Summary
Мы описываем живого целого животного количественного измерения проницаемости эмбрионального мозга рыбок данио. Техника анализируется способность сохранять спинномозговой жидкости и молекул различных молекулярных весов в нейронной просвет трубки и количественное их движение из желудочков. Этот метод полезен для определения различий в проницаемости эпителия и созревание в процессе развития и болезни.
Abstract
Система желудочков мозга сохраняется среди позвоночных и состоит из серии связанных между собой полостей желудочков мозга называются, которые образуют на самых ранних стадиях развития мозга и поддерживаются в течение всей жизни животного. Система желудочков мозга находится у позвоночных, и желудочков развиваться после формирования нейронных трубки, когда центральная полость заполняется спинномозговой жидкости (ликвора) 1,2. CSF является богатой белком жидкости, которая необходима для нормального развития и функционирования мозга 3-6.
У рыбок данио желудочков мозга инфляции начинается около 18 часов после оплодотворения (HPF), после нервной трубки закрыт. Несколько процессов, связанных с формированием желудочков мозга, в том числе формирование нейроэпителия, плотным строем узел, который регулирует проницаемость и CSF производства. Мы показали, что Na, K-АТФазы необходима для мозга инфляции желудочка, влияющих всех этих процессовES 7,8, в то время Claudin 5а необходимо для формирования жесткой развязке 9. Кроме того, мы показали, что «расслабление» эмбрионального нейроэпителия, через подавление миозина, связанного с мозгом инфляции желудочка.
Для исследования регуляции проницаемости во время рыбок данио инфляции желудочка мозга, мы разработали удержания желудочка красителя анализа. Этот метод использует инъекции желудочков мозга в живом эмбриона данио рерио, техника, разработанные ранее в нашей лаборатории 10, в флуоресцентно маркировать спинномозговой жидкости. Эмбрионы затем отображаемого течением времени, как флуоресцентный краситель проходит через желудочки мозга и нейроэпителия. Расстояние красителя перед отходит от базального (без просвета) стороне нейроэпителия с течением времени количественно и является мерой нейроэпителиальных проницаемости (рис. 1). Заметим, что красители 70 кДа и меньше будет двигаться через нейроэпителия и может быть detecteD вне эмбрионального мозга рыбок данио на 24 HPF (рис. 2).
Этот краситель анализа удержания может быть использована для анализа нейроэпителиальных проницаемости в различных генетический фон, в разное время в процессе разработки, и после возмущения окружающей среды. Он также может быть полезен в изучении патологического накопления CSF. В целом, этот метод позволяет исследователям проанализировать роль и регуляция проницаемости в процессе развития и болезни.
Protocol
1. Подготовка к Микроинъекция
- Подготовка микроинъекции иглы, потянув капиллярных труб с помощью инструментов Sutter иглы съемника.
- Нагрузка микроинъекции иглы с флуоресцентным красителем (FITC-декстрана).
- Установить иглу на микроманипулятора и микроинъекции аппарата.
- Аккуратно разбить микроинъекции иглы с помощью пинцета примерно 2 мкм в ширину, однако, это будет варьироваться в зависимости от настроек микроинъектор. Для наших иглы микроинъекции, это соответствует первому области иглы от острия, что не сгибается.
- Измерьте размер капли нефти, регулировка времени впрыска и давлением, так что каждая инъекция обеспечивает 1 NL. Пример настройки для Harvard Apparatus микроинъектор являются: P баланс = 1,4 МПа, из P = 1,4 МПа, P = 22,9 вводить фунтов на квадратный дюйм, P = 67,8 ясно фунтов на квадратный дюйм с введением время 0,4 до 0,7 сек. Диаметр нашей иглу с помощью этих параметров составляет около 2 мкм. Тем не менее, настройки будут микроинъектор конкретно, платаccording, чтобы диаметр иглы.
2. Подготовка эмбрионов
- Coat 2 блюда с 1% агарозы в воде для каждого условия, тыкать отверстий в агарозном с 1-200 мкл кончика пипетки, и удалить агарозном пробки. Заполните блюда с эмбрионом массовой информации.
- Используя щипцы, dechorionate эмбрионов, которые в 18 HPF и старше под стереомикроскопа. Эмбрионы поставленный по Kimmel и соавт. 11.
- Передача dechorionated эмбрионов в первые агарозном покрытием блюдо.
