Summary
רקמת שריר מהונדסת יש פוטנציאל גדול ברפואת רגנרטיבית, כמודל מחלה וגם כמקור חלופי לבשר. כאן אנו מתארים ההנדסיים של מבנה שרירים, במקרה זה מתאי עכבר והיצמדות לאב, והגירוי על ידי פולסים חשמליים.
Abstract
רקמות שריר מהונדס יכולות לשמש למספר מטרות שונות, הכוללת את הייצור של רקמות לשימוש כמודל מחלה במבחנה, למשל ללמוד כיבי לחץ, ולרפואת רגנרטיבית כחלופת בשר 1. מבני השרירים הראשונים שדווחו 3D נעשו לפני שנים רבות וחלוץ בתחום הם Vandenburgh ועמיתי 2,3. שיפורים שנעשה בהנדסת רקמת שריר הם לא רק תוצאה מהעלייה העצומה בידע של גורמים ביוכימיים, תאי גזע ותאי אב, אבל הם במבוססים בעיקר על תובנה שנרכשו על ידי חוקרים כי גורמים פיסיים משחקים תפקיד חיוני בשליטה על התנהגות תא ו רקמת פיתוח. שריר מהונדס מדינה-of-the-art בונה כיום מורכב ממבנים הידרוג תא מאוכלסים. במעבדה שלנו אלה בדרך כלל מורכבים מתאי Murine היצמדות progenitor, מבודדים מרירי גפיים אחוריים Murine או קו תא היצמדות עכברי C2C12, mixed בתערובת של קולגן / Matrigel ומצופה בין שתי נקודתי עיגון, מחק את רצועות השריר. תאים אחרים עשויים להיחשב גם כן, שורות תאים חלופיות כגון כגון L6 myoblasts חולדה 4, תאי שריר הילוד נגזרים progenitor 5, תאים שמקורם ברקמות שריר בוגרים ממינים אחרים, כגון אדם או 6 תאי גזע pluripotent מושרים אפילו (תאי iPS) 7 . contractility הסלולרי גורם ליישור של התאים לאורך הציר הארוך של מבנה 8,9 וההתמיינות של תאי אב השריר לאחר כשבוע של התרבות. יתר על כן, היישום של גירוי חשמלי יכול לשפר את התהליך של התמיינות במידה מסוימת 8. בגלל גודלו המוגבל (8 X 2 X 0.5 מ"מ) רקמה המלאה ניתן לנתח באמצעות מיקרוסקופיה confocal לפקח כדאיות למשל, בידול ויישור תא. בהתאם ליישום הספציפי בדרישות לעבודות ההנדסהרקמת שריר אדומה תשתנה; שימוש דוגמה לרפואת רגנרטיבית דורש גמלון גודל רקמות וכלי הדם, ואילו לשמש כחלופת תרגום בשר למינים אחרים הוא הכרחי.
Protocol
1. תרבות של תאי Murine היצמדות מוליד או C2C12 תאים
- בודד תאים בהתאם לפרוטוקול שפורסם תחילה על ידי שפר ועמיתיו 10, ומאוחר יותר בעיבוד של קולינס ואח'. בונן 11 ואח' 12. ולאחסן אותם בחנקן נוזלי. זה דורש עכברים, למשל C57Bl / 6. שיטות חלופיות המשמשות במעבדות אחרות, למשל שיטה שפורסמה בכתב העת של ניסויים דמיינו ידי Li Y et al. 13. לחומרים כימיים והציוד אתה התייחסת לטבלה בעמוד 7 ו 8. משרירים מעכבר אחד אתה בדרך כלל תקבל מספיק תאים כדי cryopreserve כ 20 בקבוקונים בחנקן נוזלי. בשלב הבא, אנחנו מתחילים את הפרוטוקול להפשיר את התאים מאחסון החנקן הנוזלי.
- הנח את התאים מבקבוקון 1 ל25 סנטימטרים 2 Matrigel (1 מ"ג / מ"ל) בקבוק תרבית רקמה מצופה ולהוסיף מדיום גידול (GM) בהיקף של (335 מ"ל DMEM מתקדם, בובין העוברי 100 מ"לדואר סרום (FBS), 50 המ"ל HS, 5 המ"ל פניצילין / סטרפטומיצין, 5 מיליליטר L-glutamin, 5 מיליליטר תמצית עוף עובר (CEE)).
