Summary
제시 방법은 절연 쥐 cardiomyocytes의 휴대폰 단축하고 세포 내 칼슘 과도에 절연 환자의 면역 글로불린의 영향을 분석하여, 관계없이 특정 항원의, 확장 성 심근증 환자의 혈장에 기능을 효과적으로 cardiotropic autoantibodies를 감지 할 수있는 방법을 제공합니다.
Abstract
확장 성 심근증 (DCM)은 젊은 성인 1 심장 마비의 주요 원인 중 하나입니다. 독성 물질에 대한 유전 처분 및 박람회가 환자의 약 셋째에서이 질병에 대한 원인을 알려져 있지만, DCM의 출처는 대부분 불분명 남아 있습니다. 이 환자의 상당수에서 심장 epitopes에 대한 autoantibodies가 감지되었으며 질병 2,3의 발병과 진행에 중요한 역할을 의심하고 있습니다. 심장 autoantibodies의 중요성은 immunoadsorption 3-5로 autoantibodies의 제거 후 DCM 환자에서 관찰 hemodynamic 개선에서 빨간 밑줄이 있습니다. 특정 항원의 다양한 이미 2,3를 확인하고 있으며 이러한 목표에 대한 항체가 immunoassays에 의해 검출 될 수있다. 그러나, 이러한 assays은 자극 (및 따라서 기능적 효과)와 autoantibodies을 차단 구별 할 수 없습니다. eviden 명이 증가이 구별이 중요한 6,7입니다 CE. 또한 cardiotropic 항체의 수에 대한 목표는 여전히 미확인이며, 따라서 immunoassays에 의해 감지 할 수 있다고 가정 할 수 있습니다. 따라서, 우리는 각각의 항원과는 독립적 기능 활성화 cardiotropic 항체의 검출하는 방법을 설립했습니다. 방법의 배경은 일반적으로 포유 동물 8,9 사이에 심장 단백질의 기능 영역에 대한 관찰 높은 호몰 로지입니다. 이 인간의 항원에 대한 감독이 심장 항체 성인 쥐 cardiomyocytes에 DCM 환자에서 IgG의 테스트를 할 수 있습니다 이외의 인간 대상 세포와 함께 상호 반응 제안한다. 우리의 방법은 3 단계로 구성 : 첫 번째는 IgG는 immunoadsorption 열 (PlasmaSelect, Teterow, 독일)에서 얻은 세 파로스 결합 항 IgG 항체를 사용하는 환자의 혈장에서 분리됩니다. 둘째, 성인 cardiomyocytes는 AP를 사용하여 Langendorff 재관류 장치에 collagenase 재관류에 의해 고립되어rotocol은 이전 작품에서 10,11을 수정했습니다. 획득 cardiomyocytes는 laminin 코팅 쏠의 coverglasses에 부착 Fura-2, 쉽게 (CA 2 +) 내용 12 세포 내 칼슘을 관찰하는 셀에 반입 할 수있는 칼슘 선택성 형광 염료를 물들입니다. 마지막 단계에서, 세포 단축 및 CA 2 환자 IgG의 효과 + 필드에 자극을 cardiomyocytes의 과도는 표준 역 형광등에 연결된 상업 myocyte 칼슘, 수축성 모니터링 시스템 (IonOptix, 밀튼, MA, USA)를 사용하여 온라인으로 감시하고 있습니다 현미경.
Protocol
1. 환자 샘플에서 IgG 절연
- 빈 Econo 팩 칼럼으로 두 ML 환자의 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 플라즈마 당 3 ML 항 IgG 세 파로스를 작성하여 미니 immunoadsorption 항목을 준비합니다. IgG 격리는 환자 플라즈마의 최소한 2 ML이 필요합니다.
- 반 IgG 세 파로스 상단에 필터를 넣고, 열 아래 팁을 열고 잘라 약 1 방울 / 초의 유량에 도달 할 필터를 누르십시오. 열이 부족 보존 솔루션을 보자.
- 3 권 플라즈마의 볼륨 당 NaCl 0.9 %로 열을 씻으십시오.
- 열에서 플라즈마를 피펫. 플라즈마 완전히 반 IgG 세 파로스에 몰두했을 때, 같은 볼륨 0.9 % NaCl로 씻는다.
