Summary
We beschrijven een levende hele dier kwantitatieve meting voor de permeabiliteit van de embryonale zebravis hersenen. De techniek analyseert het vermogen om cerebrospinale vloeistof en moleculen met verschillende molecuulgewichten te behouden in de neurale buis lumen en meten hun beweging van de ventrikels. Deze methode is nuttig voor het bepalen van verschillen in epitheliale permeabiliteit en rijping tijdens ontwikkeling en ziekte.
Abstract
De hersenen ventriculaire systeem geconserveerd is tussen gewervelde en bestaat uit een reeks onderling verbonden holten genaamd hersenventrikels, die bij het vroegste stadium van de ontwikkeling van de hersenen en worden gedurende het leven van het dier. De hersenen ventriculaire systeem wordt gevonden in vertebraten en de ventrikels ontwikkelen na neurale vaatvorming Wanneer de centrale lumen gevuld met cerebrospinale vloeistof (CSF) 1,2. CSF is een eiwitrijke vloeistof die essentieel is voor normale ontwikkeling van de hersenen en functie 3-6.
In zebravis, hersenventrikel inflatie begint circa 18 uur na de bevruchting (HPF) na de neurale buis is gesloten. Meerdere processen worden geassocieerd met hersenventrikel vorming, met inbegrip van de vorming van een neuro-epitheel, tight junction formatie die permeabiliteit en CSF productie reguleert. We toonden aan dat het Na, K-ATPase vereist voor hersenventrikel inflatie invloed al deze werkwijzees 7,8, terwijl claudin 5a is noodzakelijk voor tight junction vorming 9. Bovendien toonden we aan dat "relaxatie" van de embryonale neuro-epitheel, via remming van myosine, wordt geassocieerd met hersenventrikel inflatie.
Om de regeling van de permeabiliteit tijdens zebravis hersenventrikel inflatie te onderzoeken, ontwikkelden we een ventriculaire kleurstof retentie-test. Deze methode gebruikt hersenventrikel injectie in een levende zebravis embryo, een techniek eerder ontwikkeld in ons laboratorium 10 om fluorescerend label de cerebrospinale vloeistof. Embryo's worden vervolgens afgebeeld in de tijd als de fluorescente kleurstof zich door de hersenen ventrikels en neuro-epitheel. De afstand voor de kleurstof zich van de basale (niet-luminale) van de neuroepitheel tijd wordt gekwantificeerd en is een maat neuroepitheliale permeabiliteit (figuur 1). Wij merken op dat kleurstoffen 70 kDa en kleinere zal bewegen door de neuro-epitheel en kan detected buiten de embryonale zebravis hersenen op 24 hpf (figuur 2).
Deze kleurstof retentie assay kan worden gebruikt om neuro permeabiliteit analyseren in een verschillende genetische achtergronden, op verschillende momenten tijdens de ontwikkeling en na milieu verstoringen. Het kan ook nuttig zijn in de behandeling van pathologische accumulatie van CSF. Over het geheel genomen deze techniek kunnen onderzoekers de rol en regulering van permeabiliteit te analyseren tijdens de ontwikkeling en ziekte.
Protocol
1. Voorbereiding voor Micro-injectie
- Bereid micro-injectie naalden door te trekken capillaire buizen met behulp van Sutter instrumenten naald trekker.
- Load micro-injectie naald met fluorescerende kleurstof (FITC-dextran).
- Monteer de naald op micromanipulator en micro-injectie apparaat.
- Voorzichtig breken micro-injectie naald met behulp van een tang om ongeveer 2 um in breedte, zal dit echter variëren afhankelijk van uw microinjector setup. Voor onze microinjectie naalden, komt dit overeen met het eerste gebied van de naald vanaf de punt die niet buigen.
- Meet druppelgrootte in olie, het aanpassen van injectie tijd en druk, zodat elke injectie 1 nl levert. Voorbeeld instellingen voor Harvard Apparatus microinjector zijn: P balans = 1,4 psi, P out = 1,4 psi, P injecteren = 22,9 psi, P clear = 67,8 psi met een injectie tijd van 0.4-0.7 sec. De diameter van onze naald het gebruik van deze instellingen is ongeveer 2 urn. Echter, zullen de instellingen worden microinjector specifiek, en variëren van eenolgens om de naald diameter.
2. Voorbereiden van de Embryo's
- Coat 2 schotels met 1% agarose in water voor elke voorwaarde, poke gaten in agarose met een 1 tot 200 ul pipet en verwijder agarose pluggen. Vul gerechten met embryo media.
- Met behulp van een tang, dechorionate embryo's die zijn 18 hpf of ouder onder een stereomicroscoop. Embryo's zijn geënsceneerd volgens Kimmel et al.. 11.
