Summary
라고 기술
Abstract
식물 세포의 벽은 생리학과 식물의 개발에 중요한 역할을하고 인간 사회 (예 : 나무, 종이, 섬유 및 바이오 연료 산업) 1,2의 원료를 제공 이기종 glycans의 복잡한 matrixes 있습니다. 그러나, 이러한 구성 요소의 생합성과 기능을 이해하는 것은 도전 남아있다.
세포 벽 glycans는 화학적 및 빌딩 블록, glycosyl 잔류의 복잡성으로 인해 conformationally 다양합니다. 이러한 형태의 여러 위치에서 연계 및 링 구조에서 차이가이 이성질체 또는 anomeric 구성 할 수 있으며,뿐만 아니라, 비 설탕 잔류의 배열로 대체됩니다. Glycan 구성도 다른 셀 및 / 또는 조직 유형 또는 단일 셀 벽 3의 하위 도메인에 따라 다릅니다. 또한, 자신의 구성은 개발 한 동안, 또는 환경 단서 사에 대한 응답으로 수정됩니다.
예에2000 유전자의 운은 식물 세포 벽 이기종 glycans의 복잡한 matrixes Arabidopsis 5 세포벽 glycan 생합성 및 수정에 참여 할 것으로 예상 했었 있습니다. 그러나, biosynthetic 유전자의 비교적 적은은 기능적으로 4,5 특징되었습니다. 유전자는 종종 differentially 세포 유형 6 시까 종종 낮은 수준에서 표현되기 때문에 역 유전학 방법이 어렵습니다. 또한, 돌연변이 연구는 종종 적절한 세포벽 기능이 7 유지하기 위해 유전자 중복이나 보상 메커니즘에 의해 방해되어 있습니다. 따라서 소설 접근 방식은 빠르게 glycan 구조의 다양한 범위를 특징하고 이해 세포벽 생합성 및 수정에 기능 유전체학 접근을 촉진하기 위하여 필요합니다.
단클론 항체 (mAbs)는 8,9 식물의 glycan 구조와 분포를 결정하는 중요한 도구로 부각되었습니다. 이러한 지구 인식pectins, xyloglucans, xylans, mannans, 글루칸과 arabinogalactans 등의 식물 세포의 벽 glycans의 주요 클래스, 내 현재 inct의 epitopes. 최근의 사용은 공장 및 조직 유형 동시에 9,10,11의 넓은 범위에서 glycans의 상대적 풍부한을 결정하기 위해 대규모 심사 실험으로 확장되었습니다.
여기 감소 시약 및 샘플 볼륨과 소형화 microarray 플랫폼을 사용하여 상영 할 (100 초) 여러 샘플을 수 종합 Microarray 폴리머 프로파일 (CoMPP) (그림 1 & 2) 10,11라는 microarray 기반 glycan 검사 방법을 제시한다. microarray의 현장 신호 공식적으로 glycan 에피토프의 발생에 대한 반 정량 데이터를 제공하기 위해 정량화 할 수 있습니다. 이 방법은 잘 복잡한 생물학적 시스템 12 glycan 변경 사항을 추적하고 세포벽 성분의 글로벌 개요를 제공하는 데 적합합니다 특히 때 사전 지식 OF이 사용할 수 없습니다.
Protocol
1. 조직 수집 및 준비
- 관심의 각 조직 최소한 세중의에 식물 조직의 100 밀리그램 신선한 무게를 (10 MG 건조 중량의 최소)를 수집합니다. 다음 단계는 식물 조직으로부터 세포 벽 재료의 준비에 대해 설명합니다. 저장 조직의 경우, 해제 - 원하는 녹말은 효소 이전에 13에 설명 된대로 세포 벽 고분자의 추출을하기 전에 제거됩니다.
- 24 튜브 어댑터 세트와 3 밀리미터 텅스텐 카바이드 비즈 (30 Hz에서, 2 X 30 초)로, Qiagen TissueLyser II를 사용하여 액체 질소로 고급 분말로 샘플을 균질화. 몇 샘플을 처리하는 경우 또는 박격포와 유봉이 사용됩니다.
- 10 ML 플라스틱 원뿔 튜브에 homogenates를 전송합니다.