הערה: מעייל ל2 שעות בטמפרטורת חדר ולהסיר Matrigel ידי שאיפה.
- תת תרבות התאים כ 01:03 כל 3 ימים.
פירושו של הדבר: ביום 3: תאי מעבר מאחד 25 סנטימטרים 2 עד 2 סנטימטר בקבוק 75, ביום 6: תאי מעבר מ 2 בקבוק אחד 75 סנטימטרים לשתי צלוחיות 150 סנטימטר (2 עם 30 דקות preplating בצלוחיות ללא ציפוי). ביום 2 בקבוק 150 9 העברה 1 סנטימטר עד 2 בקבוק 1 משולש 150 סנטימטר, או אם אינו זמין לשלושה 150 סנטימטר 2 צלוחיות (במידת צורך preplate שוב תלוי בפנוטיפ של תאים). ביום 12 בתאים מוכנים לזריעה למבנה שרירים.
הערות: - לכל 150 סנטימטרים משולשים 2 מספר התאים יהיה כ 4.5 x 10 6 תאים.
- השתמש באמצעותls מבידודים שונים לערבב אותם כדי להשיג אוכלוסייה מעורבת של תאים בשלב של זריעה.
הערה: אם תבחר שלא לעבוד עם תאים ראשוניים, C2C12 myoblasts הוא אלטרנטיבה טובה.
2. הנדסת רקמות שריר שלד
- הכן דבק סיליקון על ידי הערבוב "אלסטומר" עם "סוכן הריפוי" (10:01). חותך + / - מגזרים מרובעים 5 מ"מ של סקוטש בצד משולש אחד (בית דמוי צורה; איור 1). דבק סקוטש לתוך הבארות של צלחת תרבות 6-היטב בשטח של כ 12 מ"מ בין הריבועים.
הערות: - השתמש רק בצד הרך של סקוטש ולפנות מעלה הצד הזה.
- ודא כי גגות פנים זה לזה.
- רק לכסות סקוטש עם סיליקון דבק, אינו מתפשט ברחבי דבק היטב.
- לגירוי חשמלי מאוחר יותר היא רלוונטית כדי ליישר את המבנים בכיוון האנכי של pl הטובאכלתי (לאורך ציר זמן).
- להשאיר לייבוש למשך הלילה בתנור ואקום, לא מחומם, בעיקר כדי להסיר בועות אוויר. לעקר ידי הוספת EtOH 70% לבארות והדגירה במשך 15 דקות. לשטוף 3x עם PBS ולשים תחת UV במשך 15 דקות. הסר את כל PBS מהבארות וסקוטש והמקום בחממה עד לשימוש.
- הפשר פתרון Matrigel במקרר ולהכין את פתרון קולגן לריכוז הרצוי זמן קצר לפני ביצוע מבני 3D. דלל את הקולגן המניות עם חומצה אצטית 0.02% סטרילי (ריכוז סופי 3.2 מ"ג / מ"ל).
הערה: להשאיר הכל על קרח.
- Trypsinize התאים, resuspend ב GM וספירה. לצאת מתאים בצינור צנטריפוגה בחממה.
- הוסף את הכמות הרצויה של פתרון מניות קולגן למספרים של מבנים שברצונך להפוך לצינור (לפי טבלה 1), להוסיף NaOH 0.5m לפתרון קולגן זה עד אור ורוד קולוR הוא מצביע על רמת חומציות של 7.5. מערבב בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה ולמנוע היווצרות בועה. ואז להוסיף Matrigel ומערבב בעדינות אך ביסודיות. לבסוף, מוסיף לתערובת GM קולגן / Matrigel (לכמויות המתאימות ראה טבלה 1).
הערות: - לבצע כל צעד על קרח! Matrigel וקולגן יהיו בקלות ג'ל בטמפרטורה הולכת וגוברת.
- לשים לב שהצבע אכן הוא ורוד! עלייה בחומציות גם לגרום gelation המהיר.
- ריכוז סופי של קולגן: 1.6 מ"ג / מ"ל.
- צנטריפוגה הסכום הרצוי של תאים ב1000 סל"ד למשך 5 דקות ולהסיר את supernatant.
הערה: - בהתאם לפעילות של התאים במספר תאים לכל בנייה צריך להיות מותאם. בדרך כלל, מספר התאים נמצא בין 750.000 ו1250000 תאים לכל מבנה.