- Overdracht dechorionated embryo's naar de eerste agarose gecoate schaal.
- Om embryo verdoven, voeg tricaine (0,1 mg / ml) aan de schotel totdat embryo stopt met bewegen (gemaakt volgens Westerfield 12).
3. Het injecteren van de hersenventrikels
- Orient embryo's, zodat u op zoek bent naar de dorsale zijde door de invoering van de staart van het embryo in het gat. Als uw micromanipulator is rechts verplaats de embryo zodat de voorhersenen is naar links en naar rechts achterhersenen.
- Plaats de naald op widest punt van achterhersenen ventrikel.
- Voorzichtig doorboren dakplaat van achterhersenen ventrikel zorg ervoor dat u door middel van de diepte van de hersenen gaan in de dooier (Figuur 1A).
- Injecteer 1-2 nl van fluorescerende kleurstof in de ventrikels te zorgen dat de kleurstof vult de gehele lengte van de hersenen ventrikels.
- Transfer embryo's naar de tweede agarose gecoate schaal gevuld met embryo media en opnieuw verdoven, zoals beschreven in 2.4.
- Direct aan de slag beeldvorming, zoals beschreven in hoofdstuk 4, om een tijdstip nul beeld te krijgen.
4. Imaging
- Orient embryo's met hun staart in het gat, zoals beschreven in 3.1.
- Gebruik een dissectiemicroscoop met zowel verzonden en tl-licht om een helderveld dorsale opname te maken. Houd de vergroting constant tussen beeldvorming van verschillende embryo's. Dit zorgt voor een directe vergelijking van analyses uitgevoerd met behulp Afbeelding J (5,2-6).
- Zonder te bewegen het embryo, microscoop of schotel, neem eenbijbehorende fluorescerende beeld.
- Herhaal dit voor elk embryo op de gewenste tijdstippen.
5. Kwantificering van Dye Beweging
- Samenvoegen helderveld en fluorescerende beelden in Photoshop zoals eerder beschreven door Gutzman en Sive 10.
- Meet de afstand van de kleurstof voorkant beweegt in Afbeelding J software beschikbaar is op http://rsbweb.nih.gov/ij/ .
- Open samengevoegde bestand in Afbeelding J en gebruiken line tool om een lijn van de voorhersenen scharnier-punt naar voor verven op een 10-20 ° hoek van neuro-epitheel (Figuur 1A) te tekenen. Deze regio werd gekozen omdat het is de eerste en meest opvallende plaats van kleurstof uitlekken van het wild-type neuro-epitheel.
- Selecteer meetinstrument op lengte van de lijn te berekenen.
- Herhaal dit voor elke keer-punt.
- Bereken netto afstand de kleurstof voorkant tijd verplaatst door aftrekken afstand t = 0 van andere tijdstippen.
- Plot opgrafiek.
6. Representatieve resultaten
Een voorbeeld van de resultaten die in een neuro permeabiliteit assay met wildtype embryo's wordt getoond in Figuur 1B-D. Nauwkeurig onderscheiden permeabiliteit, is het nuttig om kleurstoffen te testen met verschillende moleculaire weightsto een formaat dat nauwelijks lekkende in wild type of controle-embryo's (Figuur 2) te identificeren. Dit maakt de identificatie van genetische mutanten of omgevingsomstandigheden die een groter of kleiner permeabiliteit (Figuur 1D, groene en rode lijnen respectievelijk). Voor de 24 hpf zebravis neuro-epitheel, 70 kDa FITC Dextran lekken langzaam gedurende 2 uur, terwijl 2.000 kDa niet en 10 kDa bijna onmiddellijk lekt. Daarom 70 kDa is het ideale molecuulgewicht aan omstandigheden die zowel verhogen als verlagen neuro permeabiliteit identificeren.
Als de naald mist de ventriculaire lumen, fluorescentie wziek lijken buiten de hersenen op t = 0 (voor een voorbeeld zie Gutzman en Sive, 2009 10). Deze embryo's worden verwijderd, omdat de kleurstof geïnjecteerd was aanvankelijk niet aanwezig in de hersenen en geen duidelijke conclusie over beweging van de kleurstof en permeabiliteit van de neuropeithelium kan worden.
Ten slotte, als embryo's kleine ventrikels of niet-opgeblazen hersenventrikels, pre-injectie van ventrikels met een zoutoplossing kan voorafgaand aan injectie van de fluorescente kleurstof worden gedaan. Deze blaast de kamers waardoor latere weergave van de ventrikels makkelijker bij het injecteren met de fluorescente kleurstof. Juiste controles moeten worden uitgevoerd om te bepalen of de injectie van zoutoplossing normale neurale buis ontwikkeling verstoort.
