Summary
この資料では、1つは、模倣することができるようにする方法について説明します。
Abstract
我々は全体のショウジョウバエの脳のex vivoで培養する方法を説明します。これは急性の薬理学的介入と細胞プロセスのライブイメージングを可能にすることにより、細胞生物学と中央脳構造の開発を調査するための慢性的な遺伝子操作に対位法として使用することができます。技術の一例として、我々の研究室1から前の仕事は、以前に認識されていない細胞内コンパートメントは、 ショウジョウバエ中枢脳の軸索の軸索と細胞体のコンパートメントの間にあることが示されている。軸索起始部（AIS）2と呼ばれるこの区画の開発は、ニューロン特異的サイクリン依存性キナーゼ、Cdk5を依存するように遺伝的に示された。私たちは、Cdk5を特異的薬理学的阻害剤ロスコビチンとオロモウシン3野生型のショウジョウバエの幼虫の脳のex vivoでの治療はアクチン組織の急性変化を引き起こすこと、およびここに示す遺伝的にCdk5を活性を欠く変異体では見られた変化を模倣する細胞表面タンパク質Fasciclin 2の局在インチ
ex vivoでの培養技術の第二の例は、幼生から成体への変態期胚のキノコ体（MB）γニューロンの接続の改造のために提供されています。キノコ体は嗅覚学習とフライ4のメモリの中心であり、これらのγニューロンは成体の神経支配パターン5を確立するために後でタイムポイントでの再拡張に分岐して蛹開発中に、その軸索と樹状突起の枝を剪定します。 MBのこれらのニューロンのプルーニングは、エクジソン受容体B1 7で演技、エクジソン、ステロイドホルモンによって引き起こされるメカニズムによって、神経突起の分岐6のローカル変性を介して起こることが示され、それがの活性に依存しているされていますユビキチン-プロテアソームシステム6。 ex vivoでの培養の我々の方法は、bができますeはさらに発達リモデリングのメカニズムを調べるために使用されます。我々は、ex vivoで培養設定では、MBのγニューロンは in vivoと同様の時間経過とともに発達剪定の過程をrecapitulatedことがわかった。それは変態と不可逆的にコミットするために細胞ために組織をexplanting前蛹殻形成後1.5時間まで待つことが、不可欠であった。pupariation開始時の動物の解剖は、培養中のほとんど、あるいはまったく変態につながった。したがって、適切な修正を加えて、ex vivoで培養アプローチは中心的な脳の生物学の定常状態の側面だけでなく、動的な学習に適用することができます。
Protocol
メディアのA.の準備
- フィルター滅菌シュナイダーのショウジョウバエのメディアは、10％ウシ胎児血清および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補ったことで、完全なメディアを準備します。
- メディアは毎回新鮮な準備する必要があります。また、事前に凍結メディアの新鮮なアリコートを各使用前に解凍することができます。
- 培養に先立って、メディアに10μg/ mlのインスリンおよび2μg/ mlのエクジソンを追加します。薬が濃縮された株式のように調製し、小アリコートで凍結した。融解したアリコートを再凍結はありませんでした。
- すべての作業のソリューションは、25℃で維持されるべきである
幼虫の脳の培養
1。幼虫の脳の選択と解剖
- 12ミリメートルMillicellセルカルチャーインサートにメディアの500μlを添加します。解剖脳は簡単に免疫染色を容易にするために、これらのインサートに配置されます。
- 解剖の時計ガラスに準備されたメディアの少量を追加します。
- U、小さなへらを歌う放浪3齢幼虫をピックアップし、時計皿に置きます。 （我々は、ex vivoでの培養方法は、第一または第二齢幼虫にも同様に適用されるだろうが、我々はこれをテストしていないことを想定しています。）
- 鉗子のペアと幼虫の後端持って慎重＃5鉗子の第二のペアで前端を開きます。
- すぐに腹神経索を保持したまま、脳を解剖する。
ディテールに秘められた幼虫の脳の2 のEx vivoでの培養
- プリウェットピペットチップを使用して、メディアが事前に満たされ、細胞培養インサートに慎重に脳を転送します。
- 25℃インキュベーターへのメディアの転送の脳は、°希望の時間点までのCに達しています。このメソッドは、文化の中で最大48時間のために効率的に動作します。
- 8時間でメディアを交換してください。その向こうには、メディア毎に5-6時間の半分を交換してください。
3。の薬理学的操作幼虫ブレインズ
ex vivoでの培養は、このメソッドは、薬理学的に以前に私たちの研究室1に示す遺伝子の相互作用を裏付けるために使用できます。
- 準備されたメディアに、100μMのロスコビチンと100μMのオロモウシンを追加します。
- このメディアに解剖し、脳を転送します。
- 25文化の脳℃で24時間。
- 8時間でメディアを交換してください。それを超えて、メディアの半分（薬物を含む）ごとに5-6時間を交換してください。
蛹の脳の培養
1。解離に対する蛹の選択
- ボトル/バイアル白い蛹をマークします。
- 唯一の完全に白です蛹を選択します。発色の任意の並べ替えと蛹が含まれるべきではありません。
- この段階では、0時間蛹殻の形成（APF）の後です。
- これらの蛹は、1.5時間マーキングした後に解剖の準備ができます。このステップでは、その発達のプルーニングがエクスビボで発生したことを確認することが重要です
2。蛹の解剖
- 12ミリメートルMillicellセルカルチャーインサートにメディアの500μlを添加します。 （解剖脳は簡単に免疫染色を容易にするために、これらのインサートに配置されます。）
- 希望の時間ポイントに達した後、解剖時計ガラスに準備されたメディアの少量を追加します。
- 小さい、ぬれたへらを使用して、以前に解剖用にマークされた蛹をピックアップし、時計皿に置きます。
- 鉗子のペアと蛹の後端持って慎重＃5鉗子の第二のペアで蛹ケースの前端を開きます。
- すぐに腹神経索がそのまま接続されたまま、脳を解剖する。
ディテールに秘められた蛹の脳の3 のEx vivoでの培養
- メディアが事前に満たされた、細胞培養インサートに慎重に脳を転送します。
- 希望の時間-Pまで25℃インキュベーター℃〜メディアの転送の脳、ointに達しています。我々は示した実験のために文化の中で10時間にこのメソッドを使用しますが、必要に応じてそれは、観察と治療の長い期間に延長することができます。
- 8時間のAPFよりも時間ポイントより長い場合は、メディア毎に5-6時間を交換してください。
このステップから、プロトコルは、幼虫と蛹の両方で変わりません。
ディテールに秘められた脳を修復するB.
- 希望の時間ポイントに達すると、メディアを取り出し、30分間0.5％1X PBS中4％ホルムアルデヒドトリトンX-100（PBST）500μLを加え、15分後に新鮮なホルムアルデヒドと置き換えます。
- 固定でメディアを交換しながら、脳を乾燥させないようにしてください。
- 0.5パーセントトリトンX-100（PBST）での1X PBSを4つの10分間の洗浄でホルムアルデヒドを洗い流してください。
C.固定ブレインズの染色
- ホルムアルデヒドは、通常1％の1X PBSをブロッキング溶液で1時間の頭脳をブロックし、洗い流された後ヤギ血清および1％ウシ血清アルブミン。
- ブロッキング溶液で構成される一次抗体を追加します。
- 4℃一晩インキュベートし、脳℃、
- 翌朝、PBSTの4つの10分間の洗浄を一次抗体を洗い流してください。
- ブロッキング溶液で構成される二次抗体を追加します。
- 室温で4時間のままにします。
- PBSTの4つの10分間の洗浄を二次抗体を洗い流してください。
D.は、顕微鏡用固定および染色した頭脳をマウントする
- 1時間Vectashieldマウンティングメディアの頭脳を平衡化します。
- Vectashieldマウンティングメディアを使用してスライドガラス上に頭脳をマウントします。
- カバースリップをマウントする前に脳の両側にガラスチップを置きます。共焦点顕微鏡ですべてのフォーカルプレーンをスキャンするのに十分な試料が薄い維持しながら、これは、押しつぶされたことから脳を防ぐことができます。脳は、興味のある機能を表示して容易にするために、取り付け時におおよそ配向されていた。必要な場合には、脳画像は、ドキュメント、および測定のための最適なビューを提供するためにImarisソフトウェアを回転させた。
- 透明なマニキュアでスリップをカバーシール。
- ストアでは、光から離れてスライドします。
E.代表的な結果
図1（A）野生型のハエの3齢幼虫の脳のパネルを示し、（B）Cdk5のドミナントネガティブ誘導体（Cdk5DN）（コネル·クロウリーら 、2000）を発現するハエ。 MBのγニューロンの両方急行アクチン-GFP（緑）。前述のように（Trunova ら 、2011）、したがって、 "クリアゾーン"（A、ブラケット）として示すと、アクチン-GFPを蓄積して失敗した野生型γニューロンの近位軸索内の領域があるfasciclin 2蛋白質（赤）までしか、このゾーンの腹側の境界線（白い水平線）への軸索に蓄積されます。 図1（A）の3番目のパネルの点線は、行為を強調し、MBの位置を示す"クリアゾーン"とその腹側の境界インチCdk5DNを発現しているハエでは、アクチンクリアゾーンは存在しません（B）とFasciclin 2（FasII）免疫反応性は、その領域を介して背広がっています。 （MB間の水平FasII陽性軸索プロジェクトの変数番号があることに注意してください。これらは表現型には関係ありません）。スケールバーは20μmを表す。
ex vivoでの培養の手法を用いて、我々は、ロスコビチンとオロモウシン、Cdk5を活動の薬理学的阻害剤の組み合わせで、野生型のハエを処理した。 図2は、制御の3齢幼虫の脳（A）のパネルと、（B薬剤処理を示しています。 ）は、野生型のハエ。ドミナントネガティブCdk5を構造、24時間Cdk5を阻害剤で処理し、脳を発現しているハエと同様に、アクチンクリアゾーンとFasII境界（角括弧）内のシフトの特性の損失を示しています。白い線は、野生型FasII境界の位置を示します。スケールバーは20μmを表す。
ふぃぎゅ再3 mCD8-GFP（緑）、膜標的で標識された0から10時間以内APFからショウジョウバエのキノコ体の代表的なシリーズを示しています。ブラケットは、萼、つまりMBの樹状突起を示す。変態前に、一つは太いバンドルと同様に、緻密な樹アーバー（ブラケット）に起因する蛍光シグナルの "かすみ"で背腹走ることMBの軸索を見ることができます。時解剖パネル示す脳が示された。地域における樹状突起のプルーニングが（軸索の信号が影響を受けないですが）6-8時間でAPF、樹状信号のヘイズが消えたように、括弧で示された注意してください。パネルBの脳は、内部エクジソンスパイク（トルーマンとRiddiford、2002）、示されているように培養されたex vivoでの前に、0時間APFで解剖した。これらは、樹状突起のない発達プルーニングを示していないのではなく樹状信号は10時間APFで保持されます。これを回避するためには、蛹には0時間APFでマークされたが、APFと培養1.5時間後に解剖されています。ペインL Cは0から10時間、APFからこれらのショウジョウバエのキノコ体の代表的なシリーズを示しています。非培養サンプルのように、樹状信号は、8時間APFによって検出不可能である。スケールバーは20μmを表す。
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Discussion
突然変異と導入遺伝子の発現を含む組織の構造と機能の慢性的な遺伝子操作は、通常、分離するのは非常に困難である即効性と後期間接的な結果の組み合わせを生成します。薬理学と遺伝学的手法を補完する表現型の背後にある時間経過の取り調べを容易にすることができます。たとえば、これはショウジョウバエの 10の精子形成時に異なる細胞骨格成分の寄与を解剖するための強力なアプローチされています。現在の例では、私たちはショウジョウバエのAISの構造を維持するために、Cdk5をするための永続的な要件があることを示すことができました。他の実験では、我々はまた、そのターゲットのタンパク質キナーゼ（イマチニブ）、アクチン重合（カラシン、latrunculinとjasplakinolide）と微小管（ビンブラスチンおよびタキソール）を含む他の細胞成分を、薬物を使用して成功を収めている。
"> ex vivoでの培養方法はまた、発達過程のダイナミクスの高分解能分析を可能にします。これまでの研究のような、中央の脳11、または神経系の他の部分の長期的なイメージングの短期ライブイメージングを記載している胸部神経12と網膜/視神経ローブの接続13。ここでは、固定材料の免疫染色により組織の分析に焦点を当てている一方で、我々は記述方法が中心的な脳の長期的なライブイメージングに適用する必要があります。たとえば、適切な剪定軸索と樹状突起のショウジョウバエのキノコ体の開発中に中枢神経系で正しい接続と神経支配のパターンを確立するために不可欠です。さらに、神経組織リモデリングの異常はアルツハイマー病、ALSやパーキンソンなど、いくつかの神経変性疾患は、根底にあると考えられている。ここで説明する手法は、私たちにエミュレートすることができます培養中のショウジョウバエキノコ体を ex vivoでの神経突起の生体改造、。我々は今遺伝的変化に対応して開発中のイメージの変化、環境の薬理学的治療または変更することができます。
図1は、。Cdk5DNの過剰発現は、アクチン"クリアゾーン"の損失とショウジョウバエのキノコ体のγ-ニューロンのFasII枠のシフトを引き起こす。パネルBは過剰発現Cdk5DN脳の2つの例を示しながら、パネルには、アクチン-GFP（緑）とFasII（赤）を染色し、野生型の脳の3つの例を示します。アクチン "クリアゾーン"（ブラケット）の損失に注意してくださいと（B）にFasII腹側の境界線（水平に白い線）にシフトします。 （A）の点線は、キノコ体の位置を示します。スケールバーは20μmを表す。
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図2。薬理学的Cdk5を阻害ロスコビチンとオロモウシンによる治療は、 ショウジョウバエのキノコ体の過剰発現の表現型Cdk5DNを模倣しています。パネルBは、24時間培養した2つの薬剤で処理した脳を示しながら、パネルは、2つの制御、野生型の脳を示しています。アクチン "クリアゾーン"（ブラケット）の損失と、（B）でFasII国境のシフト（水平に白い線）に注意してください。スケールバーは20μmを表す。
図3 ショウジョウバエのキノコ体の樹状突起の樹状突起の in vivoでのモデリングでは、ex vivoで recapitulatedすることができます。パネル示され、膜結合型GFP（緑）について染色の時点で解剖し、脳を示しています。 8時間APFによる樹状信号の消失を（ブラケットによって強調拡散、緑信号）に注意してください。パネルBは、APFおよび培養ex vivoで 0時間に解剖し、脳を示しています。 ex vivoで続いて、1.5時間のAPFで解剖し、脳を示しています。これらの脳は、 生体内 （） に見られるものと類似した樹状突起のプルーニングを示しています。スケールバーは20μmを表す。
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Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
私たちは、原稿上でのアドバイス、有用な議論やコメントのために我々の研究室のメンバー全員に感謝したい。我々はまた、特に我々が改造実験で培養するための脳を解剖する前に、APF 1.5時間まで待つという優れた提案のためにマルタコッホとBassemハッサンに感謝します。我々はまた、共焦点顕微鏡を使用するためのNHGRIのイメージング機能を感謝します。この作品は、NINDS学内研究プログラムは、NIH（Z01 NS003106）の基本的な神経科学プログラムによってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider's Drosophila Media | Invitrogen | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum (heat-inactivated) | Invitrogen | 10082-147 | 10% |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 1% |
| Insulin | Invitrogen | 12585-014 | 10μg/ml |
| Ecdysone | Sigma-Aldrich | H5142 | 2μg/ml |
| Roscovitine | Sigma-Aldrich | R7772 | 100μM |
| Olomoucine | Sigma-Aldrich | O0886 | 100μM |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 50062Z | 1% |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | M9501 | 1% |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | D4551 | 4% |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151 | 0.5% |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 70011-044 | 1X |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | EMD Millipore | PI8P01250 | |
| Multidish, 4 well | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 176740 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M |
References
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