- להשתמש בחלק מתערובת ג'ל לresuspend התא הגלולולהעביר את התאים לתוך התערובת שנותרה ומערבב היטב, אך ללא החדרת בועות אוויר.
- קח את גם צלחות חוממו מראש מתוך החממה ופיפטה 0.35 -0.4 מ"ל של תערובת התא ג'ל לסקוטש הראשון. ואז, מתחיל פיפטה את התערובת מהמרכז בין האתרים המצורפים ולהאריך לסקוטש. לבסוף, שימוש יתר ג'ל כדי למלא את הפער בין שני עוגנים ופיפטה סקוטש סביב פיסות סקוטש.
- בדוק היטב לאחר דקות 5-10 אם הג'לי הוא מוצק מספיק כדי להיות מועבר, כלומר בעדינות לנצל את הכלים ולבדוק חזותיים אם ג'ל הוא נוקשה. אם כן, הנח את הכלים בזהירות באינקובטור. בדרך כלל, הם יכולים להיות הרים אחרי עשר דקות. ואז, אחרי שעתי 1-2, עדינות כיסוי כל ג'ל עם 4 מ"ל של GM החם.
הערה:-אל תעשו תנועות נמרצות בעת טיפול בצלחות.
- החלף GM ידי בידול בינוני (מדיום גידולללא תמצית עוברים אפרוח) לאחר 24 שעות, ולהחליף במדיום טרי כל 2-3 ימים. ביום 7 היית צריך להשיג סיבי שריר בכיוון בשל, כפי שניתן להעריך עם ההכתמה לפיתוח תלמי צלב בסיבי השריר התמזגו.
3. גירוי חשמלי
- לעקר את האלקטרודות מצלחת ionoptix (ראה טבלה של חומרים כימיים וציוד) לפני השימוש באתנול 70% ולאחר מכן יבש תחת UV בקבינט בטיחות. הנח את הצלחת עם אלקטרודות לצלחת התרבות עם המבנים ומכסים עם מכסה מצלחת התרבות וההעברה לחממה. חבר Ionoptix C-הקוצב עם הכבלים המתאימים.
הערה: אלקטרודות מונחות במקביל לצד מבנה השריר (איור 2).
- החל פרוטוקול הגירוי כצפוי.
הערה: אנו משתמשים בדרך כלל 4 V / סנטימטר,פולסים 6ms בתדירות של 2Hz. שינוי התרבות בינונית בכל שעות 24 בזמן הגירוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המוצר הסופי יהיה בונת שריר, שהוזכרה באיור 3. גודל הרקמה יהיה כ 8 מ"מ ארוך, 2 מ"מימ רוחב ו 0.5 מ"מ עובי. גירוי חשמלי במהלך הבידול יהיה לשנות את הביטוי של שרשרת הכבדה isoforms השרירן, אך אינו משפר את תהליך הבידול מאוד כמו הנגרם על ידי מדיום ההתמיינות 8, אבל גירוי חשמלי יכול להיות מיושם גם בסופו של התהליך לבדיקה פונקציונלית של השריר , כי שריר עם sarcomeres מפותח יהיה מסוגל להתכווץ על דופק חשמלי.
התמיינות והתבגרות גם ניתן לנתח באמצעות PCR להערכה כמותית ביטוי גנים וצביעה לסמני שרירי הבשלה או התפתחות תלמי צלב (מכתים למשל עבור אלפא actinin) משני חלקים העשויים מהרקמות או דגימות רקמה צבעוניות שלמות הר. הבשלת שרירים ויחסי בידולגני טד וביטוי שרשרת כבד שרירן כוללים MyoD למשל, myogenin, MFR4 וMLP, וMYH 1, 2, 4 ו 8 8. הוכחה לכך שרקמת השריר שנוצרה אכן היא רקמת שריר, המבוססת על ביטוי גנים, stainings immunohistochemical ואינדוקצית התכווצות על ידי גירוי חשמלי, כבר פורסם בעבר 8 ודמות עם חתכים מוכתמים של רקמות שריר עשויות מתאי אב והיצמדות תאי C2C12 ממאמר זה מוצג באיור 4.
| פתרון | נפח (אם עושה 10 שרירים) בμl |
| קולגן (3.2 מ"ג / מ"ל, מדולל בחומצה אצטית 0.02%) | 2570 (51.3%) |
| NaOH (0.5m) | 10 (0.2%) |
| Matrigel | 430 (8.6%) |
| מדיום גידול | 2000 (39.9%) |
| סך הכל | 5010 (צריך להספיק עם מספיק לשפיכה וpipetting פסד) |
טבלת 1. תערובת של תאים וג'ל לדור של שריר מהונדס רקמה לבנות.