Figuur 1. Tijdsverloop van verschillende moleculair gewicht kleurstoffen. (A) Experimental Diagram. EersteWordt fluorescerende kleurstof geïnjecteerd in de ventrikels. X = positie van de naald voor injectie. Volgende dorsale beelden worden opgenomen in de tijd. Tenslotte de afstand verplaatst door de kleurstof voorkant van de voorhersenen scharnier wordt gemeten (weergegeven door een rode lijn). (BC) samengevoegd helderveld en fluorescent dorsale beelden op 22 hpf (t = 0 min, B) en 24 HPF (t = 120 min, C). Witte lijn geeft de afstand aan van de kleurstof voorkant van voorhersenen ventrikel. (D) Hypothetisch voorbeeld permeabiliteit gegevens. Blauw = wild-type of controles, rood = monster met een verminderde permeabiliteit tov de controlegroep, en groen = monster met een verhoogde permeabiliteit tov de controlegroep.
Figuur 2. Meting van neuroepitheliale permeabiliteit voor verschillende molecuulgewicht kleurstoffen. (AE) Dorsale gefuseerde helderveld en fluorescerende beelden van 22 hpf wildtype embryo's op t = 0 min na injectie met FITC-dExtran de volgende molecuulgewichten: 10 kDa (A), 40 kDa (B), 70 kDa (C), 500 kDa (D) en 2000 kDa (E). (A'-E) Hetzelfde als in embryo (AE) bij t = 120 min bij 24 hpf. Anterior naar links. F = voorhersenen, M = middenhersenen, H = achterhersenen. Asterisk = oor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We tonen dat zij permeabiliteit van de levende embryonale zebravis hersenen kwantificeren bepaald voor een kleurstof geïnjecteerd van een bepaald molecuulgewicht. Onze observatie dat de embryonale zebravis neuroepitheel is differentieel doorlaatbaar voor kleurstoffen van verschillende moleculaire gewichten suggereert dat de kleurstof beweegt via paracellulaire permeabiliteit. We kunnen echter niet uitsluiten dat de mogelijkheid van een transcellulaire bijdrage aan de waargenomen permeabiliteit. Deze techniek kan worden toegepast op andere buisvormige constructie zolang de binnen-en buitenzijde van de buis te zien en de lumen worden geïnjecteerd. Echter identificatie van het ideale molecuulgewicht van andere organen moeten worden bepaald als dit kan verschillen tussen weefsels en ontwikkelingsstadia.
Deze test zal verder onderzoek naar de rol van epitheliale permeabiliteit tijdens lumen inflatie en de regulering van het lumen grootte. Daarnaast zal hij deze technieklp karakteriseren veranderingen in epitheliale permeabiliteit geassocieerd met aandoeningen zoals waterhoofd en polycystische nierziekte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Nationaal Instituut voor Geestelijke Gezondheid en National Science Foundation. Speciale dank aan Sive lab leden voor vele nuttige discussies en opbouwende kritiek, en Olivier Paugois voor deskundige vis veeteelt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran, Fluorescein, Anionic, Lysine Fixable | Invitrogen | D7136, D7137, D1822, D1820, D1845 | |
| Tricaine powder | Sigma | A5040 | |
| Capillary Tubes | FHC Inc. | 30-30-1 |
References
- Harrington, M. J., Hong, E., Brewster, R. Comparative analysis of neurulation: first impressions do not count. Mol. Reprod. Dev. 76, 954-965 (2009).
- Lowery, L. A., Sive, H. Strategies of vertebrate neurulation and a re-evaluation of teleost neural tube formation. Mech. Dev. 121, 1189-1197 (2004).
- Salehi, Z., Mashayekhi, F. The role of cerebrospinal fluid on neural cell survival in the developing chick cerebral cortex: an in vivo study. Eur. J. Neurol. 13, 760-764 (2006).
- Martin, C. Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid. Int. J. Dev. Neurosci. 27, 733-740 (2009).
- Lehtinen, M. K. The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells. Neuron. 69, 893-905 (2011).
- Gato, A. Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos. Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 284, 475-484 (2005).
- Lowery, L. A., Sive, H. Totally tubular: the mystery behind function and origin of the brain ventricular system. Bioessays. 31, 446-458 (2009).
- Lowery, L. A., Sive, H. Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products. Development. 132, 2057-2067 (2005).
- Zhang, J. Establishment of a neuroepithelial barrier by Claudin5a is essential for zebrafish brain ventricular lumen expansion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1425-1430 (2010).
- Gutzman, J. H., Sive, H.
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Westerfield, M., Sprague, J., Doerry, E., Douglas, S., Grp, Z. The Zebrafish Information Network (ZFIN): a resource for genetic, genomic and developmental research. Nucleic Acids Research. 29, 87-90 (2001).
