Kompakte Quantum Dots for Single-molekyle Imaging

Summary

Vi beskriver fremstillingen af ​​kolloide kvantepunkter med minimeret hydrodynamiske størrelse for enkelt-molekyle fluorescensimagografi. Sammenlignet med konventionelle kvantepunkter, disse nanopartikler har samme størrelse til globulære proteiner og er optimeret til enkelt-molekyle lysstyrke, stabilitet mod fotonedbrydning, og resistens over for ikke-specifikke binding til proteiner og celler.

Abstract

Single-molekyle billeddannelse er et vigtigt redskab til at forstå mekanismerne i biomolekylær funktion og til at visualisere den rumlige og tidsmæssige heterogenitet af molekylære adfærd, der ligger til grund for cellebiologi ^1-4. At afbilde et enkelt molekyle af interesse, er det typisk konjugeret til et fluorescerende mærke (farvestof, protein, perle eller kvantepunktet) og observeret med epifluorescens eller total intern refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi. Mens farvestoffer og fluorescerende proteiner har været grundpillen i fluorescensimagografi i årtier, deres fluorescens er ustabil ved høje foton flusmidler nødvendige for at besigtige individuelle molekyler, hvilket gav kun få sekunder til observation inden fuldstændigt tab af signal. Latex perler og farvestof-mærkede perler giver forbedret signal stabilitet, men på bekostning af en drastisk større hydrodynamisk størrelse, der kan skadelig ændre udbredelse og opførsel af molekylet under studiet.

ntent "> Kvantepunkter (QDs) tilbyder en balance mellem disse to problematiske regimer. Disse nanopartikler er sammensat af halvledermaterialer og kan konstrueres med en hydrodynamisk kompakt størrelse med enestående modstand mod fotonedbrydning ^5. således i de senere år QDs har været medvirkende muligt langvarig observation af komplekse makromolekylære adfærd på enkelt molekyle niveau. Men disse partikler er stadig vist sig at udvise nedsat diffusion i overfyldte molekylære miljøer såsom cellulære cytoplasma og den neuronale synaptiske kløft, hvor deres størrelser er stadig for stor ^{4,6 , 7.}

For nylig har vi udviklet kernerne og overfladebelægninger af QDs for minimeret hydrodynamisk størrelse, samtidig med at afbalancere forskydninger til kolloid stabilitet, fotostabilitet, lysstyrke og uspecifik binding, der har hindret nytten af kompakte QDs i fortiden ^8,9. Målet med denne artikel er at demonstreresyntesen, modifikation og karakterisering af disse optimerede nanokrystaller, der består af et legeret Hg _x Cd _1-x Se kerne overtrukket med et isolerende Cd _y Zn _1-y S shell, overtrækkes yderligere med et multidentat polymer ligand modificeret med korte polyethylenglycol ( PEG) kæder (fig. 1). Sammenlignet med konventionelle CdSe nanokrystaller, tilbyder Hg _x CD _{1-x SE} legeringer større kvantumudbytter af fluorescens, fluorescens ved røde og nærinfrarøde bølgelængder til forbedret signal-støj i celler, og excitation ved ikke-cytotoksiske synlige bølgelængder. Multidentate polymercoatinger binder til nanocrystal overfladen i en lukket og flad konformation for at minimere hydrodynamiske størrelse, og PEG neutraliserer overfladeladning for at minimere ikke-specifikke binding til celler og biomolekyler. Slutresultatet er en lyst fluorescerende nanocrystal med emission mellem 550-800 nm og en total hydrodynamisk størrelse nær 12 nm. Dette er i same størrelsesområde så mange opløselige globulære proteiner i celler og betydeligt mindre end konventionelle PEGylerede QDs (25-35 nm).

Protocol

De følgende syntesefremgangsmåder kræve ensartede luftfrie teknikker og anvendelse af et vakuum / inaktiv gas manifold; detaljeret metode kan findes i referencer 10 og 11.. MSDS for alle potentielt giftige og brandfarlige stoffer bør høres før brug og alle brændbare og / eller luft-labile forbindelser bør inddelt i delprøver i septum-forseglede hætteglas i en handskekasse eller handske taske.

