Summary
La méthode présentée offre un moyen de détecter les anticorps fonctionnels efficaces cardiotropes dans le plasma des patients atteints de cardiomyopathie dilatée, indépendamment de l'antigène spécifique, en analysant l'impact de l'immunoglobuline patient isolé sur raccourcissement cellulaire et transitoires de calcium intracellulaire dans les cardiomyocytes isolés de rats.
Abstract
La cardiomyopathie dilatée (DCM) est l'une des principales causes de l'insuffisance cardiaque chez les jeunes adultes 1. Bien que la prédisposition génétique et l'exposition à des substances toxiques sont des causes connues de cette maladie chez environ un tiers des patients, l'origine de DCM reste largement incertain. Dans un nombre important de ces patients, des auto-anticorps dirigés contre les épitopes cardiaques ont été détectés et sont soupçonnés de jouer un rôle central dans l'apparition et la progression de la maladie 2,3. L'importance de l'auto-anticorps cardiaques est soulignée par une amélioration hémodynamique chez les patients DCM après élimination des auto-anticorps par immuno 3-5. Une variété d'antigènes spécifiques ont déjà été identifiés et 2,3 anticorps contre ces cibles peuvent être détectées par des dosages immunologiques. Toutefois, ces tests ne peuvent pas distinguer entre la stimulation (et donc fonctionnellement efficace) et le blocage auto-anticorps. Il est en augmentation evidenCE que cette distinction est cruciale 6,7. Il peut également supposer que les objectifs fixés pour un certain nombre d'anticorps cardiotropes sont encore non identifiés et ne peuvent donc pas être détectée par des dosages immunologiques. Par conséquent, nous avons établi une méthode pour la détection des anticorps fonctionnellement actifs cardiotropes, indépendamment de leur antigène respectif. Le contexte de la méthode est la forte homologie habituellement observée pour les régions fonctionnelles des protéines cardiaques chez les mammifères entre 8,9. Ceci suggère que les anticorps dirigés contre les antigènes cardiaques humaines réaction croisée avec les cellules cibles non humaines, ce qui permet des tests d'IgG de patients DCM sur les cardiomyocytes de rats adultes. Notre méthode se compose de 3 étapes: d'abord, l'IgG est isolée du plasma du patient à l'aide de sépharose couplées à des anticorps anti-IgG obtenues à partir des colonnes immunoadsorption (PlasmaSelect, Teterow, Allemagne). Deuxièmement, les cardiomyocytes adultes sont isolés par perfusion de collagénase dans un appareil de perfusion de Langendorff en utilisant aprotocole modifié à partir de travaux antérieurs 10,11. Les cardiomyocytes obtenus sont joints à la laminine revêtues de couvre-objets cloisonnées et colorées avec du Fura-2, un colorant fluorescent sélectif de calcium qui peut être facilement introduit dans la cellule d'observer calcium intracellulaire (Ca 2 +) contenu 12. Dans la dernière étape, l'effet du patient IgG sur le raccourcissement de la cellule et Ca 2 + transitoires de cardiomyocytes le terrain ont stimulé est suivi en ligne en utilisant un calcium du commerce des myocytes et système de surveillance de la contractilité (IonOptix, Milton, MA, USA) connecté à un fluorescent standard inverse microscope.
Protocol
1. Isolation IgG des échantillons de patients
- Préparer des mini-colonnes immunoadsorption en remplissant 3 ml anti-IgG sépharose par 2 ml de plasma EDTA du patient dans une colonne vide Econo Pac. IgG isolement nécessite au moins 2 ml de plasma du patient.
- Placer un filtre sur le dessus de la sépharose anti-IgG, couper l'extrémité inférieure de la colonne et appuyez sur le filtre pour atteindre un débit d'environ 1 goutte / sec. Laissez la solution de conservation à court de la colonne.
- Laver la colonne avec 3 volumes de NaCl 0,9% par volume de plasma.
- Pipeter le plasma sur la colonne. Lorsque le plasma est complètement immergé dans la sepharose anti-IgG, laver avec le même volume de NaCl 0,9%.
- Volume de pipette plasma une de HCl 0,2 M glycine, pH 2,8 sur la colonne et de laisser tremper dans la sépharose. Ajouter un autre volume de la glycine HCl sur la colonne. Recueillir le débit à travers un tube de 15 ml et ajuster le pH à 7,3 avec 0,5 M de Tris-HCl, pH 8,0.
- Pour régénérer la colonne, Laver avec des volumes de plasma HCl 3 glycine. Après un dernier lavage avec deux volumes de NaCl à 0,9%, la colonne peut être utilisée pour l'échantillon de plasma suivant. En variante, la colonne peut être rempli avec une solution de préservation et conservé à 4 à 8 ° C pendant un maximum de 4 semaines.
- Destiné à être utilisé sur des cardiomyocytes, la fraction IgG collectés doit être dialysée contre du tampon expérimentale (EB). Pour la préparation de EB, ajouter 117 mM de NaCl, 2,8 mM KCl, 0,6 mM de MgCl2, 1,2 mM KH 2 PO 4, 1,2 mM de CaCl2, 10 mM d'HEPES et 20 mM de glucose à 1 L d'eau distillée sur un agitateur magnétique et ajuster le pH à 7,3.
- Remplir la fraction IgG à un tube d'ester de cellulose membrane de dialyse ayant un poids moléculaire de couper 100 kDa. Placer le tube dans 1 L EB et remuer lentement avec un agitateur magnétique à 4 ° C. Après 8 heures, transférer le tube de dialyse dans 3 L d'EB frais et dialyse pour une autre h 20 à 4 ° C.
- À la suite de dialyse, de la chaleur de l'échantillon pendant 30 min à 57 ° C dans un bain d'eau à inactivatfacteurs du complément e. Déterminer la concentration totale en IgG et préparer des aliquotes contenant 330 ug de chacun des IgG. Lors de l'ajout de l'échantillon à cardiomyocytes de mesure (étape 4.3), remplir les aliquotes de 1 ml avec EB. Aliquotes non diluées peuvent être conservés à -20 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
2. Isolement de cardiomyocytes de rats
- Pour la préparation de Ca 2 +-tampon d'isolement libre (IB), ajouter 110 mM de NaCl, 2,6 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM KH 2 PO 4, HEPES 20 mM et 11 mM de glucose à 1 L d'eau distillée en utilisant un champ magnétique agitateur. Ajuster le pH à 7,4 à la température ambiante et filtrer à travers un filtre de 0,2 um bouteille supérieure pour la stérilisation.
- Remplir 80 ml d'IB dans le réservoir supérieur d'un système de perfusion de Langendorff thermostaté. Ajuster les réglages du thermostat pour maintenir une température tampon de 37 ° C et aérer tampon avec 95% 2 O / 5% de CO 2 pendant 30 min.
- Peser environ 10.000 - 12.000 U de collagenase de type II, 175 mg d'acides gras libres BSA et dissoudre dans 20 ml contenant IB 22,5 pi d'une solution 100 mM CaCl stock 2. Contrôler le pH du tampon d'isolement dans le réservoir supérieur et l'ajuster si nécessaire.
- Anesthésier un rat Wistar de 175 - 200 g à 375 mg / kg poids corporel thiopental. Ajouter 2500 UI d'héparine à la solution de thiopental. Après thoracotomie, au cœur d'accise soigneusement avec une crosse de l'aorte intacte et le transférer dans glacée NaCl à 0,9%. Nettoyez le cœur du sang et des tissus environnants et le transfert de frais de NaCl 0,9%. Exposer l'aorte, ouvrez le réducteur de débit du système de Langendorff pour obtenir une vitesse de chute des 2-3/sec et fixez le coeur de la canule.
- Perfuser le coeur jusqu'à 3 min avec un débit de 1 goutte / sec pour laver les résidus de sang. Commenceront à circuler le BI dans le système de Langendorff. Retirer 20 ml de tampon du réservoir supérieur, remplissez la solution de collagénase et de remplissage de tampon autant que nécessaire pour atteindre 80 ml. Faire circuler le c solution pour un autre ollagenase min 27. Débit doit être contrôlé périodiquement et maintenue à 1 goutte / sec en utilisant le réducteur de débit.
- Détachez le coeur de la canule, propre à partir de l'aorte et les oreillettes et les couper en petits morceaux. Laisser la solution de collagénase à courir dans le réservoir inférieur, réduisez le volume à un maximum de 40 ml et encore digérer les ventricules hachées pendant 10 à 15 min sous aération continue avec 95% O 2/5% de CO 2. Ensuite, filtrer la suspension de cellules à travers une gaze 200 um maille dans un tube de 50 ml.
- Restaurer le Ca 2 + contenu des cellules en 3 étapes: centrifuger la suspension cellulaire à 43 xg pendant 2 min à température ambiante et remettre les cellules en IB de 10 ml contenant 200 uM CaCl 2. Centrifuger de nouveau et remettre en suspension les cellules dans 10 ml IB avec 500 uM CaCl 2. Après une centrifugation finale remettre en suspension dans les cardiomyocytes EB filtrée stérile (voir 1.8) à une densité de 50.000 cellules / ml.
- Enduire une lamelle 4 bien chambré avec 10 ug par la laminine bien et attendez qu'il soit complètement sec.
- Remplir 1 ml de la suspension des cardiomyocytes dans chaque puits à l'aide d'une micropipette avec une pointe de coupe. Laisser les cellules adhérer pendant 1 h à température ambiante.
- Diluer 10 ul de la 1 mg / ml Fura-2 AM solution mère dans 5 ml EB. Conserver la solution de coloration dans l'obscurité.
- Enlever cellules tampons et les personnes seules de la lamelle et la pipette 0,5 ml de la solution de coloration dans chaque puits. Incuber les cellules pendant 10 min sous agitation modérée. Par la suite, enlever la solution de coloration, laver les cellules une fois avec 1 ml EB et enfin remplir EB 0,5 ml dans chaque puits. Evitez la lumière directe pendant le processus de coloration et de toujours garder les cellules colorées dans l'obscurité.
4. Enregistrement de raccourcissement de la cellule et Ca 2 + transitoires
- Placez la lamelle chambré sur une m fluorescence inverseicroscope relié à un myocyte calcium et d'enregistrement de la contractilité. Positionner une électrode de mesure avec un tube d'afflux et écoulement dans le premier puits. Cardiomyocytes Superfuse avec 1 ml / min et EB commencer la stimulation électrique (20 V, 1 Hz, 5 msec). Permettre aux cellules de s'adapter à la stimulation pendant environ 2 min.
- Choisissez un des cardiomyocytes tige intacte avec des stries en forme claire et constante contraction. Positionner la cellule dans le centre du champ visuel et ouvrir le canal de caméra vidéo. Orientez la cellule horizontalement dans la zone vidéo en tournant l'adaptateur cadrage cellule et déplacer la platine du microscope.
- Ajuster la détection de bord des éléments de commande de la zone vidéo (figure 2), ouvrir le canal de fluorescence et d'enregistrement de 10 à 15 pour obtenir des contractions du raccourcissement de la cellule initiale et transitoire du Ca 2 +.
- Fermer le canal de lumière microscope pour éviter le blanchiment de la tache de fluorescence. Mettez le débit à travers de EB à l'échantilloncontourner avec une vanne 3 voies et les cardiomyocytes superfuse avec 1 ml d'IgG des patients. Arrêter la pompe juste avant que l'air atteint le puits.
- Ouvrez le canal de lumière et enregistrer un autre 10 à 15 contractions pour obtenir la réponse cellulaire aiguë. Interrompre l'enregistrement et fermer le canal de lumière à nouveau. Répétez l'enregistrement après 2 et 5 min.
- Retirez l'électrode du puits. Nettoyez les tubes à fond avec EB et continuer avec le bien suivant de la lamelle chambré.
- Analyser le raccourcissement de la cellule et le Ca 2 + avec le logiciel transitoire IonWizard utilisant la "Edge-Length/Length" et le "fura 2-numérique soustraite / Ratio" fenêtre, respectivement. Calculer la variation pour cent du raccourcissement de la cellule initiale et transitoire du Ca 2 + de la hauteur de crête visée à la ligne de base (bl% de pic h) pour l'aigu, le 2 min et la réponse 5 min.
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Representative Results
Deux exemples pour la mesure de inotropie cellulaire dans le champ stimulé cardiomyocytes adultes (figure 2) en utilisant un myocyte Ca 2 + et d'enregistrement de la contractilité sont donnés ci-dessous. Figure 3 donne une impression d'une mesure de contrôle, tandis que la figure 4 l'effet des anticorps cardiodépresseur d'un patient avec du DCM est représenté.
Dans les deux exemples, le shortening cellule initiale et Ca 2 + transitoires lors de surfusion avec EB présentent des pics clairs et constants, ce qui est une condition préalable à l'analyse. Nous savons par expérience que les cellules présentant un premier pic bl% h dans la gamme de 7 - 14% conviennent le mieux pour notre application, tout en cardiomyocytes avec la contractilité initiale inférieure ou supérieure ont souvent tendance à présenter des changements non provoquées de raccourcissement de la cellule. Après l'application d'IgG témoin, c'est à dire IgG isolées chez des sujets témoins en bonne santé, inotropie des cardiomyocytes reste unchanged toute la mesure complète (Figure 3A). En revanche, avec surfusion contenant des anticorps IgG cardiodépresseur est suivie d'une diminution de raccourcissement de la cellule (figure 4A), accompagnée d'une réduction de Ca 2 + transitoires qui est généralement moins prononcée (figure 4B). En général, nous observons qu'un nouvel état d'équilibre est établi à la fois raccourcissement de la cellule, et Ca 2 + transitoires, au bout de 2 min, ce qui est conservée jusqu'à la fin de la mesure après 5 min. L'exemple donné montre un effet inotrope négatif très clair avec une baisse de raccourcissement des cellules de 54% et de Ca 2 + transitoires de 31% après 5 min. Toutefois, les changements sont souvent moins prononcées. Par conséquent, nous avons défini une limite supérieure et inférieure pour inotropie négative et positive en moyenne ± 2SD pour le contrôle IgG d'un groupe témoin sain pour éviter les faux résultats positifs. En conséquence, les cellules ne sont considérés comme inotrope négatif ou positif wchangements de poule de raccourcissement de la cellule dépasse ce seuil, que nous avons déterminée à environ ± 10%.
Figure 1. Diagramme de la détection d'auto-anticorps en mesurant la contractilité des cardiomyocytes. Tout d'abord, IgG est extrait des échantillons de patients en utilisant des anti-IgG colonnes de sépharose (surligné en jaune). Deuxièmement, les cardiomyocytes sont isolés de coeurs de rats par digestion enzymatique et colorées avec Fura-2 (surligné en bleu). Enfin, raccourcissement de la cellule et Ca 2 + transitoires sont contrôlées en ligne en utilisant un calcium des myocytes et système d'enregistrement contractilité (surligné en vert).
Figure 2. Cardiomyocytes de rat isolé positionné dans la zone vidéo du système d'enregistrement contractilité des myocytes. Le graphique ci-dessous la cellule affiche les traces d'intensité calculé utilisés pour la détection de bord. Les flèches indiquent les éléments de bord de contrôle de détection. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 3. Exemple représentatif d'une mesure de contrôle. Raccourcissement cellulaire (A) et Ca 2 + transitoires (B) a été suivie en ligne avant (initial), immédiatement (aiguë), 2 min et 5 min après surfusion avec des IgG. Les lignes rouges indiquent la pause de la mesure.
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Figure 4. Exemple de mesure d'un échantillon contenant des anticorps IgG cardiodépresseur. Raccourcissement cellulaire (A) et Ca 2 + transitoires (B) a été mesurée en ligne avant (initial), immédiatement (aiguë), 2 min et 5 min après surfusion avec des IgG. Les lignes rouges indiquent la pause de la mesure.
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Discussion
La méthode présentée offre un moyen approprié pour détecter fonctionnellement efficaces autoanticorps cardiaques chez les patients atteints de DCM d'origine incertaine. En comparaison à d'autres méthodes, par exemple la détection d'anticorps fonctionnels actifs contre la β1-adrénergiques par leur impact sur les taux d'AMPc 6, notre méthode est indépendante d'un épitope spécifique. Bien sûr, il existe d'autres épitopes essais indépendants décrits dans la littérature, c'est à dire compter le rythme des battements des cardiomyocytes néonataux 13, mesurant les courants calciques dans les cardiomyocytes adultes par la technique de patch-clamp ou la contractilité des fibres de Purkinje isolées 14. Dans avantage de ces méthodes, l'analyse présentée ici prend du temps et fournit des données objectives moins augmenté en raison de l'protocole standardisé. En outre, elle permet la détection de l'impact sur la contractilité et transitoires de calcium intracellulaire dans le même temps.
Semblable à otelle dans des essais in vitro, les résultats obtenus avec la méthode présentée peut être contestée par les conditions artificielles appliquées aux cellules. Cardiomyocytes de rats nouveau-nés de culture ont été rapportés pour fixer préférentiellement entre micropiliers avec une distance de 30 um ou moins sur des substrats plats. Lorsqu'il est attaché à celui-ci, les cellules ont été trouvés pour afficher fibres de stress d'actine et non ordonnées myofibres 15. Cependant, l'impact potentiel des fibres de stress dans le dosage de la contractilité décrit ici peut être négligeable puisque cardiomyocytes adultes ne sont cultivés pendant une période de temps très court d'un maximum de 6 heures ce qui peut réduire la formation de ces fibres et le raccourcissement cellulaire et Ca 2 + transitoires sont soumises à la contractilité initial de la cellule respective pour minimiser l'influence des différences individuelles entre les cellules. Une autre limitation est la forte demande des animaux de laboratoire et de temps. Par conséquent, la méthode n'est pas adaptée pour criblage à haut débit de patients.
D'autres implémentations sont envisageables pour la méthode. En raison de l'indépendance d'antigène peut être appliqué à d'autres maladies cardiovasculaires, idiopathiques où un impact est supposé auto-immune.
En outre, les mesures de contractilité peut être facilement ajustée pour étudier les effets fonctionnels d'autres substances. Ceci permet d'analyser un impact potentiel de la drogue sur le cœur, ce qui peut par exemple être bénéfique dans le développement de médicaments et de tests. Outre les paramètres de base fournis par les changements de raccourcissement de la cellule et Ca 2 + par rapport au départ, des informations complémentaires peuvent être obtenues à partir des mesures qui permet une définition plus détaillée de l'effet observé. Par exemple, le départ et la vitesse de retour peut être calculé à partir des événements de raccourcissement de cellules qui pourraient indiquer un effet spécifique et systolique diastolique d'un médicament ou d'anticorps.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le Transregio Sonderforschungsbereich 19 (SFB/TR19, C2) de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), le ministère fédéral de l'Économie et de la Technologie du projet ZIM-KF 2727801MD0 et le Centre de Compétence Innovation - réponses immunitaires humorales dans les maladies cardio-vasculaires ( ZIK-RANDONNÉE, BMBF FKZ 03Z2CN12) du Ministère fédéral de l'Education et de la Recherche, Allemagne. Logement et des expériences avec des animaux ont été effectuées en conformité avec les recommandations de la Société pour la science des animaux de laboratoire (Gesellschaft für Versuchstierkunde, GV-SOLAS) et la Fédération européenne des animaux de laboratoire Science Association (FELASA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunosorba preservation solution | Fresenius Medical Care | 903609211 | |
| Collagenase type 2 | Cell System | LS004176 | |
| BSA, fatty acid free | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Fura-2 AM | Sigma-Aldrich | F0888 | 1 mg/ml in DMSO |
| Econo Pac Chromatography Columns | BioRad | 732-1010 | |
| Spectra/Por Biotech Cellulose Ester Dialysis Membrane | Spectrumlabs | 131417 | |
| 4 well Chambered Coverglass | Nunc | 155383 | |
| Myocyte Calcium and Contractility Recording System | IonOptix | ||
| IonWizard 6.0 analysis software | IonOptix |
References
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