- RT 10 ML 80% 브이 / v 에탄올에 homogenates을 닦고 2 분 동안 힘차게 vortexing하여 세포벽 자료를 준비합니다.
- 3500 XG에서 샘플을 원심 분리기와 표면에 뜨는 폐기. 표면에 뜨는 명확 때까지 70 % 에탄올 특히 엽록소를 포함하는 조직을 위해, 또는 적어도 세 번 씻어 반복합니다.
- 100 % 아세톤과 최종 세척을 수행하고 밤새 공기 건조에 알코올 불용성 잔류 물 (AIR)를 포함하는 알약을 둡니다.
- 체 공기 좋은, 균일 한 분말을 달성하고 제대로, 언젠가는 homogenate에 남아있는 지상 입자를 큰 제거하는 0.4 mm 2 메쉬와 샘플.
- microtubes, 샘플의 혼합을 지원하기 위해 3mm 유리 구슬을 포함하는 각에 10 MG의 AIR 샘플 무게.
2. 세포 벽 Glycans의 추출
- pectins과 관련된 Pectins, 그리고 고분자는 각 샘플의 50 μM CDTA (산도 7.5) 500 μl를 추가하여 샘플에서 추출됩니다.
- 간단히 소용돌이 튜브는 용매는 샘플 소재와 접촉을 보장하고 8 Hz에서 3 시간 동안 TissueLyser를 사용하여 혼합합니다.
- 주의 깊게 12,000 XG에서 샘플을 원심 분리기 연구4 ° C.에서 supernatants과 상점을 emove
- 13,000 X g에서 남아있는 용매, 소용돌이와 원심 분리기를 희석 및 제거 할 드 - 이온화 물 1 ML에 알약을 씻으십시오. 펠렛을 방해하지 않으면이 단계를 반복하고 다음 단계로 진행하기 전에 튜브에서 모든 액체를 제거합니다.
- 교차 연결 glycans는 순차적으로 0.1 %로 4M NaOH의 500 μl로 남아있는 세포 벽 펠렛에서 추출됩니다 단계 2.1에서 설명한 동일한 절차를 사용 w / v를 NaBH4 - CDTA 추출을 위해 2.4. NaBH 4함으로써 다당류의 필링베이스를 방지 알코올로 다당류의 감소 끝에 알데히드 (또는 케토) 그룹을 줄이기 위해 추가됩니다.
- 원심 분리 후, supernatants는 다시 제거됩니다 4 ° C에 저장하고, 산탄은 다음 추출을하기 전에 드 - 이온화 물에 두 번 세척.
- 선택적 단계로서, 이러한 셀룰로오스 등의 잔류 고분자는, 500 μl cadoxen (31 % V / V 1,2 - diami으로 압축이 풀립니다2.4 - 2.1 단계에 설명 된대로 동일한 절차를 사용하여 0.78 M CDO와 noethane). 또한, 남은 펠릿의 절대 셀룰로오스 내용은 아세트산 / 질소 assays을 (토론 참조)를 사용하여 결정될 수있다.
3. 인쇄 Microarrays
- 원심 분리기의 supernatants는 미립자를 제거 13,000 XG에서 세포 벽 고분자를 추출 포함하는.
- 잘 폴리 프로필렌 384 샘플 조직 유형 및 추출 종류에 따라 배열되어 사전 정의 된 사용자 정의 레이아웃을 사용하여 microtiter 접시에 각 샘플의 50 μl를로드합니다.
- 탈 이온수와 0, 5, 25 × 시리얼 희석 시리즈의 세포벽 폴리머 샘플을 희석.
- 이러한 핀 높이 수집 및 시간을 머물러 있으며, 세척 단계와 같은 매개 변수가 microarrayer를 제어하는 소프트웨어에 설정되어 있습니다.
- 인쇄 챔버의 습도는 샘플 증발을 방지 60 %로 제어됩니다.
- 인쇄 작업이 LabNEXT softwa를 사용하여 시작됩니다재와 microarray 레이아웃에 해당하는 프로그램입니다.
