Summary
מאמר זה מתאר שיטה שבאמצעותה ניתן לחקות
Abstract
אנו מתארים שיטה culturing vivo לשעבר של שלמות המוח תסיסנית. זה יכול לשמש משקל נגד כדי מניפולציות גנטיות כרוניות על חקירת ביולוגיה של התא ופיתוח של מבנים מוחיים מרכזיים בכך שהוא מאפשר התערבויות תרופתיות חריפות הדמיה חיה של תהליכים תאיים. כדוגמה טכניקה, לפני לעבוד במעבדה שלנו 1 הראה כי תא subcellular מוכרים קודם לכן נמצא בין התאים axonal ו somatodendritic של אקסונים במוח תסיסנית המרכזית. הפיתוח של תא זה, המכונה במגזר האקסון הראשון (AIS) 2, הוצגה גנטית תלוי קינאז נוירון ספציפי cyclin תלוי, Cdk5. אנחנו מראים כאן כי טיפול vivo לשעבר של wild-type המוח תסיסנית הזחל עם Cdk5 ספציפי מעכבי תרופתי roscovitine ו olomoucine 3 גורמת לשינויים חריפים בארגון אקטין, ובלוקליזציה של חלבונים על פני קרום התא Fasciclin 2, המחקים את השינויים הנראים מוטנטים חסרי Cdk5 פעילות גנטית.
דוגמה 2 של הטכניקה vivo לשעבר התרבות מסופק שיפוץ של קשרים של הגוף פטריות עובריים (MB) נוירונים גמא במהלך המטמורפוזה של הזחל לבוגר. גוף הפטרייה הוא מרכז למידה חוש הריח וזיכרון זבוב 4, אלה הנוירונים גמא לגזום ענפים axonal ו הדנדריטים שלהם במהלך פיתוח גלמי ואז שוב להאריך סניפים בכל timepoint מאוחר יותר לקבוע את דפוס העצבוב מבוגרים 5. גיזום של נוירונים אלה של MB הוכח להתרחש באמצעות ניוון המקומי של הענפים neurite 6, על ידי מנגנון זה מופעלת על ידי ecdysone, הורמונים סטרואידים, הפועל על הקולטן ecdysone B1 7, וכי היא תלויה בפעילות של ubiquitin-הפרוטאזום המערכת 6. השיטה שלנו של culturing vivo לשעבר יכול בדואר רגיל לחקור עוד יותר את המנגנון של שיפוץ התפתחותית. מצאנו כי הגדרת vivo לשעבר התרבות, הנוירונים גמא של MB סיכמו את תהליך גיזום התפתחותית כמובן עם הזמן בדומה in vivo. זה היה חיוני, עם זאת, לחכות עד 1.5 שעות לאחר היווצרות puparium לפני explanting את הרקמה על מנת התאים להתחייב באופן בלתי הפיך על מטמורפוזה, דיסקציה של בעלי חיים עם תחילת pupariation הוביל מטמורפוזה קטנה או לא בתרבות. לכן, עם שינויים מתאימים, גישה לשעבר התרבות vivo ניתן ליישם ללמוד דינמי כמו גם היבטים למצב יציב של הביולוגיה מוח מרכזי.
Protocol
א 'הכנת מדיה
- הכן התקשורת שלמים על ידי בתוספת פילטר חיטוי תסיסנית שניידר מדיה עם סרום 10% שור עוברית 1% פניצילין / סטרפטומיצין.
- בתקשורת יש להכין טרי בכל פעם. לחלופין, aliquot טרי מראש קפואים התקשורת ניתן להפשיר לפני כל שימוש.
- לפני culturing, להוסיף 10 מיקרוגרם / מ"ל אינסולין ו 2 מיקרוגרם / מ"ל ecdysone לתקשורת. סמים היו מוכנים כמו מניות מרוכזים ו קפוא aliquots קטנים. Aliquots מופשר לא היו refrozen.
- פתרונות לכל העובדים יש לשמור על 25 ° C.
Culturing של המוח הזחל
1. בחירה Dissection המוח הזחל
- הוסף 500 μl של התקשורת כדי להוסיף 12 מ"מ Millicell תרבית תאים. המוח גזור ימוקמו מוסיף אלה כדי להקל על immunostaining קל.
- הוספת כמות קטנה של כלי התקשורת מוכנים זכוכית שעון לנתיחה.
- Uלשיר מרית קטנה, לאסוף את הנדודים 3 זחלים instar ומניחים אותם בזכוכית שעון. (אנו מניחים כי שיטת לשעבר התרבות vivo יחול באותה מידה על הזחלים instar 1 או 2, אבל לא צריך לבדוק את זה.)
- מחזיק את הקצה האחורי של הזחל עם זוג מלקחיים, לפתוח בזהירות את הקצה הקדמי עם צמד של 2 # 5 מלקחיים.
- מהר לנתח את המוח, שמירה על חוט העצב הגחון ללא פגע.
2. אקס culturing vivo של מוח הזחל גזור
- באמצעות מראש רטובים טיפים פיפטה, להעביר את המוח בזהירות לתוך התרבות מוסיף סלולריים, מראש מלאים התקשורת.
- המוח ההעברה, בכלי התקשורת, וכלה בחממה של 25 מעלות צלזיוס עד השעה הרצויה נקודות הוא הגיע. שיטה זו פועלת ביעילות של עד 48 שעות בתרבות.
- להחליף את המדיה בכל 8 שעות. מעבר לכך, להחליף מחצית התקשורת כל 5-6 שעות.
3. מניפולציה תרופתי שלהזחל המוח
שיטה זו של culturing vivo לשעבר יכול לשמש כדי לאשש פרמקולוגית אינטראקציות גנטיות הוכיחו בעבר במעבדה שלנו 1.
- הוסף roscovitine 100 מיקרומטר ו 100 מיקרומטר olomoucine למדיה מוכנים.
- העברת המוחות מנתחים את זה בתקשורת.
- תרבות המוח במהירות של 25 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
- להחליף את המדיה בכל 8 שעות. מעבר לכך, להחליף מחצית התקשורת (עם סמים) כל 5-6 שעות.
Culturing של המוח גלמי
1. מבחר גלמים לנתיחה
- סמן גלמים לבן על בקבוקים / צלוחיות.
- רק לבחור גלמים כי הן לבנות לחלוטין. גלמים עם כל סוג של צבע לא צריך להיות כלול.
- שלב זה הוא 0 שעות לאחר כינונה Puparium (APF).
- גלמים אלה יהיו מוכנים לנתיחה 1.5 שעות לאחר סימון. שלב זה הוא חיוני כדי להבטיח כי גיזום התפתחותית מתרחשת לשעבר vivo
2. דיסקציה של גלמים
- הוסף 500 μl של התקשורת כדי להוסיף 12 מ"מ Millicell תרבית תאים. (את המוח גזור ימוקמו מוסיף אלה כדי להקל על immunostaining קל).
- לאחר הזמן הרצוי נקודות הושג, להוסיף כמות קטנה של כלי התקשורת מוכנים זכוכית שעון לנתיחה.
- בעזרת מרית קטנה, רטוב, לאסוף גלמים סימנה בעבר לנתיחה ומניחים אותם בזכוכית שעון.
- מחזיק את הקצה האחורי של גלמים עם זוג מלקחיים, בזהירות לפתוח את סוף הקדמי של המארז גולם עם זוג נוסף של מלקחיים # 5.
- מהר לנתח את המוח, שמירה על חוט העצב הגחון שלם המצורף.
3. אקס culturing vivo של מוח גלמי גזור
- להעביר את המוח בזהירות לתוך התרבות מוסיף סלולריים, מראש מלאים התקשורת.
- העברת המוח, בכלי התקשורת, וכלה בחממה של 25 ° C עד השעה הרצויה-Point הוא הגיע. השתמשנו בשיטה זו עד 10 שעות בתרבות לצורך הניסוי הראו, אך ניתן להרחיב את תקופות ארוכות יותר של התבוננות וטיפול, במידת הצורך.
- בפעם נקודות יותר APF 8 שעות, במקום כל 5-6 שעות מדיה.
משלב זה ואילך, פרוטוקול נותר ללא שינוי על זחלים וגלמים הן.
ב תיקון המוח גזור
- לאחר הזמן הרצוי נקודות הוא הגיע, להסיר התקשורת ולהוסיף 500 μl של פורמלדהיד 4% 1x PBS עם 0.5% טריטון X-100 (PBST) במשך 30 דקות, להחליף עם פורמלדהיד חדש לאחר 15 דקות.
- ודא שלא לאפשר מוחות להתייבש תוך החלפת התקשורת עם מקבע.
- לשטוף פורמלדהיד עם ארבעה שוטף 10 דקות של 1x PBS עם 0.5% TritonX-100 (PBST).
ג מכתים המוח קבוע
- לאחר פורמלדהיד כבר לשטוף, לחסום את המוח במשך שעה 1 בפתרון חסימת 1x PBS עם 1% רגילעיזים סרום ו - 1% אלבומין בסרום שור.
- הוספת נוגדנים ראשוניים שנעשו בתוך חסימת פתרון.
- המוח דגירה לינה 4 מעלות ג
- למחרת בבוקר, לשטוף נוגדנים ראשוניים עם ארבעה 10 שטיפות זעירות של PBST.
- הוספת נוגדנים משני מורכב לבלום פתרון.
- השאירו בטמפ 'החדר למשך 4 שעות.
- לשטוף נוגדנים משני עם ארבעה 10 שטיפות זעירות של PBST.
ד הרכבה המוח קבוע ומוכתמת מיקרוסקופית
- לאזן המוח בתקשורת Vectashield גובר שעה 1.
- הר המוח על שקופיות הזכוכית באמצעות התקשורת Vectashield הרכבה.
- מניחים שבבי זכוכית בכל צד של המוח לפני הרכבה תלוש כיסוי. זה מונע את מוחם מלהיות מעוכה, תוך שמירה על מדגם דק מספיק כדי לסרוק את כל המטוסים מוקד במיקרוסקופ confocal. המוח היו בכיוון בערך על הרכבה כדי להקל על הצגת תכונות של עניין. במידת הצורךתמונות המוח היו מסתובבים עם תוכנת Imaris לספק תצוגה אופטימלית תיעוד ומדידה.
- סוגרים מכסה מחליק עם הלק ברור.
- חנות מחליק מן האור.
קולי נציג תוצאות
איור 1 מציג פאנל של 3-instar המוח הזחל של (A) wild-type זבובים (ב ') זבובים המבטאים נגזרת דומיננטי שלילי של Cdk5 (Cdk5DN) (Connell, קראולי et al., 2000). שניהם מביעים אקטין-GFP (ירוק) בנוירונים מגה גמא. כפי שתואר קודם לכן (Trunova et al., 2011), יש אזור של אקסונים הפרוקסימלי של wild-type נוירונים גמא זה לא יצליח לצבור אקטין-GFP, ובכך להופיע בתור "אזור ברורה" (, סוגר), ו fasciclin 2 חלבונים (אדום) מצטבר אקסונים רק עד גבול הגחון של אזור זה (קו אופקי לבן). קו מקווקו בלוח השלישי של איור 1 (א) מציין את המיקום של MB, המדגיש את המעשהב "אזור ברורה" והגבול הגחון שלה. אצל זבובי המבטאים Cdk5DN, אזור אקטין ברור התאור (ב ') Fasciclin 2 (FasII) immunoreactivity מתפשט dorsally דרך אזור זה. (שימו לב למספרים משתנים של הפרויקט אקסונים FasII חיובי אופקית לאורך MB, אלה אינן רלוונטיות פנוטיפ). סרגל קנה מידה מייצג 20 מיקרומטר.
באמצעות השיטה שלנו culturing vivo לשעבר, התייחסנו wild-type זבובים עם שילוב של roscovitine ו olomoucine, מעכבי תרופתי של פעילות Cdk5. תרשים 2 מציג פאנל של 3-instar המוח הזחל של שליטה (A) תחת טיפול תרופתי (ב ' wild-type) זבובים. בדומה זבובים המבטאים מבנה דומיננטי שלילי Cdk5, המוח שטופלו Cdk5 מעכבי למשך 24 שעות, מראים ירידה אופיינית לאזור אקטין ברורה שינוי הגבול FasII (סוגריים מרובעים). קווים לבנים להראות המיקום של הגבול FasII wild-type. סרגל קנה מידה מייצג 20 מיקרומטר.
FiguRe 3 מציג סדרות נציג של הגופים תסיסנית פטריות של 0-10 שעות APF, שכותרתו עם קרום ממוקד mCD8-GFP (ירוק). בסוגריים מציינים את גביע, כלומר, את תחזיות הדנדריטים של MB. לקראת מטמורפוזה, אפשר לראות אקסונים מגה שזורמים dorso-ventrally בצרורות עבים, כמו גם "אובך" של אות ניאון הנובעים הדנדריטי ארבור צפופה (סוגריים). כך עולה לוח מוחות גזור ברגע המתאים. הערה גיזום של דנדריטים באזור שעליו הצביע הסוגריים, כך לפי 6-8 שעות APF, אובך של הדנדריטים האות נעלם (אם כי את האות axonal אינו מושפע). המוח בלוח ב נותחו ב 0 שעות APF, לפני הפנימית ecdysone ספייק (טרומן Riddiford, 2002), vivo לשעבר תרבותי כמצוין. אלה לא הראו גיזום ההתפתחותי של דנדריטים, אלא אות הדנדריטים נמשכת לאחר 10 שעות APF. כדי לעקוף זאת, גלמים מסומנים ב APF שעות 0, אך גזור על 1.5 שעות APF ותרבותיים. חלוניתאני מציג סדרה C מייצג של גופים אלה פטריות תסיסנית מ APF שעות 0-10. כמו הלא מתורבתים דגימות, האות הדנדריטים הוא בלתי ניתן לגילוי על ידי 8 שעות APF. סרגל קנה מידה מייצג 20 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מניפולציות גנטיות כרוניות של מבנה ותפקוד רקמות, כולל מוטציות וביטוי transgenes, בדרך כלל ליצור שילוב של השפעות מיידיות ותוצאות עקיפות מאוחר זה יכול להיות מאוד קשה להיפרד. משלימים שיטות גנטיות עם פרמקולוגיה יכול להקל על החקירה כמובן זמן מאחורי פנוטיפ. כך, למשל, זה כבר גישה רב עוצמה לנתח את התרומה של מרכיבים שונים במהלך cytoskeletal spermatogenesis ב תסיסנית 10. בדוגמה הנוכחית, היא אפשרה לנו להראות שיש דרישה עיקשת על Cdk5 לשמור על המבנה של AIS ב תסיסנית. בניסויים אחרים, יש לנו גם הצלחה באמצעות תרופות אחרות היעד רכיבים סלולריים, לרבות קינאזות חלבון (אימטיניב), אקטין פילמור (cytochalasin, latrunculin ו jasplakinolide) ו microtubules (vinblastine ו טקסול).
"> אקס שיטות ב vivo תרבות גם לאפשר ברזולוציה גבוהה ניתוח של הדינמיקה של תהליכים התפתחותיים. מחקרים קודמים תיארו לטווח קצר הדמיה חיה של המוח המרכזי 11, או לטווח ארוך הדמיה של חלקים אחרים של מערכת העצבים, כגון 12 הגרעינים החזה ואת הרשתית / קשרים באונה אופטיים 13. הנה, בעוד אנו מתמקדים בניתוח של הרקמה על ידי immunostaining של חומר קבוע, השיטה שאנו מתארים אמור לחול על הדמיה לטווח ארוך חי של המוח המרכזי. לדוגמה, גיזום נכון של אקסונים דנדריטים במהלך ההתפתחות של הגוף פטריות תסיסנית חיוני יצירת קשרים נכונים ודפוסי בעצםב במערכת העצבים המרכזית. בנוסף, ליקויים בארגון שיפוץ העצבית והם חשבו בבסיס מחלות ניווניות שונות, כולל אלצהיימר, ALS ופרקינסון. השיטה המתוארת כאן מאפשר לנו לחקות ב vivo שיפוץ של neurites ב vivo הגוף פטריות תסיסנית לשעבר, בתרבות. אנחנו יכולים עכשיו שינויים תמונה בפיתוח בתגובה שינויים גנטיים, טיפולים תרופתיים או שינויים בסביבה.
באיור 1. יתר ביטוי Cdk5DN גורם לאובדן של "אזור ברורה" אקטין שינוי הגבול FasII in-נוירונים גמא של הגוף פטריות תסיסנית. לוח מראה שלוש דוגמאות של wild-type המוח מוכתמים של אקטין-GFP (ירוק) ו FasII (אדום) תוך לוח ב 'מראה שתי דוגמאות של המוח יתר המבטאים Cdk5DN. הערה אובדן "אזור ברורה" אקטין (סוגריים) ולהעביר בגבול FasII הגחון (קו לבן אופקי) ב (B). קו מקווקו ב (א) מציין את מיקומו של גוף הפטרייה. סרגל קנה מידה מייצג 20 מיקרומטר.
2 "/>
איור 2. טיפול תרופתי Cdk5 מעכבי roscovitine ו olomoucine מחקה Cdk5DN יתר ביטוי פנוטיפ בגופים תסיסנית פטריות. לוח מראה שני wild-type המוח בקרה תוך לוח B מראה שתי תחת טיפול תרופתי המוח, בתרבית למשך 24 שעות. הערה אובדן "אזור ברורה" אקטין (סוגריים) ו שינוי גבול FasII (קו לבן אופקי) ב (B). סרגל קנה מידה מייצג 20 מיקרומטר.
איור 3. בשיפוץ vivo של דנדריטים של הגוף דנדריטים פטריות תסיסנית ניתן לחזור בדיוק vivo לשעבר. לוח מראה המוח גזור בנקודות הזמן שצוין ומוכתם של ה-GFP קרום הנכנס (ירוק). הערה היעלמותו של האות הדנדריטים (האות מפוזר, ירוק, מודגשת על ידי המסגרת) על ידי 8hr APF. לוח ב 'מראה המוח גזור ב 0 שעות APF ו vivo לשעבר תרבותי vivo לשעבר תרבותית לזמנים שצוינו. מוחות אלו מראים גיזום דנדריט דומה לזה ראיתי in vivo (א '). סרגל קנה מידה מייצג 20 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לכל אנשי המעבדה שלנו, עצות שלהם דיונים והערות מועילות על כתב היד. אנו גם רוצים להודות במיוחד מרתה קוך באסם חסן על ההצעה מצוין כי אנחנו מחכים עד 1.5 שעות APF לפני לנתח מוחות עבור culturing בניסויים שיפוץ. כמו כן, אנו מודים מתקן הדמיה NHGRI לשימוש של מיקרוסקופ confocal שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית Neuroscience בסיסי של תוכנית המחקר NINDS המיפוי, NIH (Z01 NS003106).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider's Drosophila Media | Invitrogen | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum (heat-inactivated) | Invitrogen | 10082-147 | 10% |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 1% |
| Insulin | Invitrogen | 12585-014 | 10μg/ml |
| Ecdysone | Sigma-Aldrich | H5142 | 2μg/ml |
| Roscovitine | Sigma-Aldrich | R7772 | 100μM |
| Olomoucine | Sigma-Aldrich | O0886 | 100μM |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 50062Z | 1% |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | M9501 | 1% |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | D4551 | 4% |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151 | 0.5% |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 70011-044 | 1X |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | EMD Millipore | PI8P01250 | |
| Multidish, 4 well | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 176740 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M |
References
- Trunova, S., Baek, B., Giniger, E. Cdk5 regulates the size of an axon initial segment-like compartment in mushroom body neurons of the Drosophila central brain. J. Neurosci. 31 (29), 10451-10462 (2011).
- Nakada, C., et al. Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization. Nat. Cell Biol. 5 (7), 626-632 (2003).
- Schmid, G., Strosznajder, J. B., Wesierska-Gadek, J. Interplay between the p53 tumor suppressor protein family and Cdk5: novel therapeutic approaches for the treatment of neurodegenerative disease using selective Cdk inhibitors. Mol Neurobiol. 34 (1), 27-50 (2006).
- Kahsai, L., Zars, T. Learning and memory in Drosophila: behavior, genetics, and neural system. Int. Rev. Neurobiol. 99, 139-167 (2011).
- Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126, 4065-4076 (1999).
- Watts, R. J., Hoopfer, E. D., Luo, L. Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system. Neuron. 38 (6), 871-885 (2003).
- Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila. Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).
- Connell-Crowley, L., Le Gall, M., Vo, D. J., Giniger, E. The cyclin-dependent kinase Cdk5 controls multiple aspects of axon patterning in vivo. Curr. Biol. 10 (10), 599-602 (2000).
- Truman, J. W., Riddiford, L. M. Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects. Annu. Rev. Entomol. 47, 467-500 (2002).
- Noguchi, T., Miller, K. G. A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Development. 130, 1805-1816 (2003).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol. Biol. Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).
- Brown, H. L. D., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila. Development. 133, 275-288 (2006).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging. J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).