- Чтобы обезболить эмбрионов, добавить Tricaine (0,1 мг / мл) на блюдо, пока эмбрионы перестали двигаться (производится в соответствии с Westerfield 12).
3. Потребители инъекционных желудочков мозга
- Orient эмбрионов таким образом, вы, глядя на их спинной стороне, положив хвост эмбриона в отверстие. Если ваш микроманипулятора находится на правой, затем переместите эмбриона, так что передний мозг находится слева и заднего мозга с правой стороны.
- Позиция иглы в шDest точки мозге желудочка.
- Осторожно пробить крышу пластины заднего мозга желудочка будучи уверенным, что не идти по глубине мозга в желток (рис. 1А).
- Вводят 1-2 п флуоресцентного красителя в желудочки убедившись, что краска заполняет всю длину желудочков мозга.
- Трансфер эмбрионов на второй агарозном покрытием блюдо заполнено эмбрионом массовой информации и повторной анестезии, как описано в 2.4.
- Немедленно приступить к визуализации, как описано в разделе 4, чтобы получить изображение нулевой момент времени.
4. Изображениями
- Orient эмбрионов с хвоста в дыру, как описано в разделе 3.1.
- Используйте рассекает микроскопом с обеих проходящем и флуоресцентного света, чтобы принять образ светлого спины. Держите увеличении постоянной между изображениями различных эмбрионов. Это позволяет прямое сравнение анализов выполняется с использованием изображения J (5.2-6).
- Без перемещения эмбриона, микроскопа или блюдо, возьмитесоответствующие флуоресцентные изображения.
- Повторите для каждого эмбриона на желаемую моменты времени.
5. Количественное Краска движение
- Слияние светлое и флуоресцентных изображений в Photoshop, как описано выше по Gutzman и Sive 10.
- Измерьте расстояние краситель проходит фронт в изображение J программное обеспечение, доступное на http://rsbweb.nih.gov/ij/ .
- Открытый объединенный файл в J изображения и использовать строки, чтобы нарисовать линию от переднего мозга петли точкой для окраски фронт на 10-20 градусов от нейроэпителия (рис. 1А). Этот регион был выбран потому, что это первое и самое заметное место красителя утечки из дикого нейроэпителия типа.
- Выберите инструмент измерения для вычисления длины строки.
- Повторите для каждой временной точке.
- Рассчитать чистую расстояние красителя перед переехал с течением времени путем вычитания расстояния при Т = 0 и с других точек времени.
- Участок награфик.
6. Представитель Результаты
Пример результатов, полученных в нейроэпителиальных анализа проницаемости с использованием диких эмбрионов типа показана на рисунке 1В-D. Чтобы точно дифференцировать проницаемость, это полезно для проверки красителей с различными молекулярными weightsto определить размер, который лишь немного вытекающей в дикого типа или контрольных эмбрионов (рис. 2). Это позволяет для идентификации генетических мутантов или экологическими условиями, либо увеличение или уменьшение проницаемости (рис. 1D, зеленых и красных линий соответственно). Для 24 нейроэпителия рыбок данио HPF, 70 кДа FITC Декстран утечки медленно, в течение 2 ч, в то время как 2000 кДа нет и 10 кДа почти сразу выходит наружу. Поэтому 70 кДа является идеальной молекулярной массой определять условия, как увеличиваться, так и уменьшаться нейроэпителиальных проницаемость.
Если игла попадает в просвет желудочка, флуоресценция Wжестокое появляться за пределами мозга при Т = 0 (в качестве примера см. Gutzman и Sive, 2009 10). Эти эмбрионы должны быть отброшены, поскольку вводится краситель изначально не содержится в мозге и нет четкого вывода о движении красителей и проницаемость neuropeithelium могут быть сделаны.
Наконец, если эмбрионы имеют небольшие желудочков или отменить завышенные желудочки головного мозга, предварительного впрыска желудочков с физиологическим раствором может быть сделано до введения флуоресцентного красителя. Это увеличивает желудочков делает последующей визуализации желудочков легче, когда инъекционных с флуоресцентным красителем. Собственные элементы управления должны быть выполнены, чтобы определить инъекции физиологического раствора нарушает нормальное развитие нервной трубки.