איור 1. חותך את החתיכות של סקוטש.
איור 2. תמונה נלקחה מהחלק התחתון של שריר לבנות בטוב של צלחת 6-גם מראה את המיקום של האלקטרודות. האלקטרודות (מסומן בחצים הלבנים) ממוקמות במקביל למבני השרירים.
איור 3. רקמהמהונדס בשריר בין שתי חתיכות של סקוטש בצלחת תרבות 6-כן.
איור 4. דוגמאות אופייניות לפסים צולבים בC2C12 () וMPC (ב ') ברקמות שריר שלד מהונדסות. חלקים קפואים של mBAMs הלא מגורה-(יום 8 לבידול) הוכתמו לsarcomeric α-actinin (אדום), sarcomeric מיוזין (ירוק ) וגרעינים (כחול). (AA-AB ו-Ba Bb) הגדלה של אזורים בקופסה (A, B) α-Actinin (אדום) וsarcomeric מיוזין (ירוק). הודפס מחדש באישור מ 8. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הנדסת רקמות שריר יש פוטנציאל גדול לשימוש כמודל מחלה, לסריקת תרופות וברפואת רגנרטיבית לייצור בשר. עם זאת, הדרישות ליישומים אלה משתנות. אנחנו בחרנו לעבוד עם שילוב של קולגן וmatrigel, כי קולגן מאפשר יישור תאים וכי תאי אב ההיצמדות דורשים נוכחות של חלבונים שמקורם בממברנה מרתף כפי שנקבע במחקרים הקודמים 2D 12. יתר על כן, ג'לי הפיברין נבדק במעבדה שלנו ונראה שלא לתמוך בבתאים C2C12 והיצמדות כפי שעושה התערובת של קולגן וMatrigel ™ ובמיוחד לא תוביל להידוק רקמות 14. המודל שתואר כאן כבר נעשה שימוש במחקרים על ניזק כיב לחץ תוך שימוש בשורת תא 15. ליישומי רפואה רגנרטיבית, התרגום לתאי לווין אדם נוצר בשבועות אחרון 6,16. בנוסף,כמקור חלופי לצריכת בשר הטכניקה יש 1 פוטנציאל גדול. לדעתנו לעומת זאת, טכנולוגיה הנוכחית צריכה כדי להתקדם לשלב הבא כדי לקדם את השימוש בו במרפאת, כמו גם לצריכה. לדוגמה, הבידול עוצר במסביב לבמת היילודים וגם ייצור כוח הוא הרבה פחות משרירים מייצרים בגוף חי. בנוסף, למרות שיכולים להיות מיושמים בתאי גזע עכבר, חולדה ואדם במבני 3D, הבידוד ובעיקר הבידול וההבשלה של חיות משק נגזרות תאי גזע שריר אינו מפותח כל כך רחוק עדיין 1. כמו כן, השימוש בבעלי חיים לצורכים Matrigel וסרום נגזרו להיות מושמט 1. כדי לקדם את היישום ברפואת רגנרטיבית, גודל הרקמה צריך להיות מוגבר, ודורש כלי דם (ניאו) ושימוש במערכות bioreactor זלוף להתגבר על מגבלות דיפוזיה החמצן וחומרים מזינות. כמה מחקרים ראשוניים על כלי דם מבני שעות קטנותהשד נעשה בשנים האחרונות 9,17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לי מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לYabin וו עבור culturing הרקמות המוצגות באיור 2, התמונה צולמה על ידי ברט ואן Overbeeke. העבודה נתמכת כלכלית על ידי SenterNovem, המענק 42022 ISO.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel-growth factor reduced | Beckton and Dickinson | ||
| DMEM (high glucose)* | Gibco | 42430 | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491 | |
| Horse serum | Gibco | 65050-122 | |
| Fetal bovine serum | Greiner | 758075 | |
| 0.45 and 0.22 μm syringe filter* | Whatmann (Schleicher and Scheull) | 10462100 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | |
| Culture plastic | Greiner | Includes culture flasks and pipets | |
| Chick embryo extract | United States Biological | C3999 | |
| Pasteur pipet* | Hilgenberg | Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 0,9 - 1,1 mm | |
| Pasteur pipet* | Hilgenberg | Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 1,4 - 1,6 mm | |
| Pasteur pipet | VWR | 612-1702 | |
| Collagenase type I* | Sigma | C0130-16 | |
| 40 μm cell strainer* | BD Falcon | 352340 | |
| 19G needle | |||
| Elastomer | Dow Corning corporation | 3097358-1004 | Silastic MDX 4-4210# |
| Curing agent | Dow Corning corporation | Silastic MDX 4-4210# | |
| Velcro | Regular store | You can buy this at a regular store, only use the soft side | |
| Collagen type I, rat tail | BD Biosciences | 3544236 | |
| C-Pace EP Culture Pacer | Ionoptix | ||