1. Syntese af kviksølv, cadmium selenid (Hg _x Cd _1-x Se) kvantepunktet Cores

1. Forbered en 0,4 M opløsning af selen i trioctylphosphine (TOP). Tilsættes selen (0,316 g, 4 mmol) til en 50 ml 3-halset kolbe, og derefter evakuere og fylde med argon under anvendelse af en Schlenk linie. Under luftfrie betingelser (tør nitrogen eller argon-atmosfære), tilsættes 10 ml TOP og opvarmes til 100 ° C under omrøring i 1 time til opnåelse af en klar, farveløs opløsning. Opløsningen afkøles til stuetemperatur og indstilles kolben til side.
2. Til en 250 ml 3-halset kolbe, cadmiumoxid tilsættes (CdO 0,0770 g, 0,6 mmol), tetradecylphosphonic acid (TDPA, 0,3674 g, 1,32 mmol), og octadecen (ODE, 27,6 ml), og evakuere opløsningen under anvendelse af en Schlenk linie under omrøring. Hæve temperaturen til 100 ° C og evakueres yderligere 15 minutter for at fjerne lav kogepunkt urenheder.
3. Under argon eller nitrogengas, og blandingen opvarmes til 300 ° C i 1 time til fuldt ud at opløse CdO. Opløsningen skifter fra en rødlig farve til klar og farveløs. Opløsningen afkøles til stuetemperatur.
4. Tilføj hexadecylamin (HDA, 7,0 g) til cadmium opløsningen, opvarmes til 70 ° C, og evakuere. Når et konstant tryk er nået, hæve temperaturen til 100-110 ° C og tilbagesvaling af opløsningen i 30 minutter. Skifte Schlenk line-ventil til inert gas og indsætte termoelement direkte i opløsningen.
5. Under luftfrie betingelser, tilsættes diphenylphosphin (DPP, 100 pi) til opløsningen, og hæve temperaturen til 310 ° C. Fjern 7,5 ml af 0,4 M TOP-Se opløsning(3 mmol selen) i et engangs-plastsprøjte fastgjort til en 16 gauge nål.
6. Når temperaturen ækvilibrerer ved 310 ° C, indstilles temperaturregulator til 0 ° C og hurtigt sprøjt TOP-Se opløsning direkte ind i cadmium opløsningen. Opløsningen skifter fra farveløs til gul-orange, og temperaturen vil hurtigt falder og stiger igen til ~ 280 ° C. Efter 1 minutters omsætning, fjernes kolben fra varmekappe og hurtigt afkøles med en strøm af luft, indtil temperaturen er under 200 ° C.
7. Når temperaturen når -40 ° C, fortyndes med 30 ml hexan; meste af den resterende cadmium forstadiet vil udfældes fra opløsning. Fjern dette præcipitat ved hjælp af centrifugering (5000 x g, 10 min).
8. I hver af seks 50 ml polypropylen konisk centrifugerør, fortyndes 12 ml af det rå nanocrystal opløsning med 40 ml acetone, centrifugeres (5000 x g i 10 minutter), og forsigtigt dekanteres og kassér supematanten.
9. Opløs nanocrystal pellets i hexan (25 ml totalvolumen). Ekstrahere denne opløsning 3 gange med et lige volumen af ​​methanol, bevarer den øverste fase. For det tredje ekstraktion, kan mængden af ​​methanol indstilles til ~ 15 ml til opnåelse af en koncentreret hexanopløsning af rene CdSe QDs på omkring 200 pM. Den typiske udbytte for denne reaktion er 3 pmol CdSe nanokrystaller med en diameter på 2,3 nm (50-60% reaktionsudbytte).
10. Bestem nanocrystal diameter og koncentration ved at måle UV-Vis absorptionsspektrum og høring af størrelsen-montering diagram af Mulvaney og kolleger ¹² og uddøen korrelationer Bawendi og medarbejdere ^13. Se tillæg for detaljer.
11. Mercury kationbytning: nanokrystaller kan være delvist udveksles med kviksølv til rød-skifte absorption og fluorescensemission. Bland følgende sammen for i et 20 ml hætteglas med omrørerlegeme (denne reaktion kan skaleres som ønsket): 3 ml hexan, 2 ml chloroform, 1 ml 200 pM CdSe QD opløsning (200 nmol), 15 pi oleylamin (OLA), og 500 pi af en 0,1 M opløsning af Hg (OT) ₂ i chloroform. Mercury octanethioate (HgOT ₂₎ kan fremstilles ved at omsætte kviksølv acetat og octanthiol i methanol (se bilag). Som kationbytter reaktionen skrider frem, kan graden af ​​rød-skift overvåges med UV-Vis absorptionsspektrofotometri. Efter at den ønskede absorptionsbånd er opnået, måle absorptionen af ​​nanocrystal opløsningen ved 350 nm og bestemme den nye ekstinktionskoefficient, idet det antages, at nanocrystal koncentration ikke har ændret sig (30,7 uM i dette eksempel). Stands reaktionen ved at fjerne det uomsatte kviksølv: tilsæt 5 ml decan, 10 ml hexan, og 7 ml methanol og ekstraheres opløsningen, holder den øverste fase indeholdende nanokrystaller. Der ekstraheres to gange mere med hexan og methanol, og justere volumen methanol, således at den øverste fase er -7 ml. Hvis faserne er langsomme til at adskille, kan opløsningen centrifugeret (5.000 x g,10 min). Tilsæt 100 pi, 100 pi OLA, og 100 gl oliesyre til nanokrystaller efterfulgt af 40 ml acetone for at fremkalde udfældning. Saml de nanokrystaller via centrifugering og spreder i 3 ml hexan. Der centrifugeres igen for at fjerne uopløselige bestanddele og bestemme nanocrystal koncentrationen igen med den nye ekstinktionskoefficient ved 350 nm. Tillade nanocrystal opløsningen at ældes i mindst 24 timer ved stuetemperatur, før man går videre til det næste trin.

2. Vækst af Cadmium zinksulfid (Cd _y Zn _1-y S) Shell

1. Forbered 0,1 M shell precursor-opløsningerne i 50 ml 3-halset kolbe. Cadmium precursor: cadmium acetat hydrat (230,5 mg, 1 mmol) og 10 ml oleylamin (OLA). Zink precursor: zinkacetat (183,5 mg, 1 mmol) og 10 ml OLA. Sulfur precursor: svovl (32,1 mg, 1 mmol) og 10 ml ODE. Under vakuum, opvarme hver opløsning til tilbagesvaling i 1 time til opnåelse af klare opløsninger, og derefter oplades med argon. Svovlet opløsning kanafkøles til stuetemperatur, men cadmium og zink prækursorer holdes ved omkring 50 ° C. Beregninger af shell precursor mængder kan findes i reference 14.
2. Tilføj til en 3-halset kolbe: Hg _x Cd _1-x Se QDs (120 nmol, 2,3 nm i diameter), ODE (2 ml), og trioctylphosphine oxid (TOPO, 250 mg). Evakuere fra hexan ved stuetemperatur under anvendelse af Schlenk linie. Hæve temperaturen til 100 ° C og tilbagesvaling i 15 minutter. Ændre Schlenk line-ventil til argon-eller nitrogengas og indsætte termoelementet i nanocrystal opløsningen.
3. Hæve temperaturen til 120 ° C, der tilsættes 0,5 monolag af svovl precursor-opløsning (140 pi), og man lader reaktionen forløbe i 15 min. Små alikvoter (<50 pi) kan fjernes ved anvendelse af en glassprøjte til at overvåge forløbet af reaktionen ved anvendelse af fluorescens og / eller UV-Vis absorptionsspektrofotometri. Hæve temperaturen til 140 ° C, der tilsættes 0,5 monolag af cadmium precursor-opløsning (140 ul), og man lader reaktionen forløbe i 15 min. Tilsættes 500 pi vandfrit OLA til reaktionsopløsningen.
4. Ved 160 ° C tilsættes 0,5 monolag af svovl precursor-opløsning (220 ul) efterfulgt af en tilsvarende mængde zink precursor-opløsning ved 170 ° C med 15 minutter mellem hver tilsætning. Derefter ved 180 ° C tilsættes 0,25 monolag af svovl precursor-opløsning (150 pi) og zink forstadieopløsning i 15 minutters intervaller.
5. Opløsningen afkøles til stuetemperatur og igen beregne en ny ekstinktionskoefficient for disse partikler under anvendelse af en UV-synlige spektrum, idet det antages, at antallet af nanokrystaller ikke har ændret sig (120 nmol i 3,8 ml reaktionsopløsning). Opbevares reaktionsopløsningen som en rå blanding i en fryser, nanokrystaller kan optøs og oprenses efter behov efter samme metode som beskrevet i afsnit 1.8 og 1.9.
6. Nanokrystaller kan kendetegnes under anvendelse af elektronmikroskopi, UV-Vis absorptionsspektroskopi og fluorescensspektroskopi. Kvantumudbytte kan væreberegnet absolut hjælp af en integrerende kugle eller relativt i forhold til en kendt standard under anvendelse af fremgangsmåderne i reference 15.