Рисунок 1. Время хода различные молекулярные красители веса. (A) Экспериментальная схема. Первый, Флуоресцентный краситель вводится в желудочки. X = положение иглы для инъекций. Далее спинного изображения будут захвачены с течением времени. Наконец, расстояние тронут красителя фронта от переднего мозга шарнира точки измеряется (представлена красная линия). (BC) Объединенные светлое и флуоресцентные изображения спины на 22 HPF (Т = 0 мин, B) и 24 HPF (Т = 120 мин, C). Белая линия указывает расстояние красителя фронта от переднего мозга желудочка. (D) гипотетические данные проницаемость образца. Синий = дикого типа или контроля, красный = образца с пониженной проницаемостью по сравнению с контролем, а зеленый = образца с повышенной проницаемостью по отношению к контролю.
Рисунок 2. Измерение нейроэпителиальных проницаемость для различных молекулярных красителей веса. (AE) спинного объединенной светлое и флуоресцентные изображения от 22 HPF эмбрионов дикого типа при Т = 0 мин после инъекции с FITC-Dextran из следующих молекулярного веса: 10 кДа (A), 40 кДа (B), 70 кДа (C), 500 кДа (D) и 2000 кДа (E). (А '-E') То же, что и в эмбрионе (AE) при Т = 120 мин при 24 HPF. Впереди слева. F = передний мозг, M = средний мозг, H = мозге. Asterisk = ухо.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы продемонстрировать способность количественно проницаемости жизни эмбрионального мозга рыбок данио, как это определено для вводится краситель данного молекулярного веса. Наши наблюдения, что эмбриональные нейроэпителия рыбок данио дифференциально проницаемой для красок различной молекулярной массы показывает, что краситель движется через парацеллюлярный проницаемость. Тем не менее, мы не можем исключить возможность трансцеллюлярного вклад в наблюдаемый проницаемость. Эта техника может быть применена к любой другой трубчатые структуры, как долго и как внутри, так и снаружи трубки можно увидеть и просвет может быть введен. Тем не менее, определение идеального молекулярного веса для других органов должны быть определены, как это могут отличаться между тканями и стадии развития.
Этот анализ позволит дальнейшего расследования в роли эпителиальной проницаемости в просвете инфляции и регулирование размера просвета. Кроме того, эта техника будет онLP характеризуют изменения в эпителиальной проницаемости, связанных с расстройствами, такими как гидроцефалия и поликистоз почек.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была выполнена при поддержке Национального института психического здоровья и Национального научного фонда. Особая благодарность членам Sive лаборатории за многочисленные полезные обсуждения и конструктивной критики, и Оливье Paugois для экспертов хозяйства рыбы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran, Fluorescein, Anionic, Lysine Fixable | Invitrogen | D7136, D7137, D1822, D1820, D1845 | |
| Tricaine powder | Sigma | A5040 | |
| Capillary Tubes | FHC Inc. | 30-30-1 |
References
- Harrington, M. J., Hong, E., Brewster, R. Comparative analysis of neurulation: first impressions do not count. Mol. Reprod. Dev. 76, 954-965 (2009).
- Lowery, L. A., Sive, H. Strategies of vertebrate neurulation and a re-evaluation of teleost neural tube formation. Mech. Dev. 121, 1189-1197 (2004).
- Salehi, Z., Mashayekhi, F. The role of cerebrospinal fluid on neural cell survival in the developing chick cerebral cortex: an in vivo study. Eur. J. Neurol. 13, 760-764 (2006).
- Martin, C. Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid. Int. J. Dev. Neurosci. 27, 733-740 (2009).
- Lehtinen, M. K. The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells. Neuron. 69, 893-905 (2011).
- Gato, A. Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos. Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 284, 475-484 (2005).
- Lowery, L. A., Sive, H. Totally tubular: the mystery behind function and origin of the brain ventricular system. Bioessays. 31, 446-458 (2009).
- Lowery, L. A., Sive, H. Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products. Development. 132, 2057-2067 (2005).
- Zhang, J. Establishment of a neuroepithelial barrier by Claudin5a is essential for zebrafish brain ventricular lumen expansion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1425-1430 (2010).
- Gutzman, J. H., Sive, H.
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Westerfield, M., Sprague, J., Doerry, E., Douglas, S., Grp, Z. The Zebrafish Information Network (ZFIN): a resource for genetic, genomic and developmental research. Nucleic Acids Research. 29, 87-90 (2001).