- 로봇은 기계의 평면 판에 부착되어 20 X 20cm의 니트로 셀룰로스 막에 샘플 판에서 솔루션을 인쇄 할 모세관 채널 핀을 사용합니다. 배열의 각 지점이 솔루션의 15 NL를 포함하고 세중의에 인쇄됩니다.
- 인쇄 작업이 완료되면 동일한 microarrays는 개별 배열에 막과 컷에 서로 옆에 인쇄됩니다.
- 각 실험에서 배열을 더 많거나 적은 샘플, dilutions 또는 복제를 수용하기 위해 수정할 수 있습니다.
4. Glycan Microarrays의 프로빙
- 인쇄 후, 비 특정 바인딩을 줄이기 위해 인산에 용해 w / V 무 지방 우유 분말은 2 시간 동안 실온에서 (MPBS) 생리 버퍼 5 %의 개별 microarrays를 차단합니다.
- MPBS에서 2 시간에 세포 벽 glycan epitopes에 대한 특정 단클론 항체와 프로브 microarrays. 단클론 antib의 대부분세포 벽 glycans에 대한 오디 세 회사의 상업적 사용할 수 있습니다, Biosupplies ( www.biosupplies.com.au ), Carbosource 서비스 ( www.carbosource.net )와 PlantProbes ( www.plantprobes.net ).
- 부정적인 컨트롤 만 MPBS도없고, 1 차 항체와 incubated microarray를 포함합니다.
- 인산 3 회가 아닌 특정 바인딩을 제거 할 5 분에 (PBS) 생리 버퍼 microarrays을 씻는다.
- 2 시간에 MPBS에 고추 냉이 퍼 옥시 데이즈 (HRP)에 복합 이차 항체와 microarrays를 조사. 세포 벽 glycans에 대한 대부분의 단클론 항체 안티 마우스 또는 안티 쥐 보조 항체가 필요합니다.
- 비 특정 바인딩을 제거하는 5 분에 3 회 PBS 버퍼로 세척 단계를 반복합니다.
- chromogenic (3,3-Diaminobenzidine) 또는 chemil를 사용하여 microarrays를 개발uminecent (루미놀) 기판.
5. 양을 정함
- 개발 후, 고해상도 (1,200 dpi의) 바탕 화면 스캐너를 사용하여 개별 microarrays를 검색 및 제외, 16 비트 TIFF 파일 (그림 3)로 이미지를 저장합니다.
- 자동 격자 도구가 구비 이미지 처리 소프트웨어 (LabNEXT) Xplore 사용하여 각 영역의 핵심 강도를 계산할 수 있습니다. 통합 현장 강도는 각 지점을 둘러싼 그리드 영역에서 픽셀의 합계에서 파생됩니다.
- 각 microarray에 대한 그리드 데이터는 txt 파일로 내보낼 수 있습니다 수동으로 분석을 위해 Excel 스프레드 시트로 가져올 수 있습니다. 온라인 도구 ( http://microarray.plantcell.unimelb.edu.au/가 ) 자동으로 번역 및 개인 txt 파일에서 데이터를 처리하기 위해 개발되었습니다.
- 통합 현장 강도가 인쇄 복제에서 평균과 '비열한 자리를 얻기 위해 dilutions 수 있습니다각 샘플에 대한 강도 '값 (그림 2). 또한, 배열에 하나의 희석 가치에 상응하는 현물 신호는 각 샘플에 대한 상대적 glycan의 에피토프의 풍요 로움을 수량화하는 데 사용됩니다.
- 다른 샘플 사이의 상대적인 평균 스폿 농도는 Excel 또는 온라인 heatmapper 도구 (에서 조건부 서식 사용하는 히트 맵 (그림 4)로 제공됩니다 http://bar.utoronto.ca/welcome.htm을 ). 각 항체 유형에 대한 데이터는 100 수정되어 5 %의 컷오프 값은 배경 신호 탐지를 제거하는 부과됩니다.
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Representative Results
Nicotiana alata 꽃부터 6 조직 유형 (약의 필라멘트, 꽃가루, 난소, 꽃잎, sepals 및 오명)에서 glycans의 상대적인 풍요 로움은 CoMPP를 사용하여 결정되었다. 그림 3A은 부분적으로 (저) methylesterified homogalacturonan (HG), pectic 다당류 14 일 발생 에피토프에 대한적인 mAb JIM5 특정와 탐색 된 대표 microarray를 보여줍니다. JIM5 에피토프가 모든 꽃 조직의 CDTA 추출물에서 발견하는 것은 stigmatic 조직 (그림 3A 및 4A)에서 꽃가루와 최저에 최고입니다. 흥미롭게도, JIM5의 에피토프는 화분에 NaOH 추출물에서 발견되지만 다른 조직의 (그림 3A).
관심 glycan의 발생에 대한 양적 정보는 microarray의 내부 기준 (그림 3B) 등의 다당류를 정제하는 일련의를 포함하여 얻어진다. 다른 t의 추출물의 핵심 스폿 강도 적인 mAb JIM5과 탐색 문제는 homogalacturonan의 시리얼 희석 (메틸 에스테르 화의 25 % 정도, DE)에서 파생 된 현장 신호에 일치합니다. 난소 조직에서 JIM5 에피토프를 포함하는 homogalacturonan의 약 157 μg 총 세포 벽 잔류 물 (그림 3C)의 약 1.5 % (중량)에 대한 회계, 각 샘플에 존재했다. JIM5 에피토프를 포함하는 625 μg의 homogalacturonan 총 세포 벽 잔류의 약 6.25 % (중량)에 대한 회계, 화분 조직에 존재했다 반면.
15 glycan의 epitopes의 상대적 풍부한 그림 컬러 바의 강도는 각 샘플에 대한 조정 평균 현장 강도에 비례 4 히트 맵으로 요약되어 있습니다. 이 데이터의 회화 표현도 그림 5에 도시와 우리 빠르게 다른 꽃 조직 사이의 glycan 에피토프의 발생의 차이를 해석 할 수 있습니다.
ontent "> 우리의 결과는 개개인의 glycan의 epitopes는 고유 N. alata 꽃 조직 사이에 배포됩니다 나타냅니다. 예를 들어, LM13 에피토프가 ((1-5) - α-L-arabinan 15 선형) 약의 필라멘트와 꽃받침 조각 조직에서 가장 풍부하다 다른 조직 (그림 5D)에 비해.이 패턴이 짧은 체인 (1-5) - α-L-arabinan 우선적적인 mAb LM6 (그림 5E 호야) 15에 의해 감지 epitopes. 교차 연결 glycans의 그것과 인상적인 대조에하면 뚜렷한이 N. alata 꽃의 발생의 패턴. LM10의 에피토프 (낮은 - 치환 (1-4)-β-D-크 실란)은 다른 조직에 비해 단점 조직이 풍부하지만, 난소 조직에서 (그림 5G) 결석입니다. LM15 heteromannans는 (그림 5J) 약의 필라멘트에서 가장 높은 반면 xyloglycan의 epitopes는 꽃잎과 약 필라멘트 다른 조직 (그림 5H)에 비해에서 최고입니다.그림 1. 종합 Microarray 폴리머 프로파일 (CoMPP)의 5 가지 주요 단계를 나타내는 간단한 순서도.
그림 2. 종합 Microarray 폴리머 프로파일 (CoMPP)의 주요 단계의 그림. (A) 식물 조직은 복제 셋처럼 수집 균질하고 70 % EtOH 및 알코올 불용성 잔류 물 (AIR)를하기 위해 아세톤으로 세척됩니다. (B) 세포 벽 glycans는 순차적으로 50 ㎜ CDTA, 4 M NaOH와 AIR 샘플에서 추출됩니다. (C) 추출 된 세포 벽 glycans는 microarray 로봇을 사용하여 니트로 셀룰로스에 인쇄되어 있습니다. 각 샘플은 세 농도와 네 가지 인쇄 복제 일련의로 표현된다tes. (D) 인쇄 배열 세포 벽 glycans의 epitopes로 이동 mAbs과 함께 개별적으로 탐색 할 수 있습니다. (E) 현장 신호 txt 파일과 상대 평균 명소 강도 값 자동으로 온라인 데이터 처리 도구를 사용하여 계산됩니다로 내보낼 microarray 이미징 소프트웨어를 사용하여 평가합니다.
Nicotiana alata 꽃 조직의 그림 3. Glycan 프로파일. (A) A 대표 microarray는 단클론 항체 (적인 mAb) homogalacturonan에 대한 JIM5 특정 (일부, 낮은 methylesterification)로 탐색은 부정적, 16 비트 TIFF 파일로 표시됩니다. (B) 관심 glycan 에피토프를 포함하는 다당류의 금액은 다당류 표준 시리즈를 인쇄하여 정량화 할 수 있습니다. (C) 관심 샘플의 일체형 현장 강도가적인 mAb에 의해 탐지JIM5가 계산 및 샘플이 에피토프를 포함하는 다당류의 양 (μg)을 추정 할 수있는 표준 곡선에 일치합니다.
그림 4는. Nicotiana alata 꽃 조직의 Glycan 프로파일이 히트 맵으로 표시. 색상 강도는 상대적으로 평균 스폿 신분 값 (스케일 바)에 비례한다. 단클론 항체 (상단에있는)에 의해 감지 15 glycan의 epitopes의 상대 풍부은 CDTA와 NaOH (왼쪽)와 추출 된 여섯 조직 유형 분석되었다. pectins, glycans과 아라 비노 갈 락탄 단백질 (AGPs)를 상호 연결, glycan의 epitopes는 다당류의 세 다양한 클래스로 나눌 수 있습니다. 나, 메틸 에스테르 화, DP, 중합의 정도,적인 mAb, 단클론 항체, AGP, 아라 비노 갈 락탄 단백질.
Nicotiana alata 꽃 조직의 그림 5. Glycan 프로파일은 pictorially 차지했다. AL 다른 꽃 조직의 mAbs에 의해 감지 12 glycan의 epitopes의 상대적 풍요 로움을 나타냅니다. 규모의 바 색상 강도는 CDTA 또는 NaOH 추출물 또는 두 가지 모두의 합 중 하나에서 파생 된 상대적 평균 현장 IDENTITY 값에 비례합니다. 나, 메틸 에스테르 화, DP, 중합의 정도,적인 mAb, 단클론 항체,. AGP, 아라 비노 갈 락탄 단백질 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
CoMPP는 단 몇일 만에 수백 개의 공장 파생 샘플 glycan 구성을 프로파일에 대한 신속하고 민감한 방법입니다. 이 방법은 lectins, 수용체, 그리고 항체 16와 같은 glycan 결합 단백질과 탄수화물의 상호 작용 높은 처리량 검사에 대해 이미 사용 가능한 박테리아 나 포유류의 glycan 배열 플랫폼을 보완합니다. 세포 벽 glycans를 검출하기위한 가능한 프로브의 큰 다양성으로,이 식물 세포 벽의 8,9의 다당류의 모든 주요 클래스에 속하는 glycan의 epitopes에 대한 자세한 정보를 얻을 수 있습니다. 그러나 이것들은 8,9를 확인 된 glycan 구조의 단지 작은 비율을 차지할, 일부 상황에서 CoMPP의 comprehensibility을 제한 할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고,이 기능은 최근 공장 glycans 17에 대한 탄수화물 구속력이 모듈의 사용 (CBMs)에 의해 확장, 또한 비 glycosyl 해상도가 특징 epitopes에 대한되었습니다이러한 glycosyl 잔류 물을 수정하고 glycan 기능에 중요한 역할을 phenolics 18 아세틸 잔류 물 19로 idues.
CoMPP은 샘플의 집합에서 glycans의 상대적 수준을 결정하지만, 알려진 표준 (그림 3B와 C)의에 특정 샘플에서 바인딩 신호를 비교하여 순차적 추출물의 에피토프 수준을 수량화 할 수 있습니다. microarray 기반 플랫폼에서 감소 샘플 볼륨의 장점에도 불구하고, 정확하게 glycan 발생을 수량화 할 수있는 능력은 현장 신호의 현장 형태 나 채도의 차이에 의해 방해 할 수 있습니다. 이러한 문제는 (물론 잘못 탐지 등) 이전 분석, 세포 벽 재료 구절 extractant 볼륨의 양을 최적화하고, 일련의가 다음과 포유류의 glycan 배열 방법 16 설명을 복제하고 dilutions 포함하여 피할 수 있습니다. 또한, 현장 형태학의 차이는 (샘플 확산으로 인한연락처의 점에서 다른 요금 적용)가 아닌 접촉 잉크 제트 microarray 기술 16을 사용하여 극복 할 수 있습니다.
CoMPP는 세포 벽 (20)의 절연 및 준비 설립 절차와 함께 사용됩니다. 또한 관심 샘플의 glycan 내용에 대한 자세한 정보를 얻기 위해 기존의 생화학, 효소 및 물리적 방법으로 병렬로 사용할 수 있습니다. 대신 셀룰로오스 폴리머, 아세트산 / 질산의 assays를 추출하는 예를 들어 20 펙틴과 CDTA와 NaOH와 상호 연결 glycans의 연속 추출 후 남은 셀룰로오스 콘텐츠 (MG)를 수량화하는 데 사용할 수 있습니다. glycan microarrays 21 효소 치료는 샘플 사이 glycan 에피토프 배포에서 추가 차이를 보여, 또는 microarray에서 발견 epitopes 구조의 특이성을 확인 할 수 있습니다. 이러한 최근 설명한 것과 같은 독립적 인 분석 기법에 의해 glycan 구성의 결정 우리는 glycans는 N.의 장기 나 조직을 특정 방식으로 배포됩니다 것을 보여 alata 꽃. 이 정보는 glycan epitopes 또는 glycan이 서로 다른 세포 유형에 존재하는 효소를 합성하거나 수정의 생물학적 기능에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. CoMPP은 이전에 개발 23,24 동안이나 돌연변이 10,25에 대응 유형 (22)를 심는 관계에서 발생하는 세포 벽 변경에 대한 통찰력을 제공하고 있습니다. 요약, CoMPP는를위한 유용한 도구입니다 glycans 및 식물 세포 벽의 glycan 합성 및 수정 유전자의 다양한 역할을 연구.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
IEM은 자금 덴마크 연구위원회 (FTP 및 FNU)을 인정하고 싶습니다. ERL은 ARC DP 교부금의 지원을 인정합니다. AB는 식물 세포 벽의 부여에 우수의 ARC 센터의 지원을 인정한다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mm Tungsten Carbide beads | Qiagen | 69997 | |
| Collection microtubes (1.2 mm) | Qiagen | 19560 | 1.5 ml microfuge tubes can also be used |
| Qiagen TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| 3 mm glass beads | Sigma Aldrich | Z143928 | |
| CDTA | Sigma Aldrich | 34588 | |
| Cadmium oxide | Sigma Aldrich | 202894 | |
| 1,2-diamin–thane | Sigma Aldrich | 03550 | |
| Nitrocellulose membrane (0.22 μm pore size) | GE-water process technologies | EP2HY00010 | different pore sized membranes are suitable for different pin types |
| Xact II microarrayer robot | Labnext | 001A | the Xact II robot was fitted with a custom 20 x 20 cm ceramic plate to which the nitrocellulose membrane is attached |
| Xtend RM microarray pins | Labnext | 0037-350 | pins must be suitable for spotting on membranes |
| 384 well microtiter plates (polypropylene) | Greiner | 781207 | |
| Anti-glycan monoclonal antibodies | Plant Probes/ CarboSource/Biosupplies |
Websites; PlantProbes (www.plantprobes.net), Carbosource (www.carbosource.net) and Biosupplies (www.biosupplies.com.au). | |
| Anti-Rat IgG (whole molecule) - Peroxidase antibody produced in goat. | Sigma | A9037 | the type of secondary antibodies depends on the primary antibody used (e.g. raised in rat, mouse, goat etc). |
| SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4293 | the type of developing reagent depends on the secondary antibodies used and the detection method (colourmetric, or chemiluminecent). |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermoscientific | 34080 | see above |
| Xplore Image Processing Software | LabNext | 008 | many software types with automatic gridding tools are available to measure pixel value of microarray spots. |
| Plant polysaccharides | Sigma/Megazyme |
References
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