- 피펫 한 플라즈마 열에서 0.2 M 글리신 HCL, pH를 2.8의 볼륨과 세 파로스로 잠그다 보자. 열에 글리신 HCL의 또 다른 볼륨을 추가합니다. 15 ML 관을 통해 흐름을 수집하여 0.5 M 트리스 - HCL, pH를 8.0로 7.3으로 산도를 조정합니다.
- 열을 생성하려면3 플라즈마 볼륨 글리신 HCL을 씻는다. 2 권 0.9 % NaCl로 최종 세척 후, 열은 다음 플라즈마 샘플에 사용할 수 있습니다. ° C 최대 4 주까지 8 - 또는 열이 보존 솔루션으로 가득과 4에 저장할 수 있습니다.
- cardiomyocytes에서 사용하기 위해, 수집 된 IgG 분획은 실험 버퍼 (EB)에 대해 dialyzed해야합니다. EB의 준비를 들어, 117 MM NaCl, 2.8 MM KCl, 0.6 MM MgCl 2, 1.2 MM KH 2 PO 4, 1.2 MM CaCl 2, 10 밀리미터 HEPES 및 자기 교반기에 20 밀리미터 포도당 1 L 증류수로 추가하고 pH를 조정 7.3 있습니다.
- 100 kDa의 차단 분자량과 셀룰로오스 에스테르 투석 막 관에 IgG의 일부를 입력합니다. 1 L의 EB에 튜브를 넣고, 4에서 자기 교반기로 천천히 저어 ° C. 8 시간 후, 신선한 EB 3 L로 투석 튜브를 전송하고 4시에 또 다른 20 시간을위한 dialyze ° C.
- inactivat 할 수있는 물 욕조에 57시 30 분 ° C에 대한 투석, 열에게 샘플을 따라전자 보완 요소. 총 IgG 농도를 결정 및 330 μg IgG 각을 포함하는 aliquots를 준비합니다. 측정 (단계 4.3)에 대한 cardiomyocytes에 샘플을 추가 할 때, EB 1 ML에 aliquots를 입력합니다. Undiluted aliquots는 더 이상 사용 할 때까지 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
2. 쥐 Cardiomyocytes의 절연
- 칼슘 2 + 무료 절연 버퍼 (IB)의 준비를 들어, 110 MM NaCl, 2.6 MM KCl, 1.2 MM MgSO 4, 1.2 MM KH 2 PO 4, 20 밀리미터 HEPES과 자기를 사용하여 1 L 증류수 11 으 포도당을 추가 교반기. 살균을위한 0.2 μm 병 톱 필터를 통해 실내 온도 및 필터에서 7.4로 산도를 조정합니다.
- thermostated Langendorff 재관류 시스템의 상부 저수지에서 IB의 80 ML을 입력합니다. 37 ° C의 버퍼 온도를 유지하고 95% O 5분의 2 % 30 분에 CO 2와 버퍼를 폭기하는 온도 설정을 조정합니다.
- 약 10,000 무게 - collag의 12,000 U를enase 유형 II, 175 MG 지방산 무료 BSA하고 100 MM CaCl 2 재고 솔루션의 22.5 μl를 포함하는 20 ML IB에 용해. 상단 저장소의 절연 버퍼의 pH를 제어하고 필요한 경우 조정합니다.
- 375 μg / kg 체중의 thiopental 200 G - 175의 Wistar 쥐를 마취시키다. thiopental 솔루션에 2,500 IU의 헤파린을 추가합니다. 그대로 대동맥 활과주의 깊게 thoracotomy, 소비세 마음에와 얼음처럼 차가운 0.9 % NaCl로 전송. 혈액의 마음과 주변 조직과 신선한 0.9 % NaCl로 전송를 청소합니다. 대동맥을 노출, 2-3/sec의 하락 속도를 얻고 캐뉼라에 마음을 첨부 Langendorff 시스템의 흐름 감속기를 엽니 다.
- 까지 남은 피를 씻어 한 방울 / 초의 유량과 3 분에 대한 마음을 Perfuse. Langendorff 시스템의 IB를 순환하기 시작한다. 상부 저수지부터 20 ML 버퍼를 제거 등의 80 ML에 도달하는 데 필요한 많은 버퍼로 collagenase 솔루션과 리필 입력합니다. C를 순환 또 다른 27 분에 ollagenase 솔루션입니다. 유량은 흐름 감속기를 사용하여 한 방울 / 초에서 정기적으로 관리 및 유지 관리해야합니다.
- 심방과 대동맥에서 깨끗한 캐뉼라의 마음을, 이탈 작은 조각으로 썰어. collagenase 솔루션은 낮은 저수지로 실행하도록 허용, 40 ML의 최대 볼륨을 줄이고 더 10 다진 심실을 소화 % - 95 % O가 5분의 2 %의 CO 2 연속 폭기에서 15 분. 그 후 50 ML 튜브에 200 μm의 메쉬 크기 거즈를 통해 세포 현탁액을 필터링합니다.
- 200 μM에게 CaCl 2를 포함하는 10 ML의 IB의 객실 온도와 resuspend 세포에서 2 분에 43 XG에서 세포 현탁액을 원심 분리기 : 3 단계에서 세포의 칼슘 2 + 내용을 복원합니다. 다시 원심 분리기, 500 μM CaCl 2 10 ML IB에서 셀을 resuspend. 최종 원심 분리 50,000 세포 / ML의 밀도에 살균 필터 EB의 cardiomyocytes을 (1.8 참조) resuspend 후.
- 코트 10 μg의 당 잘 laminin과 완전히 건조 될 때까지 기다리과 4 잘 쏠 수 coverglass.
- 각이 잘 커팅 팁과 micropipette를 사용하여에 cardiomyocyte 정지 1 ML을 입력합니다. 세포가 실온에서 1 시간에 준수 할 수 있습니다.
- 10 일 MG / ML의 μl Fura-2 5 ML의 EB의 주식 솔루션입니다.를 희석 어둠 속에서 착색 솔루션세요.
- coverglass 각도에 착색 솔루션의 피펫 0.5 ML의 버퍼와 무소속의 세포를 벗어. 적당한 흔들림에 따라 10 분에 세포를 배양. 그 후, 착색 솔루션을 벗고 일 ML의 EB를 한 번 세포를 씻어 마지막으로 각도에 0.5 ML의 EB를 채 웁니다. 착색 과정에서 직접 빛을 방지하고 항상 어둠 속에서 스테인드 세포를 유지.
4. 셀 단축 및 CA 2 + 과도의 기록
- 역 형광의 m에 쏠의 coverglass를 삽입icroscope는 myocyte 칼슘, 수축성 기록 시스템에 연결되어 있습니다. 물론 처음에 유입 및 유출 관과 맞춤 제작 전극을 배치합니다. 1 ML / 분 EB와 (20 V, 1 Hz에서, 5 밀리 초 시간) 전기 자극을 시작으로 Superfuse cardiomyocytes. 세포가 약 2 분의 자극에 적응 할 수 있도록 허용합니다.
- 분명 결 지속적인 수축과 손상로드 모양의 cardiomyocyte를 선택합니다. 시야의 중심에있는 셀을 위치와 카메라 채널을 엽니 다. 셀 프레임 어댑터를 회전하고 현미경 단계를 이동하여 비디오 영역에서 수평으로 셀을 일정한 방향으로 향하게.
- 초기 셀 단축 및 CA 2 + 과도를 얻기 위해 15 수축 - 가장자리가 동영상 영역의 제어 요소 (그림 2)을 검출 조정, 형광 채널과 기록이 10여십시오.
- 형광 얼룩의 표백 방지하기 위해 현미경 광 채널을 닫습니다. 샘플로 EB에서을 통해 흐름을 전환환자 IgG 1 ML과 3 방향 밸브 및 superfuse의 cardiomyocytes으로 우회. 공기가 잘 도달 전에 펌프를 중지합니다.
- 빛 채널을 열고 또 다른 10 기록 - 급성 세포 응답을 얻기 위해 15 수축합니다. 녹화를 일시 중지하고 다시 조명 채널을 닫습니다. 이 후 녹음 및 5 분 반복합니다.
- 우물의 전극을보십시오. EB와 철저하게 튜브를 청소하고 쏠 수의 coverglass의 다음 잘를 계속합니다.
- 각각 세포 단축 및 CA 2 + 'Edge-Length/Length "를 사용하여 IonWizard 소프트웨어와 과도하고"fura 2 숫자는 / 비율을 뺀'창을 분석합니다. 초기 셀 단축 및 CA 2 + 급성의 기준 (BL %에서 최대 H)에 언급 된 피크 높이의 과도, 2 분, 5 분 응답에서 변경 률을 계산합니다.
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Representative Results
분야에서 세포 inotropy의 측정을위한 두 예제는 아래에 myocyte 칼슘 2 + 및 수축성 기록 시스템을 사용하여 성인 cardiomyocytes을 (그림 2) 자극. 그림 3은 제어 측정의 인상을줍니다, 그림 4에있는 동안 cardiodepressive 항체의 효과 있는 환자의 DCM가 표시됩니다.
에서 두 예, 초기 세포 단축 및 CA 2 + EB있는 superfusion 동안 과도은 분석을위한 전제 조건입니다, 명확하고 지속적인 봉우리을 나타냅니다. 우리의 응용 프로그램에 대한 최선의 14 % 정장, 낮거나 높은 초기 수축성과 cardiomyocytes은 종종 세포 단축의 부당한 변경 사항을 전시하는 경향이있는 동안 - 우리는 7 범위에서 초기 파 % 최대 H를 전시 세포가 있다는 경험 알아요. 제어 IgG의 신청 후 즉, IgG 건강 관리 과목에서 분리, cardiomyocytes의 inotropy은 U 남아전체 측정 (그림 3A)를 통해 nchanged. 반면, IgG는 cardiodepressive 항체를 포함하는과 superfusion이 감소 칼슘이 함께 세포 단축의 감소 (그림 4A)을합니다 + 일반적으로 적은 발음 과도 (그림 4B). 우리는 일반적으로 새로운 정상 상태가 5 분 후 측정이 끝날 때까지 보존되어 2 분 후, 셀 단축 및 CA 2 + 과도, 모두 설립되어 관찰합니다. 주어진 예는 5 분 후 31%의 + 과도 54%로 및 CA 2 셀 단축의 감소와 분명 부정적인 inotropic 효과를 보여줍니다. 그러나, 변화는 종종 덜 발음됩니다. 따라서, 우리는 의미로 부정적 및 긍정적 인 inotropy을위한 상부 및 하부 제한을 정의 ± 건강한 통제 집단의 제어 IgG에 대한 2SD 거짓 긍정적 인 결과를 방지 할 수 있습니다. 따라서, 세포는 부정적이거나 긍정적 인 inotropic w로 간주됩니다셀 단축의 암탉 변경은 우리가 약으로 결정이 임계 값, ± 10 %를 초과합니다.
1 그림. cardiomyocyte 수축성을 측정하여 autoantibody 탐지의 흐름 차트. 첫째, IgG는 항 IgG 세 파로스 열을 (노란색으로 강조)를 사용하여 환자의 샘플에서 추출됩니다. 둘째, cardiomyocytes는 Fura-2 (파란색으로 강조 표시)과 효소 소화와 스테인드에 의해 쥐의 마음으로부터 격리되어 있습니다. 마지막으로, 셀 단축 및 CA 2 + 과도은 Myocyte 칼슘과 수축성 기록 시스템 (녹색으로 강조)를 사용하여 온라인으로 모니터링하고 있습니다.
그림 2. 절연 쥐 cardiomyocyte Myocyte 수축성 기록 시스템의 비디오 영역에 위치. 셀 아래의 그래프는 에지 검출에 사용되는 계산 강도 흔적을 표시합니다. 화살표는 에지 검출 제어 요소를 나타냅니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. 제어 측정의 대표 예라고 할 수 있습니다. 셀 단축 (A) 및 CA 2 + 과도 (B)가 2 분 및 IgG와 superfusion 후 5 분 (급성) 즉시, (초기) 이전에 온라인으로 감시했다. 레드 라인이 측정의 일시 중지 나타냅니다.
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4 그림. cardiodepressive 항체를 포함하는 IgG 샘플의 예 측정. 셀 단축 (A) 및 CA 2 + 과도 (B)가되기 전에 온라인으로 측정되었다 (초기), 즉시 (급성), IgG와 superfusion 후 2 분, 5 분 거리에 있습니다. 레드 라인이 측정의 일시 중지 나타냅니다.
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Discussion
제시 방법은 불분명 출신 DCM 환자에서 기능적으로 효과적인 심장 autoantibodies를 감지 할 수있는 적절한 방법을 제공합니다. 다른 방법에 비해, 캠프 레벨 6에 미치는 영향에 의해 β1-adrenoceptor에 대한 기능을 활성화 항체의 검출을 예를 들어, 우리의 방법은 특정 에피토프의 독립적입니다. 물론 문학에 설명 된 다른 에피토프 독립 assays는 IE 패치 클램프 기술 또는 절연 Purkinje 섬유 (14)의 수축성에 의해 성인 cardiomyocytes의 칼슘 전류를 측정하는 신생아 cardiomyocytes 13의 박동 속도를 계산, 있습니다. 이러한 방법으로 활용에서, 여기에 제시된 분석에는 시간이 많이 걸릴 적을 수 있으며 표준화 된 프로토콜에 따라 증가 객관성을 제공합니다. 또한, 동시에 수축성과 세포 내 칼슘 과도에 미치는 영향을 감지 할 수 있습니다.
OT와 마찬가지로그녀의 체외 assays에 제시된 방법으로 얻은 결과는 셀에 적용된 인공 조건에 도전 할 수 있습니다. 양식 신생아 쥐 cardiomyocytes는 평면 기판에 30 μm 이하의 거리로 micropillars 사이에 우선적으로 첨부보고되었다. 후자에 부착하면, 세포 고를 응력 섬유를 표시하는 것으로하고 myofibers 15 정렬되지 않은되었다. 그러나, 수축성 분석에 스트레스 섬유의 잠재적 인 영향은 성인 cardiomyocytes 만 같은 섬유 세포 단축의 형성과 칼슘이를 줄일 5월 6일 시간까지의 아주 짧은 시간 동안 배양되어 있기 때문에 무시할 수 있습니다 여기에 설명 + 과도 세포 사이의 개인차의 영향을 최소화하기 위해 각 셀의 초기 수축성라고합니다. 또 다른 제한은 실험 동물과 시간의 수요입니다. 따라서 방법은 외 관의 높은 처리량 검사에 적합하지 않습니다엔트.
또한 구현 방법에 대해 생각할 수 있습니다. 항원 - 독립으로 인해 그것은 면역 효과가 간주됩니다 다른 특발성 심혈관 질환에 적용 할 수 있습니다.
또한, 수축성 측정은 쉽게 다른 물질의 기능 효과를 연구하기 위해 조정할 수 있습니다. 이 약물 개발 및 테스트에 도움이 예를 들어있을 수 있습니다 심장에 약물의 잠재적 인 영향을 분석 할 수 있습니다. 셀 단축 및 CA 2 + 기준에서의 변화가 제공하는 기본 매개 변수 외에, 추가 정보는 관찰 된 효과의 상세한 정의를 허용하는 측정에서 얻을 수 있습니다. 예를 들어, 출발 및 반품 속도는 특정 수축과 약물 또는 항체의 이완기 효과를 나타낼 수 있습니다 셀 단축 이벤트에서 계산 될 수있다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
심혈관 질환의 체액 면역 응답 (-이 작품은 독일 Forschungsgemeinschaft (DFG)의 Sonderforschungsbereich Transregio 19 일 (SFB/TR19, C2), 경제 및 기술 프로젝트 ZIM - KF 2727801MD0 연방 교육부 및 혁신 능력의 센터에 의해 지원되었다 ZIK - 하이킹, 교육 및 연구, 독일 연방 교육부의 BMBF FKZ 03Z2CN12). 동물과 주택과 실험은 유럽 연구소 동물 과학 협회 (FELASA)의 연구실 동물 과학 (Gesellschaft 털 Versuchstierkunde, GV-SOLAS)와 제휴를위한 학회의 권고에 따라 수행되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunosorba preservation solution | Fresenius Medical Care | 903609211 | |
| Collagenase type 2 | Cell System | LS004176 | |
| BSA, fatty acid free | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Fura-2 AM | Sigma-Aldrich | F0888 | 1 mg/ml in DMSO |
| Econo Pac Chromatography Columns | BioRad | 732-1010 | |
| Spectra/Por Biotech Cellulose Ester Dialysis Membrane | Spectrumlabs | 131417 | |
| 4 well Chambered Coverglass | Nunc | 155383 | |
| Myocyte Calcium and Contractility Recording System | IonOptix | ||
| IonWizard 6.0 analysis software | IonOptix |
References
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