| 6-well culture dishes for electrical stimulation | Beckton Dickinson-Falcon | BD Falcon #353846 | |
| C-Dish culture dish electrodes | Ionoptix | ||
| * Needed for the isolation of cells (point 1.1) # Together in one kit |
|||
References
- Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Polak, R. B., et al. Meet the new meat: tissue engineered skeletal muscle. Trends Food Sci. Tech. 21 (2), 59-66 (2010).
- Shansky, J., Chromiak, J., Tatto, M., Vandenburgh, H. A simplified method for tissue engineering skeletal muscle organoids in vitro. In Vitro Cell Dev. Biol. Animal. 33 (9), 659-661 (1997).
- Vandenburgh, H., Del Tatto, M., Shansky, J., et al. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Hum. Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).
- Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 61 (2), 477-483 (1968).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. J. Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Koning, M., Werker, P. M. N., vander Schaft, D. W. J., Bank, R. A., Harmsen, M. C. MicroRNA-1 and MicroRNA-206 Improve Differentiation Potential of Human Satellite Cells: A Novel Approach for Tissue Engineering of Skeletal Muscle. Tissue Eng. Part A. , (2011).
- Darabi, R., Pan, W., Bosnakovski, D., et al. Functional myogenic engraftment from mouse iPS cells. Stem Cell Rev. 7 (4), 948-957 (2011).
- Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., et al. Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells. J. Tissue Eng. Regen. Med. 5 (7), 529-539 (2011).
- van der Schaft, D., van Spreeuwel, A. C., van Assen, H. C., Baaijens, F. Mechanoregulation of vascularization in aligned tissue engineered muscle; a role for VEGF. Tissue Eng. Part A. , (2011).
- Shefer, G., Wleklinski-Lee, M., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells can spontaneously enter an alternative mesenchymal pathway. J. Cell. Sci. 117 (Pt. 22), 5393-5404 (2004).
- Collins, C. A., Olsen, I., Zammit, P. S., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
- Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., Baaijens, F. P. T., van der Schaft, D. W. J., Post, M. J. Essential environmental cues from the satellite cell niche: optimizing proliferation and differentiation. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296 (6), C1338-C1345 (2009).
- Li, Y., Pan, H., Huard, J. Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues. J. Vis. Exp. (41), e2011 (2010).
- Boonen, K. J. M., Langelaan, M. L. P., Polak, R. B., et al. Effects of a combined mechanical stimulation protocol: Value for skeletal muscle tissue engineering. J. Biomech. 43 (8), 1514-1521 (2010).
- Gawlitta, D., Boonen, K. J. M., Oomens, C. W. J., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. The influence of serum-free culture conditions on skeletal muscle differentiation in a tissue-engineered model. Tissue Eng. Part A. 14 (1), 161-171 (2008).
- Koning, M., van Luijn, M., van der Schaft, D. W. J., et al. Human skeletal muscle formation and engraftment In vivo is independent of preconditioning In vitro with HUVEC. , In revision (2013).
- Levenberg, S., Rouwkema, J., Macdonald, M., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nat. Biotechnol. 23 (7), 879-884 (2005).
- Koffler, J., Kaufman-Francis, K., Yulia, S., et al. Improved vascular organization enhances functional integration of engineered skeletal muscle grafts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (36), 14789-14794 (2011).