3. Faseoverførings

1. Tilføj oprenset kerne / skal Hg _x Cd _1-x Se / Cd _y Zn _1-y S QDs (5 ml, 20 pM) til en 50 ml 3-halset kolbe og fjerne hexan under højvakuum til opnåelse af en tør film. Fylde kolben med argon, tilsættes vandfrit pyridin (3 ml) til nanopartikel film og opvarmes opslæmningen til 80 ° C. I løbet af 1-2 timer nanopartikler vil opløses fuldstændigt.
2. Tilsæt 1-thioglycerol (1 ml) til opløsningen, og der omrøres ved 80 ° C i 2 timer. Derefter afkøles opløsningen til stuetemperatur, og der tilsættes triethylamin (0,5 ml) at deprotonere thioglycerol. Der omrøres i 30 minutter. Opløsningen kan blive uklar efter tilsætning af triethylamin som følge af den dårlige opløselighed af polære nanokrystaller i denne opløsningsmiddelblanding.
3. Overfør den QD opløsning i en 50 ml konisk centrifugerør containing en blanding af 20 ml hexan og 20 ml acetone, og bland godt. Isolere de udfældede nanokrystaller via centrifugering (5.000 x g, 10 min), og vaskes pelleten med acetone.
4. Opløs QD pelleten i DMSO (5 ml) med bad sonikering, og derefter centrifugeres (7000 x g, 10 min) for at fjerne eventuelle aggregater. Bestem nanopartikel koncentrationen fra en UV-Vis absorptionsspektrum. Denne opløsning af rene QDs bør anvendes inden for 3 timer, idet overfladen thioler langsomt kan oxidere under omgivelsesbetingelser i luft.
5. Fortynd QD løsning på 10 uM eller derunder med DMSO og overføres til en 50 ml kolbe. Der fremstilles en 5 mg / ml opløsning af thioleret polyacrylsyre (syntese beskrevet i tillæg) i DMSO. Tilsæt polymeropløsning (0,15 mg polymer pr nmol QDs) dråbevis til QD opløsning under omrøring og afgasses opløsningen ved stuetemperatur i 5 min.
6. Rense QD / polymeropløsningen med argon og opvarmes til 80 ° C i 90 minutter. Derefter afkøles opløsningen til stuetemperatur end dråbevis tilsættes et lige volumen af ​​50 mM natriumborat, pH 8. Der omrøres i 10 minutter.
7. Oprense QDs via dialyse (20 kDa afskæring) i 50 mM natriumborat, pH 8, og derefter koncentrere partiklerne ved hjælp af en centrifugal filter (10 kDa afskæring). Bestemme koncentrationen af ​​et UV-Vis absorptionsspektrum.

4. PEG Coating

1. I et 4 ml hætteglas med omrørerlegeme, blandes 1 nmol QDs i boratpuffer med en 40.000 x molært overskud af 750 Da monoamino-polyethylenglycol (30 mg, 40 umol). Hvis en bestemt kemisk funktionalitet skal tilsættes til nanokrystaller (f.eks hydrazid eller maleimid), kan det indføres ved at erstatte en del af den amino-PEG med et heterobifunktionelt amino-PEG (30% molfraktion typisk fungerer godt). Fortyndes nanocrystal opløsning til 1 uM med boratpuffer. Denne reaktion kan skaleres som ønsket.
2. Der fremstilles en frisk opløsning af DMTMM (20 mg, 72 umol) i DMSO (144 pi). Denne løsning kan kortvarigt opvarmes uNDER en strøm af varmt ledningsvand eller nedsænket i et bad-sonikator til fuldt ud at opløse DMTMM. Hurtigt at tilføje en 25.000 x molært overskud af det 0,5 M DMTMM opløsning (50 pl) til QD opløsning og omrøres ved stuetemperatur i 30 minutter.
3. Gentag trin 4,2 fire gange for at mætte nanocrystal overfladen med PEG. Endelig tilsættes 200 pi 1 M Tris-puffer for at standse reaktionen og oprense nanokrystaller med dialyse, centrifugalfiltre eller ultracentrifugering.
4. Nanokrystaller kan analyseres for monodispersitet, hydrodynamiske størrelse og overfladeladning ved hjælp af væskechromatografi, agarosegelelektroforese, og fluorescensmikroskopi. At bestemme hydrodynamiske størrelse og størrelsesfordeling under anvendelse af en automatiseret væskekromatografisystem (GE AKTAprime Plus), anvendes en Superose 6-søjle, en strømningshastighed på 0,5 ml / min med PBS-buffer eluent, og absorption detektion ved 260 eller 280 nm. Sammenlign nanopartikel elueringstider med de molekylvægtstandarder. For agarosegel electrophoresistiv fremstilles en 0,5% agarosegel i 50 mM natriumboratpuffer (pH 8,5) eller 50 mM natriumphosphatpuffer (pH 7,4), blandes 1 um prøver med 10% glycerol og belastning i boringer, og kørt ved 100 V i 30 minutter . Billede af nanokrystaller i gelen ved hjælp af en UV-hånd stav eller UV-transilluminator og for fluorescens excitation. Til afbildning af nanokrystaller på enkelt molekyle niveau ved hjælp af fluorescensmikroskopi, at partiklerne til 0,2 nM fortyndes i 10 mM phosphatbuffer, opgive 2,5 ul af opløsningen på et dækglas, og anbring forsigtigt et andet dækglas på toppen af ​​det flydende vulst at sprede en film mellem dækglassene. Billede af overfladebundne under anvendelse af et høj numerisk blænde mål (ideelt mindst 1,40) i enten epifluorescens eller TIRF tilstand med excitation ved bølgelængder mellem 400-580 nm og en elektron-multiplicere CCD-kamera. Præcis imaging parametre vil variere mellem mikroskopi setup.

Representative Results

Figur 2 viser repræsentative absorption og fluorescens spektre for CdSe nanokrystaller, HG _x CD _{1-x SE} nanokrystaller efter kationbytning og Hg _x Cd _1-x Se / Cd _y Zn _1-y S nanokrystaller efter shell vækst. De centrale CdSe nanokrystaller har et kvanteudbytte af fluorescens nær 15% (inklusive lang bølgelængde deep-fælde emission), men denne effektivitet falder til under 1% efter kviksølv udveksling, sandsynligvis på grund af ladningsbærer fælder indført gennem overfladen atom forstyrrelser ^9. Men væksten af en tynd skal af Cd _y Zn _1-y S øger denne effektivitet på mere end 70%, hvilket stort set fortsat efter overførsel til vand (50% er typisk). I modsætning hertil taber CdSe / Cd _y Zn _1-y S nanokrystaller uden kviksølv inkorporering af en væsentlig del af deres kvantumudbytte i vand, hvis en tyk skal dyrkes. Således ved at inkorporere kviksølv i kernen nanocrystal, den lille størrelse af nanocrystal kan opretholdes (se TEM i figur 3) uden at ofre lysstyrke. Det er vigtigt at bemærke, at capping med Cd _y Zn _1-y S forskyder spektre til den røde grund af lækage af de elektroniske ladningsbærere i skallen materiale dette skift er omkring 20-30 nm for CdSe kerner ¹⁶ og stiger med stigende kviksølvindhold i kernen (op til 100 nm).

Anvendelsen af ​​en 2-trins faseoverførings til vand er kritisk for at opnå en homogen population af nanokrystaller, der ikke kræver yderligere størrelse sortering til fjernelse af klynger og aggregater. I det første trin, er nanokrystaller overført til DMSO ved anvendelse af 1-thioglycerol, som fortrænger oleylamin på overfladen af ​​nanocrystal. Thioglycerol erstattes derefter med en lineær multidentat polymer, hvilket resulterer i stærkt stabile partikler med en minimal forøgelse af hydrodynamiske størrelse som følge af det organiske overtræk (<4 nm BIDRAGpå den hydrodynamiske diameter). The størrelseseksklusions-kromatogram er vist i figur 4a bekræfter, at størrelse svarer til den for Konalbumin (75 kDa), og efter modifikation med 750 Da amino-PEG, er størrelsen forøges til kun 12 nm, svarer til et IgG-antistof . PEG-modifikation neutraliserer overfladeladning, som det fremgår af agarosegelelektroforese eksperiment vist i figur 4b. Vi rutinemæssigt bruger gelpermeationskromatografi og gelelektroforese til hurtig karakterisering af størrelse, størrelsesfordeling, og overfladeladning. Dynamisk lysspredning og zeta potentiometri kan også anvendes, men det spredende tværsnit af disse ultrasmå partikler er meget lille, og vi har fundet, at resultaterne fra kommercielle instrumenter ikke er reproducerbare. Figur 5a viser et epifluorescens mikrofotografi af disse nanokrystaller afsat på et dækglas og ophidset med 545 nm synligt lys. Disse nanokrystaller er let o. bserved på enkelt-molekyle niveau på 30 billeder per sekund med en elektron-multiplicere CCD-kamera Figur 5b viser, at antallet af fluorescerende partikler observeres i hver ramme varierer over tid med kontinuerlig excitation; dette skyldes en kombination af blinke og fotonedbrydning . Blinker dominerer for første ~ 7 min før oxidativ fotonedbrydning langsomt viser sig.

