzumerken, dass Verkappen mit Cd _y Zn _1-y S verschiebt die Spektren an die rote durch Leckage der elektronischen Ladungsträger in die Hüllenmaterial; diese Verschiebung etwa 20 bis 30 nm für CdSe Kerne ¹⁶ und nimmt mit Erhöhung Quecksilbergehalt in dem Kern (bis 100 nm).

Die Verwendung eines 2-Phasen-Transfer-Schritt zu Wasser ist entscheidend, um eine homogene Population von Nanokristallen, die keine weiteren Größenverteilung auf Cluster und Aggregate zu entfernen. Im ersten Schritt werden die Nanokristalle übertragen DMSO unter Verwendung von 1-Thioglycerin, die Oleylamin verdrängt an der Oberfläche des Nanokristalls. Thioglycerin wird dann mit einem linearen mehrzähnigen Polymer ersetzt, was zu einer äußerst stabilen Teilchen mit einem minimalen Anstieg der hydrodynamischen Größe, die aus der organischen Beschichtung (<4 nm contributiauf dem hydrodynamischen Durchmesser). Das Größenausschluß-Chromatogramm in 4a dargestellt wird bestätigt, dass die Größe ähnlich der von Conalbumin (75 kDa) ist, und nach der Änderung mit 750 Da Amino-PEG, die Größe wird auf 12 nm erhöht, ähnlich derjenigen eines IgG-Antikörpers . PEG-Modifizierung neutralisiert die Oberflächenladung, wie in der Agarosegelelektrophorese Experiment in 4b dargestellt bestätigt. Wir verwenden routinemäßig Größenausschlusschromatographie und Gelelektrophorese für die schnelle Charakterisierung von Größe, Größenverteilung und Oberflächenladung. Dynamische Lichtstreuung und Zeta Potentiometrie können ebenfalls verwendet werden, aber der Streuquerschnitt dieser ultrakleine Teilchen ist sehr klein, und wir haben festgestellt, dass die Ergebnisse von kommerziellen Instrumenten nicht reproduzierbar sind. 5a zeigt eine Mikroaufnahme Epifluoreszenz dieser Nanokristalle abgeschieden auf einem Deckglas und begeistert mit 545 nm sichtbares Licht. Diese Nanokristalle werden leicht o. bserved an der Einzel-Molekül-Ebene bei 30 Bildern pro Sekunde mit einer Elektronen-vermehrenden CCD-Kamera 5b zeigt, dass die Zahl der fluoreszierenden Partikel in jedem Frame beobachtet im Laufe der Zeit mit einer kontinuierlichen Anregung schwankt, dies ist durch eine Kombination von blinkenden und Photodegradation . Blinking dominiert zum ersten ~ 7 min vor der oxidativen photochemischen langsam deutlich.

Abbildung 1. Schematische Darstellung der Synthese von Nanopartikeln Verfahren. (A) Kadmium und Selen Vorstufen reagieren, um CdSe-Nanokristalle, die mit Quecksilber octanethiolate behandelt werden, Induzieren partieller Cd → Hg Kationenaustausch zu Hg _x Cd _1-x Se ternäre Legierung Nanokristalle Ausbeute erzeugen. Eine Hülle aus Cd _y Zn _1-y S wird dann auf dem Kern mit Cadmium, Zinkacetat und Schwefel gewachsen. (B) Als synthesized werden diese Nanokristalle mit unpolaren organischen Liganden (Oleylamin) beschichtet. Um diese Partikel in wässrigen Puffern löslich zu machen, werden die Liganden mit einem mehrzähnigen Liganden Polymer, das kovalent an Amino-PEG gekoppelt wird ersetzt.

Abbildung 2. Optische Eigenschaften von Hg _x Cd _1-x Se / Cd _y Zn _1-y S-Nanokristalle. (A) Absorption (schwarz) und Fluoreszenzspektren (rot) von CdSe Nanokristall Kerne, Hg _x Cd _1-x Se Kerne nach Kationenaustausch und Hg _x Cd _1-x Se / Cd _y Zn _1-y S-Nanokristalle nach Shell Wachstum . Spektren wurden der Übersichtlichkeit halber (b) Fluoreszenz-Spektren von Hg _x Cd _1-x Se / Cd _y Zn _1-y S mit unterschiedlichen relativen Mengen an Quecksilber Einarbeitung versetzt. Das blaue Spektrum zeigt Kerne mit Null Quecksilbergehalt (x = 0, CdSe).

Abbildung 3. Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahme (a) und Teilchengrößenverteilung (b) Hg _x Cd _1-x Se / Cd _y Zn _1-y S-Nanokristalle, die einen durchschnittlichen Durchmesser ± Standardabweichung von 3,2 ± 0,6 nm auf.

Abbildung 4. Hydrodynamische Charakterisierung Hg _x Cd _1-x Se / Cd _y Zn _1-y S QDs in wässriger Lösung. (A) Größe Chromatogramm von Nanokristallen in einem mehrzähnigen Liganden Polymer vor (rot) und nach (blau) Konjugation an Amino-PEG beschichtet. Molekulargewicht Protein-Standards sind über den Plots angegeben. (B) Agarosegelelektrophorese Experiment der QDs in Natriumboratpuffer (pH ~ 8,5) vor (links) Und nach (rechts) Konjugation an Amino-PEG. Die Vertiefung wird mit einem Pfeil und Elektrodenpolaritäten sind rechts angegeben markiert, die zeigen, dass vor der Konjugation die Nanokristalle als anionische Teilchen und die Nanokristalle PEGylierte elektrostatisch neutral sind migrieren.

Abbildung 5. Hg _x Cd _1-x Se / Cd _y Zn _1-y S QD auf einem Deckglas in Phosphatpuffer mit Epifluoreszenzmikroskopie abgebildet adsorbiert. (A) QD Bild bei 33 Frames pro Sekunde erhalten. Das Bild ist 15 um x 15 um. (B) Anzahl der fluoreszierenden QDs je Sichtfeld bei kontinuierlicher Beleuchtung für 20 min mit Quecksilber-Bogenlampe mit 545 nm (30 nm Bandpass) Anregungsfilter und ein 625 nm (20 nm Bandpass) Emissionsfilter und 100x 1,4 NA Ziel. Messungen von 3 Sichtfelder wurden über 20 min bei 12,5 Frames pro Sekunde gemittelt.

Discussion

Im Vergleich zu herkömmlichen CdSe Quantenpunkten, können ternäre Legierung Hg _x Cd _1-x Se-Nanokristalle in der Größe und Fluoreszenzwellenlänge unabhängig eingestellt werden. Die Größe wird zuerst während der Synthese von CdSe Nanokristall Kernen ausgewählt und der Fluoreszenzwellenlänge in einem sekundären Quecksilber Kationenaustauschschritt, welche im Wesentlichen nicht verändern die Nanokristallgröße ⁹ übernommen. Es ist wichtig, damit das gereinigte Hg _x Cd _1-x Se-Nanokristalle bei Raumtemperatur für mindestens 24 Stunden inkubiert, bevor Capping. Dies ermöglicht einige der schwach adsorbierten Quecksilber Kationen in den Nanokristall Gitter diffundieren. Ohne daß dieser Prozeß auftritt, eine zweite Fluoreszenz im nahen Infrarotbereich wird oft beobachtet, durch homogene Keimbildung von HgS Nanokristalle aus dissoziierten Quecksilberionen.

In dem Beispiel in dieser Arbeit gezeigt, stellten wir CdSe Kerne mit einer Größe in der Nähe 2,3 nm, was sein kannabgestimmt in der Fluoreszenz zwischen 550 bis 800 nm nach dem Verschließen durch die Veränderung der Menge des Quecksilbers in die Core-Gitter eingebaut. Mit einem 2,5 Monoschicht Schale, war die endgültige Durchmesser dieser QDs in der Nähe 3,2 nm, die im Wesentlichen die kleinste Größe Nanopartikel, die wir vorbereiten, dh sowohl ausreichend lichtstabil und ausreichend hell für Einzel-Molekül-Imaging (Extinktionskoeffizient Nähe 350.000 M ^-1 cm ^-1 bei 400 nm und Quantenausbeute nahe 50% in Wasser). Diese Nanokristalle sind wesentlich heller und photostabil als zuvor beschrieben Nanokristalle mit vergleichbarer Größe, die über diesem Spektralbereich (zB CdTe, InAs, InP) emittieren. Wie die meisten Fluorophore, ist die Fluoreszenz von diesen Teilchen an der Ebene einzelner Moleküle intermittierende (blinkend) ^5,6.

Für einige Anwendungen kann es vorteilhaft sein, etwas größer Nanokristalle verwendet werden. Durch die Verwendung eines größeren CdSe Nanokristall als Kern, die Fluoreszenz bandwidth ist schmaler nach Quecksilber Kationenaustausch. Typische Fluoreszenzpeak Breiten für Hg _x Cd _1-x Se-Nanokristalle mit Emission im 600-650 nm-Fenster sind 50-70 nm für 2,3 nm Kerne und 40-50 nm für 3,2 nm Kerne. Dabei ermöglichen größere Nanokristalle eine größere Kapazität zur spektralen Multiplexing. Darüber hinaus wird eine Erhöhung der Größe ebenfalls die Resorption Querschnitt der Nanokristalle. Die Erhöhung der Dicke der CdS Zwischenbericht Hüllschicht wird auch die Helligkeit zu erhöhen, und weiter zu verlängern die Fluoreszenz Stabilität während der Anregung. Die CdSe Kerngröße kann einfach durch die Verlängerung der Dauer des CdSe Kern Synthese, und Überwachen der effektiven Größe durch UV-Vis-Absorptionsspektrophotometrie erhöht werden.

Wir haben gefunden, dass wässrige QDs mit Carbonsäuren beschichtet anfällig für unspezifische Adsorption an Zellen und Proteine ​​sind, und dass die Neutralisation der starken negativen Ladung in physiologischen Puffern ist critical zur Minimierung unspezifischer Wechselwirkungen ^17. In den Beispielen hier verwendeten wir kurzkettigen PEG, um die Oberflächenladung zu neutralisieren und Aufrechterhaltung der Stabilität in Wasser. PEG kann in das Polymer-Rückgrat entweder vor Befestigung an den QDs oder nach der Beschichtung eingeführt werden. Beide Verfahren führen zu fast neutralen Teilchen, aber die ersten beschichteten mit der Carboxyl-Polymer wesentlich kleiner sind, vermutlich aufgrund verbesserter mehrzähnigen Wechselwirkung mit der Oberfläche. Zur vollständigen Neutralisation mit PEG Oberfläche haben wir gefunden, daß wiederholte Addition von Carbonsäure aktivierende Agenzien notwendig aufgrund der kurzen Halbwertszeit der reaktiven Spezies ist. Wir verwenden DMTMM an die Stelle häufiger Carbodiimidreagenzien (zB EDC) aufgrund der verbesserten Stabilität bei der Lagerung und DMTMM aufgrund verbesserter Reaktionseffizienz in Wasser ^18.

Schließlich ist es wichtig zu beachten, dass Quantenpunkte und viele andere Arten von Nanokristallen enthaltenzytotoxische Elemente ^5. Cadmium und Quecksilber-Ionen können auf die normalen Prozesse der lebenden Zellen und Organismen und können krebserregend ^19-21 sein. Doch die Zytotoxizität von herkömmlichen CdSe / ZnS Nanokristalle wurde weitgehend untersucht, und es wurde berichtet, dass robust beschichteten Nanokristallen mit stabilen organischen Liganden nicht hervorrufen offen zytotoxische Reaktionen im Vergleich zu ihren konstituierenden Elemente einfach, weil ihre toxische Elemente effizient entfernt von Oxidationsmitteln sequestriert ^5. Außerdem für Einzel-Molekül bildgebende Anwendungen sind kaum toxische Wirkungen aufgrund der extrem geringen Konzentrationen zum Abbilden (typischerweise 1 nM oder weniger), die um Größenordnungen kleiner ist als der Beginn der nachweisbaren toxischen Wirkungen (50-100 nm) eingesetzt. Die meisten der Einzel-Molekül-Experimenten Umsetzung QDs haben bisher handelsüblichen CdSe / ZnS Nanokristalle, die wesentlich größer als diejenigen, die hierin beschrieben sind verwendet werden. Durch die Minimierung der nanocrystal Größe werden die Gesamtzahl der Oberflächenatome pro Partikel und der Gesamtzahl der toxischen Atomen pro Partikel wesentlich reduziert, wodurch die Gesamt-Potential für toxikologische Auswirkungen. Der Einbau von Quecksilber in die Nanokristall soll weiter reduzieren Toxizitätspotenzial als zweiwertigem Quecksilber bekanntermaßen weniger toxisch als zweiwertige Cadmium in vielen Zelltypen ^19-21.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Selenium	Sigma-Aldrich	229865
Tri-n-octylphosphine	Strem	15-6655	97% pure, unstable in air
Cadmium oxide	Sigma-Aldrich	202894	Highly toxic: use caution
Tetradecylphosphonic acid	PCI Synthesis	4671-75-4
Octadecene	Alfa Aesar	L11004	Technical grade
Hexadecylamine	Sigma-Aldrich	H7408
Diphenylphosphine	Sigma-Aldrich	252964	Pyrophoric
Mercury acetate	Sigma-Aldrich	456012	Highly toxic: use caution
1-Octanethiol	Sigma-Aldrich	471836	Strong odor
Oleic acid	Sigma-Aldrich	W281506
Zinc acetate	Alfa Aesar	35792
Cadmium acetate hydrate	Sigma-Aldrich	229490	Highly toxic: use caution
Oleylamine	Fisher Scientific	AC12954	Unstable in air
Sulfur	Sigma-Aldrich	344621
Trioctylphosphine oxide	Strem	15-6661	99%
Pyridine	VWR	EM-PX2012-6	Anhydrous
Thioglycerol	Sigma-Aldrich	M1753	Strong odor
Triethylamine	Sigma-Aldrich	471283	Anhydrous
Dialysis tubing	Spectrum Labs	131342	20 kDa cutoff
Centrifugal filter	Millipore	UFC801024	10 kDa cutoff
Monoamino-PEG	Rapp Polymere	12 750-2	750 Da
DMTMM, 4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride hydrate	Alfa Aesar	H26333
AKTAprime Plus Chromatography System	GE HealthCare
Superose 6 10/300 GL chromatography column	GE HealthCare	17-5172-01
Agarose, OmniPur	VWR	EM-2120
Appendix Synthesis of mercury octanethiolate: Slowly add a methanol solution of mercury acetate (1 eq.) to a stirring solution of 1-octanethiol (3 eq.) and potassium hydroxide (3 eq.) in methanol at room temperature. Isolate the mercury(II) octanethiolate precipitate via filtration, wash two times with methanol and once with ether, and then dry under vacuum. Synthesis of multidentate polymer: Dissolve polyacrylic acid (1 g, 1,773 Da) in 25 ml dimethylformamide (DMF) in a 150 ml three-necked flask and bubble with argon for 30 min. Add an anhydrous solution of cysteamine (374 mg, 4.87 mmol) in 10 ml DMF. At room temperature with vigorous stirring, slowly add anhydrous diisopropylcarbodiimide (DIC, 736 mg, 5.83 mmol) over 30 min, followed by triethylamine (170 μl, 1.22 mmol), and allow the reaction to proceed for 72 hr at 60 °C. Add mercapt–thanol (501 mg, 6.41 mmol) to quench the reaction, and stir for 2 hr at room temperature. Remove DMF via rotary evaporation and isolate the polymer with the addition of a 2:1 mixture of ice-cold acetone:chloroform, followed by centrifugation. Dissolve the polymer in ~5 ml anhydrous DMF, filter, precipitate again with diethyl ether, and repeat. Dry the product under vacuum and store under argon. Determination of CdSe core diameter: From the UV-Vis absorption spectrum determine the wavelength of the first exciton peak (λ, in nm), which is the longest-wavelength peak (e.g. roughly 498 nm for CdSe in Figure 2a), and use the sizing curve of Mulvaney and coworkers 12: Determination of CdSe nanocrystal concentration: From a background-subtracted UV-Vis spectrum of an optically clear solution of CdSe nanocrystals, determine the absorption at 350 nm wavelength. Serial dilutions can be used to determine if the optical absorption is within the linear range of Beer's Law. The nanocrystal concentration (QD, in M) can be determined by plugging in the nanocrystal diameter (D, in nm), the optical absorption value (A3sa), and the cuvette path length (l, in cm) into the following equation from the empirical correlation of Bawendi and coworkers 13: