3-dimensjonale Resin Casting og bildebehandling av Mouse Portal Vein eller intrahepatiske kanalsystem

Summary

Fremgangsmåte for visualisering og kvantifisere den 3-dimensjonale struktur av mus hepatisk portvenen eller intrahepatisk gallekanalen er beskrevet. Denne harpiks støpt teknikken kan også anvendes for andre duktale eller vaskulær systemer og tillater

Abstract

Med organer, er den riktige arkitekturen av vaskulære og ductal strukturer uunnværlig for riktig fysiologisk funksjon, og dannelsen og opprettholdelsen av disse strukturene er godt regulert prosess. Analysen av disse komplekse, 3-dimensjonale strukturer har sterkt avhengig enten 2-dimensjonal undersøkelse i avsnitt eller på fargestoff injeksjon studier. Disse teknikkene, men er ikke i stand til å tilby en komplett og kvantifiserbare representasjon av duktale eller vaskulær strukturer de er ment å belyse. Alternativt, genererer naturen av 3-dimensjonale plast harpiks avstøpninger permanent øyeblikksbilde av systemet og er en ny og allment nyttig teknikk for å visualisere og kvantifisere 3-dimensjonale strukturer og nettverk.

En avgjørende fordel av harpiksen avstøpning systemet er evnen til å bestemme den intakte og koblet til, eller kommunisere, struktur av et blodkar eller kanal. Strukturen av vaskulær og ductal nettverk er avgjørende for organfunksjon, og denne teknikken har potensial for å hjelpe studie av vaskulære og ductal nettverk på flere måter. Harpiks avstøpning kan brukes til å analysere normal morfologi og funksjonell arkitektur en luminal struktur, identifisere utviklingsmessige morfogenetisk endringer, og avdekke morfologiske forskjeller i vevsarkitektur mellom normale og sykdomstilstander. Tidligere arbeid har utnyttet harpiks støping å studere for eksempel arkitektoniske og funksjonelle defekter innenfor musen intrahepatiske kanalsystem som ikke ble reflektert i 2-dimensjonal analyse av strukturen ^1,2, endringer i hjernens blodkar en Alzheimer musemodell ³ , portvenen unormalt i portalen hypertensive og cirrhose mus ^4, utviklingsmessige trinn i rotte lymphatic modning mellom umodne og voksne lungene ^5, umiddelbare mikrovaskulære endringer i rotte lever, bukspyttkjertel og nyrer som svar i til kjemisk skade^6.

Her presenterer vi en metode for å generere en 3-dimensjonal harpiks kastet av en mus vaskulær eller duktale nettverk, med fokus spesielt på portvenen og intrahepatisk gallegang. Disse kaster kan visualiseres ved å fjerne eller maserere vev og kan deretter bli analysert. Denne teknikken kan brukes til nesten enhver vaskulær eller duktalt system og ville være direkte anvendelig til enhver studie enquiring i utviklingen, funksjon, vedlikehold eller skade av en 3-dimensjonal duktale eller vaskulær struktur.

Protocol

1. Forbered Kanyle

1. Varm en 1-tommers lange delen av PE10 rør med fingertuppene og strekke det slik at slangen blir tynn.
   Merk: størrelsen på fartøyet eller kanalsystem skal kanylert avgjør graden av strekking kreves. Kanylen må være godt strukket for gallegang kaster men kan bare kreves for å bli moderat strukket til å passe innenfor den større portvenen.
2. Kutt strukket slangen på en diagonal til å generere en skrå tips.
3. Skjær den andre kanten av røret for å skape en 5-6 tommers segment.
4. Sette inn et 32 ​​gauge, ½ tommers kanyle inn i den ikke-skråkanten av slangen.

2. Forbered sprøyte med PBS

1. Fyll en 3 ml sprøyte med PBS.
2. Skru sprøyten på nålen med vedlagte trakk PE10 rør tidligere utarbeidet.
3. Flick sprøyte og trykk stempelet for å sikre at PBS har fylt nålen og slangen ogdet er ingen luftbobler i sprøyten.
4. Plasser forberedt sprøyten med PBS i en sprøyte-holderen formet ut av modelleire. Denne holderen vil holde sprøyten stødig mens slangen settes inn i kanalen.

3. Annet Set-up

1. Vei 0,1 g katalysator i en liten beholder, f.eks, en brønn i en 24-brønns plate.
2. Trekk 1 ml harpiks i en 3 ml sprøyte.
   Merk: relative mengder av katalysator og harpiks kan justeres for å endre herdetid. Avtagende mengde katalysator kan imidlertid øke kastet krymping og føre til en mindre ønskelig støpt.
   Merk: når du håndterer harpiks, ta forholdsregler for å unngå kontakt med harpiks eller innånding av harpiks røyk. Bruk alltid hansker og utføre trinnene involverer harpiks i et godt ventilert område, for eksempel en avtrekkskap
3. Klipp et stykke 5,0 silke sutur av ca 5 inches som skal brukes som en ligatur.

4. Forbered Mouse

Ofre voksen mus. Lay mus på ryggen og åpne opp bukhulen.

Lå musen på dissecting omfang plattform. Plasser en 15 ml konisk tube vinkelrett under musen for å øke synligheten og tilgang til leveren.

Fukt en bomullsdott med PBS og bruke den til å snu leveren oppover og bort fra deg for å avsløre dorsal visning av leveren sammen med ekstrahepatiske portvenen eller felles gallegang.

For portvenen kaster, kan du forhindre blodpropp ved å spyle venen med romtemperatur PBS. Fest en nål i en 3 ml sprøyte fylt med PBS og sett nålen i ekstrahepatiske portvenen så langt fra leveren som du kan. Skyv PBS gjennom i portvenen. Gjør et kallenavn i felles kardinal vein å drenere blod. Bruk en våt bomullsdott til massasje leveren, forbedrer blod drenering. Dette trinnet er ikke anbefalt for gallegang og kan ikke være nødvendig for alle vaskulære systemer.
Merk: Dette trinnet kan også være performed med 4% paraformaldehyd i stedet for PBS. Bruk av 4% paraformaldehyd kan øke vaskulær integritet og resultere i en mer presis støpt, spesifikt av mindre vaskulære strukturer.

5. Cannulate Ekstrahepatisk Portal blodåre eller felles gallegang

1. Bruk buede tang å passere kirurgisk sutur ligatur under portvenen eller galle duct, ca ¼ tomme fra leveren.
2. Binde sutur i en løs felles knute. IKKE stramme knuten.
3. Hvis du arbeider med et åpent system, kan det være nyttig å knytte og stramme en ligatur i den andre enden av systemet. Hvis du har åpnet den vanlige kardinal vein å tappe blod fra portvenen, knytte en ligatur rundt det å øke trykket i portvenen og hindre harpiks lekkasje inn i den sentrale nedsatt blodåre.
4. Bruk våren saks til å lage et lite snitt i portvenen eller galle duct, ca ¼ tomme under sutur knute. Dette cut skal trenge ikke mer enn halvveis gjennom diameteren portvenen eller gallegang.
5. Bruke # 5 tang, hold portvenen eller galle duct på stedet av kuttet og sett skrå enden av slangen inn i den gallegang.
6. Push tuppen av slangen forbi pre-bundet ligatur og mot leveren.
7. Test for kanylering nøyaktighet ved å injisere PBS gjennom kanylen og ser for å se om den kommer inn i portvenen eller galle duct.
8. Stram ligatur å holde kanylen på plass.

6. Resin Cast portvenen eller intrahepatiske Duct

1. Legg forhåndsmålt 1 ml resin til forhåndsmålt 0,1 g katalysator og bland godt. Unngå å generere luftbobler.
2. Tegn harpiks-katalysator blandingen tilbake i 3 ml sprøyte. Fjern eventuelle luftbobler ved forsiktig flicking sprøyten og utstøter bobler.
   NB: For støping små strukturer, kan det være nyttig å bruke et vakuumkammer for å fjerne meget små luftbobler fra the harpiks og forbedre cast kvalitet. For å tillate tid til å utføre dette trinnet, vil det være nødvendig å redusere katalysator / harpiks-forhold fra det antydet ovenfor for å bremse harpiks herding.
3. Nøye erstatte PBS-holdig sprøyte med harpiks-inneholdende sprøyten, forlater 32 gauge nål festet til kanylen.
4. Sakte og forsiktig presse harpiks i portvenen eller galle duct til motstanden øker og lever er fylt.
5. Bruk våt bomullsdott å massere leveren og oppmuntre til en enda fyll.
6. Fjern kanylen fra strukturen og raskt skru til ligatur for å hindre harpiks lekkasje.
7. Tillat musen til å ligge flatt ved romtemperatur i 20 min mens harpiks herder, deretter fjerne leveren.
8. Fortsett med enten fjerne eller maserere leveren.

7. Klart Liver for visualisering in situ

1. Fest leveren i 4% paraformaldehyd over natten ved 4 ° C, gynge.
2. Vask levereni PBS i minst fire timer, gynge. På dette punktet, kan du skille leveren fliker hvis ønskelig.
3. Dehydrere i 50% metanol og deretter i 100% metanol i minst fire timer hver, vuggende ved romtemperatur.
4. Slett leveren i en 01:02 oppløsning av benzylalkohol og benzylbenzoat (Babb) i minst 24 timer, gynge. Lengre vasketidene kan være nødvendig. Hvis leveren ikke klart helt etter 2-3 dager, flytte tilbake til 100% metanol i 24 timer og gjenta Babb clearing.
5. Senk lever i Babb i et glass petriskål for imaging in situ.

8. Macerate levervev

1. Fjern leveren fra mus og satt inn i en 50 ml konisk rør med vann. Vent en time for fullstendig harpiks herding. Separate lever fliker hvis ønskelig.
2. Hell av vannet og flytte leveren til en glassflaske. Senk i 15% KOH. La over natten ved romtemperatur. Ikke beveg.
3. Forsiktig helle avslag KOH og vask støpt i destillert vann. Merk: cast er very skjøre og bør behandles med ekstrem forsiktighet. Unngå å forstyrre cast ved tillegging eller fjerne væske fra røret.
4. Når harpiks cast er ren, forsiktig lå på en Kimwipe til tørk, og deretter overføre til en container som skal lagres.

9. Representant Resultater

En vellykket kastet av portvenen eller galle duct vil vise et sammenhengende nett av stadig mindre grener som strekker seg fra hilum til leveren periferien.

Fig. 1 viser et portvenen støpt som visualisert i situ etter Babb clearing. Figur 1A viser de støpt av hele venstre leveren lobe og formen og størrelsen av kastet. Figur 1B viser et nærbilde visning av samme støpt, demonstrere penetrering av harpiksen inn i de minste portvenen greiner på leveren periferien.

Figur 2 viser et portvenen støpt som har gjennomgått Koh Maceration. Figur 2A viser hele venstre leveren lobe og figur 2B er et nærbilde av de små perifere grener.

Denne teknikken har også blitt brukt til intrahepatisk gallegang og publisert ved hjelp av både Babb clearing og Koh maserasjon teknikker ^1,2,7.

Vanlige problemer ufullstendig fyller, demonstrerer bobler i harpiks, og overflyt i omkringliggende systemer eller vev. Figur 3 hvordan å gjenkjenne en ufullstendig fylling (figur 3A), bobler (figur 3A), og en overflyt av harpiks fra portvenen til sentral vene (Figur 3B).

Alle bildene er tatt med et Leica MZ 16 FA stereoscope og QImaging RETIGA 4000R kamera.

Figur 1. Babb-ryddet harpiks cast av nedsatt venstre lapp portvenen. A. Harpiks cast viser en hierarkisk forgrening struktur som strekker seg fra hilum til leveren periferien. Harpiks cast vises i gul farge innen blå-farget leveren lobe. B. En nær dukker opp som harpiks fylle strekker seg til små greiner i leveren periferien. Harpiks er hvitaktig gjennom ryddet leveren. Målestokk = 1 mm.

Figur 2. Tissue-macerated harpiks cast av nedsatt venstre lapp portvenen. A. Resin kastet av hele leveren lobe viser mange grener av varierende størrelse. B. Nærbilde viser små filialer i periferien av leveren. Uklare av små greiner representerer harpiks fylling av sinusformet mellomrom og kan eller ikke kan være synlige på harpiks kaster og vil øke den tilsynelatende grenen tetthet hvis den finnes. Harpiks er hvit i fargen. Målestokk = 1 mm.

Figur 3. Vanlige problemer med harpiks kaster. A. En ufullstendig fylling av venstre lapp portvenen er tydelig av noen eller alle støpte grener unnlater å utvide til leveren periferien. Dette kastet viser også bobler, synlig som brudd i kontinuerlig cast (pil). B. På grunn av nærheten til portvenen og sentral vene grener i noen steder, vil portvenen harpiks ofte inn og fylle den sentrale vene. Dette kan bli gjenkjent når det er to forskjellige hilar grener (piler) og to forgreninger strukturer som har ulike mønstre og overlapping. Diskriminerende mellom tekniske feil og sanne morfologiske endringer kan gjøres på to måter. Først bør det støpt struktur sammenlignes til strukturen forventet basert på to-dimensjonal analyse eller andre metoder. Sekund, er det viktig å utføre flere replikater, og når det er mulig, kvantifisere structure og utføre statistisk analyse for å fastslå reproduserbarhet og hvis det er en statistisk signifikant morfologisk endring mellom og innenfor ulike eksperimentelle og kontrollgruppene.

Discussion

Vi har beskrevet konkrete eksempler for hvordan portvenen og intrahepatiske kanalsystem i leveren kan støpes, men denne teknikk kan brukes til praktisk talt alle andre duktale eller karsystemet med små tilpasninger. Tidligere arbeid har vist gjennomførbarheten av denne teknikken i flere arter, inkludert mus, ^1,2,7-9 andungen ^{10,11, 12,13} kanin, hund ^14, og gris ^15, og i mange organer, inkludert nasal kjertel ^14, hjerte ^16, blære ^12,13, og ^1,2,7,8 leveren. Disse kaster kan brukes til å sammenligne flere systemer (for eksempel portvenen og gallegang) innenfor samme vev, den samme struktur tvers utviklingsstadier ^5, eller effekt på en struktur av genetiske eller miljømessige endringer eller påvirkninger ^{1-4 , 6,7.} Den brede anvendelsen av denne teknikken på tvers arter og organer gjør harpiks avstøpning en svært verdifullt verktøy for studying morfologi av vaskulære og ductal strukturer og har potensial til å øke vår kunnskap om normal funksjon av disse strukturene, samt hvordan de påvirkes, eller hvordan de påvirker et organ, i dyresykdommer modeller.

Bruken av harpiks å lage 3-dimensjonale kaster gir en permanent øyeblikksbilde av en duktale eller karsystemet og har flere fordeler fremfor lignende teknikker. Først, kan kastet analyseres som en stand-alone struktur etter maserasjon, og tilbyr en fordel over tusj eller lignende blekk injeksjoner. Sekund, øker varigheten av strukturen enkel analyse. Sist, tillater muligheten av Mercox II harpiks å tåle Babb clearing prosedyren for en enestående evne til å visualisere en struktur i situ selv innenfor store eller tette vev.

Det finnes flere typer av harpiks tilgjengelig med forskjellige egenskaper. Mercox II har blitt valgt for denne teknikken for sine mange advantages, Mercox II har lav viskositet, slik at det å trenge lite perifer portvenen og galle duct grener må det raskt og komplett herding ved romtemperatur, avgjørende for å analysere frittstående macerated cast, har det minimal krymping når herdet, og det tåler Babb vev clearing. Annen type harpiks, Microfil (Flowtech, Carver, MA), er blitt brukt i flere publiserte studier ^8,9,15. Forholdsvis, ikke Microfil ikke kurere helt ved romtemperatur og er best visualisert gjennom vev clearing. Microfil kaster av portvenen har tidligere blitt analysert gjennom 10% formalin fiksering og påfølgende clearing med ethanolmethyl salicylate ^8.

Resin tilsetningsstoffer kan gi ytterligere metoder for cast visualisering, tillegg av fargestoffer, fluorescerende molekyler, eller mikrosfærer kan forbedre analysen. Hensyn må tas, men å sikre at fargestoffmolekylene valgt er små nok til å trenge inn i intended vaskulær eller duktalt struktur, at de ikke vesentlig endrer egenskapene av harpiksen, at de er i stand til å tåle enten vevet clearing eller maserasjon, og at de er kompatible med den ønskede metode for analyse. Velge harpiks tilsetningsstoffer vil avhenge sterkt av den spesifikke applikasjonen: for eksempel, mikrokuler (Molecular Probes) er for store til å passere gjennom de hepatiske sinusoids, noe som gjør dem uegnet for studiet av normal sinusformet arkitektur men et perfekt verktøy for å undersøke utviklingen av portosystemic shunter , som er store nok til å romme mikrokuler, i en genetisk forandret musemodell ^8.

Endelig kan harpiks støpt analyse utføres enten klarert eller macerated kaster. Babb-ryddet kaster er nyttig å måle strukturen av et system som det er relatert til organet innen hvilken den ligger. KOH-macerated kaster kan analyseres på flere måter. Tidligere studier har brukt scanning elektron mikroskopi (SEM) for å visualisere mikrosirkulasjon nettverk og fartøy struktur ^12,13,17. Kaster kan også kvantifiseres for avdelingsnummer, diameter og volum med bruk av microcomputed tomografi (microCT) ^{1,15,18, 19,20.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PE10 polyethylene tubing	Fisher Scientific	1417012P
5-0 surgical black braided silk	Roboz Surgical	SUT-15-1
Steriject 32 G x 13 mm needle	Air-tite	TSK3213
Spring scissors	Fine Science Tools	15000-08
Number 5 forceps	Fine Science Tools	91150-20
Mercox II kit	Ladd Research	21247
Benzyl alcohol	Fisher Scientific	1816-04	Only required for BABB-clearing
Benzyl benzoate	MP Biomedicals, LLC	154839	Only required for BABB-clearing
Phosphate-buffered saline (PBS)
Modeling clay
Scale
Laboratory scissors
15 ml cap polypropylene tubes
4% paraformaldahyde
15% potassium hydroxide (KOH)			Only required for maceration
Razor blade
100% methanol
3 ml luer lock syringe