Fig. 1. Skematisk visning af nanopartikel synteseprocedure. (A) Cadmium og selen forstadier reagerer at generere CdSe nanokrystaller, som er behandlet med kviksølv octanethiolate, overtalelse delvis Cd → Hg kationbytning at give Hg _x Cd _{1-x SE} ternære legeringer nanokrystaller. En skal af Cd _y Zn _1-y S dyrkes derefter på kernen ved hjælp af cadmium acetat, zinkacetat og svovl. (B) Som SYNThesized er disse nanokrystaller overtrukket med ikke-polære organiske ligander (oleylamine). At solubilisere disse partikler i vandige buffere, er liganderne erstattet med en multidentat polymer ligand, der er kovalent koblet til amino-PEG.

Figur 2. Optiske egenskaber af Hg _x Cd _1-x Se / Cd _y Zn _1-y S nanokrystaller. (A) Absorption (sort) og fluorescensspektre (rød) af CdSe nanocrystal kerner, Hg _x Cd _{1-x SE} kerner efter kationbytning, og Hg _x Cd _1-x Se / Cd _y Zn _1-y S nanokrystaller efter shell vækst . Spectra er forskudt for klarhed (b) Fluorescence spektre af Hg _x Cd _1-x Se / Cd _y Zn _1-y S med forskellige relative mængder af kviksølv inkorporering. Det blå spektrum viser kerner med nul indhold af kviksølv (x = 0, CdSe).

Fig. 3. Transmission elektronmikrografi (a) og partikelstørrelsesfordeling (b) Hg _x Cd _1-x Se / Cd _y Zn _1-y S nanokrystaller, der viser en gennemsnitlig diameter ± standardafvigelse på 3,2 ± 0,6 nm.

Fig. 4. Hydrodynamisk karakterisering af Hg _x Cd _1-x Se / Cd _y Zn _1-y S QDs i vandig opløsning. (A) størrelsesudelukkelses-kromatogram af nanokrystaller belagt med en multidentat polymer ligand før (rød) og efter (blå) konjugering til amino-PEG. Molekylvægtstandarder proteinstandarder er angivet ovenfor plottene. (B) Agarosegelelektroforese eksperiment af QDs i natriumboratpuffer (pH ~ 8,5), før (venstre) Og efter (højre) konjugering til amino-PEG. Brønden er markeret med en pil og elektrode polariteter er angivet til højre, der viser, at før konjugering nanokrystaller vandrer som anioniske partikler og de PEGylerede nanokrystaller er elektrostatisk neutral.

Figur 5. Hg _x Cd _1-x Se / Cd _y Zn _1-y S QDs adsorberet på et dækglas i phosphatpuffer, afbildet med epifluorescens-mikroskopi. (A) QD billede taget ved 33 billeder per sekund. Billedet er 15 um x 15 um. (B) Antallet af fluorescerende QDs pr synsfelt under kontinuerlig belysning i 20 minutter med kviksølv buelampe med 545 nm (30 nm båndpas) excitation filter og en 625 nm (20 nm båndpas) emission filter og 100x 1,4 NA mål. Målinger fra 3 synsfelter blev i gennemsnit over 20 minutter ved 12,5 billeder per sekund.

Discussion

Sammenlignet med konventionelle CdSe kvantepunkter kan ternær legering Hg _x CD _{1-x SE} nanokrystaller være indstillet i størrelse og fluorescens bølgelængde uafhængigt. Størrelsen vælges først under syntesen af CdSe nanocrystal kerner, og fluorescensen bølgelængde vælges i en sekundær kviksølv kationbytningstrin, som ikke væsentligt ændrer nanocrystal størrelse ^9. Det er vigtigt, at den rensede Hg _x Cd _{1-x SE} nanokrystaller at inkubere ved stuetemperatur i mindst 24 timer uden reduktion. Dette tillader nogle af de svagt adsorberede kviksølv kationer til at diffundere ind i nanocrystal gitter. Uden at denne proces forekommer, en anden fluorescens bånd i det nær infrarøde iagttages ofte på grund af homogene kimdannelse af HGS nanokrystaller fra dissocierede kviksoelvionerne.

I eksemplet vist i dette arbejde, fremstillet vi CdSe kerner med en størrelse i nærheden af ​​2,3 nm, som kan væretunet i fluorescens mellem 550-800 nm efter beskæring ved at ændre mængden af ​​kviksølv, inkorporeres i kernen gitter. Med en 2,5 monolag shell, var det endelige Diameteren af disse QDs nær 3,2 nm, hvilket er stort set den mindste størrelse nanopartikel, at vi kan forberede det er både tilstrækkeligt fotostabilt og tilstrækkeligt lys til enkelt-molekyle imaging (ekstinktionskoefficient nær 350.000 M ^-1 cm ^-1 ved 400 nm og kvantumudbyttet nær 50% i vand). Disse nanokrystaller er væsentligt lysere og mere fotostabilt end tidligere beskrevne nanokrystaller med sammenlignelige størrelser, der udleder over dette spektralområde (f.eks CdTe, InAs, InP). Ligesom de fleste fluoroforer, er fluorescensen fra disse partikler på enkelt molekyle niveau intermitterende (blinker) ^5,6.

Til nogle anvendelser kan det være fordelagtigt at anvende noget større nanokrystaller. Ved anvendelse af en større CdSe nanocrystal kerne, fluorescensen bandwiDTH er smallere efter kviksølv kationbytning. Typiske fluorescens topbredder for Hg _x CD _{1-x SE} nanokrystaller med emission i 600-650 nm vinduet er 50-70 nm for 2,3 nm kerner og 40-50 nm for 3,2 nm kerner. Derved større nanokrystaller muliggøre en større kapacitet til spektral multiplexing. Endvidere vil forøgelse af størrelsen ligeledes øge optagelsen tværsnit af nanokrystaller. Forøgelse af tykkelsen af ​​CdS midlertidige skallag vil også øge lysstyrken, og yderligere at forlænge fluorescens stabilitet under excitation. The CdSe kernestørrelse kan forøges blot ved at forlænge varigheden af ​​den CdSe kerne syntese, og overvåge den effektive størrelse ved UV-VIS absorptionsspektrofotometri.

Det har vist sig, at vandige QDs overtrukket med carboxylsyrer er tilbøjelige til ikke-specifik adsorption til celler og proteiner, og at neutralisering af deres stærke negative ladning i fysiologiske puffere er critical for at minimere ikke-specifikke interaktioner ^17. I eksemplerne her benyttede vi kortkædet PEG for at neutralisere overfladeladningen og opretholde stabilitet i vand. PEG kan indføres i polymerskelettet enten før fastgørelse til QDs eller efter overtrækning. Begge fremgangsmåder resulterer i næsten neutrale partikler, men de først coatet med carboxyl-polymer er væsentlig mindre, formodentlig på grund af forbedret multidentat interaktion med overfladen. For fuldstændig overflade neutralisering med PEG, har det vist sig, at gentagen tilsætning af carboxylsyre-aktiveringsmidler er nødvendig på grund af den korte halveringstid af de reaktive arter. Vi anvender DMTMM i stedet for mere almindelige carbodiimid-reagenser (f.eks EDC) på grund af den forbedrede stabilitet af DMTMM i opbevaring og på grund af forbedret reaktionseffektivitet i vand ^18.

Endelig er det vigtigt at bemærke, at kvantepunkter og mange andre typer af nanokrystaller indeholdercytotoksiske elementer ^5. Cadmium og kviksølv-ioner kan påvirke de normale processer i levende celler og organismer og kan være kræftfremkaldende ^19-21. Imidlertid cytotoksiciteten af ​​konventionelle CdSe / ZnS nanokrystaller er blevet undersøgt meget, og det er blevet rapporteret, at robust coatede nanokrystaller med stabile organiske ligander ikke fremkalder åbenlyst cytotoksiske respons sammenlignet med deres bestanddele, simpelthen fordi deres toksiske elementer effektivt sekvestreres væk fra oxidationsmidler ^5. Desuden, for enkelt-molekyle billeddannelsesanvendelser, er toksiske virkninger usandsynlig på grund af de ekstremt små koncentrationer anvendt til billeddannelse (typisk 1 nM eller mindre), som er størrelsesordener mindre end indtræden af ​​påviselige toksiske virkninger (50-100 nM). De fleste af de enkelt-molekyle eksperimenter gennemførelse QDs til dato har udnyttet kommercielt tilgængelige CdSe / ZnS nanokrystaller, som er væsentligt større end de heri beskrevne. Ved at minimere nanocrystal størrelse, er det samlede antal overflade-atomer pr partikel og det totale antal toksiske atomer pr partikel væsentligt reduceret, hvorved det totale potentiale for toksikologiske virkninger. Inkorporeringen af kviksølv i nanocrystal forventes yderligere at reducere toksiciteten potentiale, som divalent kviksølv kendt for at være mindre toksiske end divalent cadmium i mange celletyper ^19-21.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Selenium	Sigma-Aldrich	229865
Tri-n-octylphosphine	Strem	15-6655	97% pure, unstable in air
Cadmium oxide	Sigma-Aldrich	202894	Highly toxic: use caution
Tetradecylphosphonic acid	PCI Synthesis	4671-75-4
Octadecene	Alfa Aesar	L11004	Technical grade
Hexadecylamine	Sigma-Aldrich	H7408
Diphenylphosphine	Sigma-Aldrich	252964	Pyrophoric
Mercury acetate	Sigma-Aldrich	456012	Highly toxic: use caution
1-Octanethiol	Sigma-Aldrich	471836	Strong odor
Oleic acid	Sigma-Aldrich	W281506
Zinc acetate	Alfa Aesar	35792
Cadmium acetate hydrate	Sigma-Aldrich	229490	Highly toxic: use caution
Oleylamine	Fisher Scientific	AC12954	Unstable in air
Sulfur	Sigma-Aldrich	344621
Trioctylphosphine oxide	Strem	15-6661	99%
Pyridine	VWR	EM-PX2012-6	Anhydrous
Thioglycerol	Sigma-Aldrich	M1753	Strong odor
Triethylamine	Sigma-Aldrich	471283	Anhydrous
Dialysis tubing	Spectrum Labs	131342	20 kDa cutoff
Centrifugal filter	Millipore	UFC801024	10 kDa cutoff
Monoamino-PEG	Rapp Polymere	12 750-2	750 Da
DMTMM, 4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride hydrate	Alfa Aesar	H26333
AKTAprime Plus Chromatography System	GE HealthCare
Superose 6 10/300 GL chromatography column	GE HealthCare	17-5172-01
Agarose, OmniPur	VWR	EM-2120
Appendix Synthesis of mercury octanethiolate: Slowly add a methanol solution of mercury acetate (1 eq.) to a stirring solution of 1-octanethiol (3 eq.) and potassium hydroxide (3 eq.) in methanol at room temperature. Isolate the mercury(II) octanethiolate precipitate via filtration, wash two times with methanol and once with ether, and then dry under vacuum. Synthesis of multidentate polymer: Dissolve polyacrylic acid (1 g, 1,773 Da) in 25 ml dimethylformamide (DMF) in a 150 ml three-necked flask and bubble with argon for 30 min. Add an anhydrous solution of cysteamine (374 mg, 4.87 mmol) in 10 ml DMF. At room temperature with vigorous stirring, slowly add anhydrous diisopropylcarbodiimide (DIC, 736 mg, 5.83 mmol) over 30 min, followed by triethylamine (170 μl, 1.22 mmol), and allow the reaction to proceed for 72 hr at 60 °C. Add mercapt–thanol (501 mg, 6.41 mmol) to quench the reaction, and stir for 2 hr at room temperature. Remove DMF via rotary evaporation and isolate the polymer with the addition of a 2:1 mixture of ice-cold acetone:chloroform, followed by centrifugation. Dissolve the polymer in ~5 ml anhydrous DMF, filter, precipitate again with diethyl ether, and repeat. Dry the product under vacuum and store under argon. Determination of CdSe core diameter: From the UV-Vis absorption spectrum determine the wavelength of the first exciton peak (λ, in nm), which is the longest-wavelength peak (e.g. roughly 498 nm for CdSe in Figure 2a), and use the sizing curve of Mulvaney and coworkers 12: Determination of CdSe nanocrystal concentration: From a background-subtracted UV-Vis spectrum of an optically clear solution of CdSe nanocrystals, determine the absorption at 350 nm wavelength. Serial dilutions can be used to determine if the optical absorption is within the linear range of Beer's Law. The nanocrystal concentration (QD, in M) can be determined by plugging in the nanocrystal diameter (D, in nm), the optical absorption value (A3sa), and the cuvette path length (l, in cm) into the following equation from the empirical correlation of Bawendi and coworkers 13: