Summary
Questo articolo e il video di accompagnamento presentare il nostro protocollo per la generazione di tessuto ingegnerizzato intestino nel topo, utilizzando un organoid unità-on-scaffold approccio.
Abstract
Dell'ingegneria tissutale piccolo intestino (TESI) è stato utilizzato con successo per salvare i ratti Lewis dopo massiccia resezione dell'intestino tenue, con conseguente ritorno al peso pre-operatorie entro 40 giorni. 1 negli esseri umani, massiccia resezione del piccolo intestino può causare sindrome da intestino corto, un malassorbimento funzionale stato che conferisce una significativa morbidità, mortalità e costi sanitari tra cui la dipendenza nutrizione parenterale, insufficienza epatica e cirrosi, e la necessità di trapianti di organi multiviscerale. 2 In questo lavoro si descrivono e documentano il nostro protocollo per la creazione di tessuti ingegnerizzati intestino in un modello murino con una unità multicellulare organoid-on-scaffold approccio. Unità Organoid sono aggregati multicellulari derivanti dall'intestino che contengono elementi sia delle mucose e mesenchimali, 3 il rapporto tra che conserva l'intestinale nicchia delle cellule staminali. 4 Nella ricerca in corso e future, la transizione della nostra tecnica nelladel mouse consentirà di indagine dei processi che intervengono durante la formazione TESI utilizzando gli strumenti disponibili transgeniche in questa specie. 5 La disponibilità di ceppi di topi immunocompromessi inoltre ci permette di applicare la tecnica di tessuto intestinale umano e ottimizzare la formazione di TESI umana come xenotrapianto del mouse prima della sua transizione verso gli esseri umani. Il nostro metodo utilizza le buone prassi di fabbricazione (GMP) reagenti e materiali che sono già stati approvati per l'uso in pazienti umani, e offre quindi un vantaggio significativo rispetto agli approcci che si basano su tessuti animali decellularizzato. L'obiettivo finale di questo metodo è la sua traduzione per gli esseri umani come una strategia di medicina rigenerativa terapeutico per la sindrome dell'intestino corto.
Protocol
1. Organoid unità di preparazione
- Strumenti adeguati per la dissezione del mouse (forbici e pinze) devono essere sterilizzati in autoclave.
- Umanamente eutanasia il mouse donatore secondo protocolli locali IACUC. Assicurarsi che l'animale è morto prima di procedere.
- Fare una incisione mediana per accedere alla cavità peritoneale. Lembi cutanei può essere riflessa come necessario per migliorare l'esposizione.
- Sventrare il piccolo intestino e dividerlo appena distalmente al legamento di Treitz. Separare il piccolo intestino dal suo mesentere con tagliente e dolce smussa. Identificare la giunzione ileocecale e dividere il piccolo intestino 5 millimetri prossimale a questo.
- Con forbici, aprire l'intestino longitudinalmente lungo il confine antimesenterico in una piastra di Petri con 10 ml 4 ° C, soluzione salina tamponata sterile Hanks '(HBSS, Invitrogen, Carlsbad CA) / 1X antibiotico-antimicotico (Anti-Anti, Invitrogen) soluzione. Cancella materia fecale dall'intestino aperto conagitazione poi trasferimento intestino aperto un tubo da centrifuga 15 ml con 10 ml di 4 ° C, sterili HBSS / 1X anti-anti.
- Lavare l'intestino aperto tre volte in 10 ml di 4 ° C, HBSS 1X sterile / anti-anti in una provetta. Ogni lavaggio può essere eseguito con lieve agitazione del tubo 15 ml per 30 sec. Dopo agitazione, il tessuto intestinale scende sul fondo della provetta. Eliminare materiale galleggiante, che è detriti mesenchimale. Rimuovere la soluzione di lavaggio accuratamente con una pipetta.
- Tritare l'intestino lavato in una piastra di Petri con 10 ml di 4 ° C, HBSS 1X sterile / anti-anti a meno di 1 millimetro pezzi quadrati utilizzando un paio di forbici. Raccogliere il materiale tritato con una pipetta automatica e metterla in una provetta.
- Centrifugare la provetta a 500 rpm per 8 min. Eliminare il supernatante, che contiene grassi e mesenchima.
- Digerire il tritato, materiale lavato con 10 ml di HBSS sterili / 1X anti-anti + 0,125 mg / ml dispasi (Invitrogen) e 800 unità / ml collagenasi di tipo 1 (Worthington, Lakewood NJ). Per preparare 40 ml della soluzione di digestione, pesare 5 mg di dispasi, 142 mg di collagenasi, e aggiungere HBSS sterili fino ad un volume di 40 ml. Preparare questa soluzione fresca ogni unità di tempo organoid sono preparati, e mantenere a 4 ° C fino al momento dell'uso. Aggiungere la soluzione digestione direttamente al pellet dal passo 1,8.
- Incubare la provetta contenente il macinato, materiale lavato con la soluzione di digestione a 37 ° C per 20 min.
- Recuperare la provetta e in seguito a distruggere il tessuto digerito da triturazione con una pipetta 10 ml. Ripetere tra 20 fino a 50 volte un aspetto uniforme.
- Centrifugare la provetta per 5 min a 800 rpm. Eliminare il supernatante, che contiene le cellule singole.
- Arrestare la reazione di digestione con 10 ml di 4 ° C, sterile Eagle modificato da Dulbecco (DMEM, Invitrogen) più 10% v / v di calore-siero fetale bovino inattivato (HI-FBS, Invitrogen). Risospendere la pellet e agitare la provetta.
- Centrifugare la provetta per 5 min a 800 rpm. Rimuovere il surnatante con cura con una pipetta automatica fino a quando le ultime gocce. Utilizzare una pipetta di plastica monouso per le ultime gocce per evitare di risospensione del pellet.
2. Caricamento di acido poliglicolico impalcatura
- Formare 2-mm, 5 mm di diametro scaffold cilindriche esterne di acido poliglicolico non tessuto (2 mm di spessore, 60 mg cm-3 densità apparente, la porosità> 95%, Fibre Concordia, RI Coventry) come descritto nel rif. 4.
- Tagliare il distale 2 mm di una usa e getta 1000 pipetta microlitro punta con le forbici preparati con etanolo al 70% in acqua distillata.
- Posizionare il patibolo in un 4-pozzetti cultura. Caricare le unità organoid sull'impalcatura con la pipetta 1000 microlitri, prima nel lume e quindi sulla superficie esterna. Utilizzare una pinza per garantire rivestimento del lume. Non disturbare o rompere la forma cilindrica del polimero.
3. L'impianto in mouse Host
- Utilizzare un mouse singenici host lo stesso sfondo del donatore, se disponibile. In caso contrario, impiegano un diabetico non obesi immunocompromessi / immunodeficienza combinata grave o NOD / SCID animale (Jackson Laboratories, Sacramento CA).
- Indurre l'anestesia generale con isoflurano. Shave, preparazione ed attaccare l'addome del mouse.
- Eseguire un'incisione 5 millimetri linea mediana per guadagnare l'accesso alla cavità peritoneale. Identificare e sviscerare con attenzione l'omento maggiore. Posizionare il polimero caricato sulla omento e avvolgerlo con il tessuto. Non strappare l'omento.
- Fissare il polimero all'omento con una sutura 5-0 monocryl. Delicatamente sostituire il omento con il polimero avvolto nella sua posizione anatomica.
- Chiudere l'incisione addominale a strati con 4-0 punti di sutura Vicryl. Eseguire la chiusura dei muscoli e fare attenzione a non danneggiare i visceri addominali sotto l'incisione. Utilizzare punti staccati per la pelle.
- Somministrare analgesia postoperatoria con 2 mg / kg di ketoprofene (Ketofen, Fort Dodge Animal Health) in acqua sterile come un pomfo sottocutanea adiacente alla incisione. Gli animali devono essere valutati tutti i giorni e se l'animale sta dimostrando segni di dolore o disagio, una dose supplementare di ketoprofene può essere somministrato il giorno post operatorio 2. Il terzo giorno post-operatorio, l'animale deve essere totalmente recuperato senza evidenza di dolore o disagio. Se il dolore o angoscia continua il giorno post operatorio 3, questo è considerato anormale e dovrebbe essere affrontata in conformità con i protocolli di cura IACUC e animale degli impianti.
- Lasciare il mouse per recuperare e il tessuto-ingegnerizzato intestino a crescere per quattro settimane. Dare l'annuncio accesso animale libitum nei roditori chow (Lab Dieta 5001, PMI nutrizione, St. Louis MO) e acqua con Septra 200 mg / 40 mg per 5 ml (Hi-Tech Pharmacal, Amityville NY) alla diluizione 1:100.
4. Raccolto
- HumaNely eutanasia l'animale ospite quattro settimane dopo l'impianto.
- Riaprire l'incisione originale e riflettere la pelle cranialmente per facilitare l'accesso alla cavità peritoneale.
- Aprite il livello muscolare e di identificare il tessuto ingegnerizzato costrutto come un globo di tessuto.
- Abbattere adesioni al costrutto da intra-addominale con visceri dissezione netta.
- Fissare il costrutto in formalina per paraffina dopo il montaggio, oppure utilizzare il tessuto fresco per saggi biochimici come real-time PCR o isolamento delle proteine.
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Representative Results
La figura 1 mostra uno schema generale per il protocollo qui documentato. Il risultato finale di questo protocollo è una struttura sferica del globo o tissutale intestino murino con un lume, mucosa, sottomucosa, muscolare e circostante. Figura 2A mostra un globo tipico rispetto ad un polimero di partenza patibolo. Figura 2B mostra lo stesso costrutto bruscamente bivalved di rivelare le sue lumen. Figura 3 illustra un ematossilina / eosina-stained paraffina montato sezione trasversale di un tipico costrutto successo dopo 4 settimane di incubazione. In rif. 4, siamo stati in grado di produrre tessuto-ingegnerizzato intestino con successo l'89% delle volte (39 su 44 impianti).
Un costrutto soccombente è quella in cui non si formi della mucosa. E 'impossibile giudicare sulla base di aspetto macroscopico al momento della raccolta se il globo avrà mucosa in finale l'analisi istologica. Quindi se sono saggi biochimici Effettuared sul tessuto costrutto fresco, metà di ogni globo fissare paraffina e montato per l'analisi istologica per confermare che mucosa è presente in ciascun campione. Un costrutto successo dimostrerà solo stroma e fibrosi in ematossilina / eosina.
Figura 1. Schema per la produzione di tessuto-ingegnerizzato intestinale nel topo. In breve, il tessuto del donatore viene raccolta e trattata in unità organoid. Le unità organoid sono caricati su una impalcatura porosa acido poliglicolico, che viene poi impiantato in un ospite e lasciati incubare per 4 settimane. Il costrutto ingegneria è stato poi recuperato e può essere caratterizzata tramite istologia o saggi biochimici.
Figura 2. Esempio di tessuto ingegnerizzato intestino costrutto raccolte a 4 settimane. R: Costruire in compaRison di iniziare polimero patibolo. B: Lo stesso costrutto, bivalved di rivelare le sue lume.
Figura 3. Bassa potenza ematossilina / eosina al microscopio di un tipico successo tissutale costrutto intestino. Le etichette e le frecce indicano il lume con la mucosa intestinale, e del pancreas ospite aderente.
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Discussion
Vi presentiamo un protocollo per la produzione di tessuti ingegnerizzati intestino nel topo utilizzando un unità-on-scaffold approccio organoid. Le fasi più critiche sono quelle della preparazione organoid unità. Bisogna fare attenzione a pulire in modo adeguato e meccanicamente elaborare il tessuto, ma la stessa cura deve essere presa per non overdigest o overtriturate le unità organoid dopo la digestione viene eseguita (passo 1.11). Se questo è fatto, le unità organoid può essere ridotto a singole cellule, che possono essere persi nel supernatante di passo 1,12, e sono difficilmente sopravviverà produrre tissutale intestinale, come la nicchia intestinale cellule staminali non sarebbe conservato in questo caso.
Le piccole dimensioni del mouse rende difficile l'anastomosi direttamente tissutale costrutto di intestino dell'animale ospite per testare la sua funzione in vivo. In alternativa, il ratto rappresenta un modello di crescita più TESI che facilita anastomosi in vivo eè già stata eseguita per questo motivo 1. Tuttavia, la dimensione del mouse non è un ostacolo insuperabile, come altri sono stati in grado di eseguire la resezione del piccolo intestino e anastomosi, 6 o chirurgia anorettale, 7 in questi animali. Per rispondere a queste esperienze, problemi da caratterizzare la funzione dei nostri costrutti intestinale tissutale in vitro di moda sono in corso. Ulteriori limitazioni di questa tecnica includono un tasso di successo del 89% nella produzione di TESI 4. Vale a dire, l'89% delle OU scaffold caricati con successo genera TESI. L'applicazione di questa tecnica da altri può aiutare a perfezionare e migliorare questa tecnica aumentando la resa globale al 100%. Inoltre, questa tecnica può essere migliorata se la massa di tessuto totale generato potrebbe essere aumentato. Attualmente, citometria a flusso ha dimostrato che il numero totale di cellule presenti nel TESI raccolto costrutto è tre volte maggiore del numero di specie di impiantazione(3,07 x 10 6 ± 0,5 x 10 6) 4. Migliorare il volume della produzione TESI è un passo importante verso la definizione alla terapia.
Si segnala altresì che l'intestino mouse, essendo molto sottili e di piccolo calibro, è particolarmente facile da lavorare rispetto a quella di altre specie come suina o di ratto. Negli esseri umani, ci aspettiamo che alcuni dei dettagli dei passaggi organoid unità di preparazione dovrebbe essere modificata sia adeguatamente digerire il tessuto ed evitare overdigestion di singole cellule, in particolare le concentrazioni di dispasi e collagenasi nella soluzione di digestione e il tempo di digestione a 37 ° C.
L'obiettivo finale di questa tecnica è un passaggio alla terapia umana. L'ingegneria dei tessuti dell'intestino umano dal tessuto del paziente, potrebbero potenzialmente offrire un durevole, cura a lungo termine per la sindrome da intestino corto (SBS) con nessuno degli svantaggi di terapie esistenti. Breve intestinale syndrome è una condizione morbosa causata da resezione di una significativa frazione della lunghezza totale dell'intestino tenue, generalmente maggiore di 50-75 per cento, tale che la sua capacità di assorbimento è notevolmente ridotta e il paziente non può ottenere sufficiente nutrimento dalla nutrizione enterale. 2 In i bambini, le cause più comuni di SBS sono enormi resezione del piccolo intestino secondaria a enterocolite necrotizzante o malrotazione con midgut volvolo. 8,9 Inoltre, anche se meno comune, SBS possono verificarsi negli adulti a causa di resezioni più in un quadro di malattia di Crohn, o con ischemia mesenterica secondaria a malattia vascolare. 10,11 Poiché i pazienti SBS non può mantenere una nutrizione enterale con presa sufficiente, essi possono richiedere a lungo termine la nutrizione parenterale totale, che a sua volta può essere complicata nei bambini di insufficienza epatica e cirrosi. SBS 12 pazienti pertanto sopportare significativo costi sanitari, ha recentemente stimato essere dell'ordine di $ 1,6 milioni per pazienteoltre 5 anni 13. L'attuale standard di cura per insufficienza intestinale secondaria alla SBS è intestinale, fegato / intestinale, o altri trapianti multiviscerale, ma questo conferisce solo un 60% sopravvivenza a 5 anni e consegna il paziente ad un corso di terapia immunosoppressiva per tutta la vita 14. Inoltre, i risultati limitati di donatori di organi disponibilità in un inevitabile disparità della domanda e dell'offerta e lunghi tempi di attesa. 15 Perciò, l'ingegneria dei tessuti dal tessuto autologo del paziente sarebbe stata una valida alternativa.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Tracy C. Grikscheit, Erik R. Barthel, e Frédéric G. Sala sono supportati dal California Institute for Regenerative Medicine (CIRM), i numeri di concedere RN2-00946-1 (TCG) e TG2-01168 (ERB, FGS). Allison L. Speer è una Società di Chirurgia dell'Università Ethicon studioso. Yashuhiro Torashima è finanziato da un ospedale pediatrico Fellowship Los Angeles Saban Research Career Development Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Gibco | 114170-112 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100X | Invitrogen | 15240-062 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Collagenase Type 1 | Worthington | LS004194 | |
| DMEM High Glucose 1X | Gibco | 11995-065 | |
| Heat inactivated FBS | Invitrogen | 16140-071 | |
| Biofelt 100% PGA | Concordia Medical | FELT01-1005 | For polymer preparation as in Ref. 4 |
| Poly-L-lactic acid | Durect | B6002-1 | For polymer preparation as in Ref. 4 |
| Type I Collagen, rat tail | Sigma-Aldrich | C3867-1VL | For polymer preparation as in Ref. 4 |
| Ketoprofen 100 mg/ml | Fort Dodge Animal Health | 71-KETOI-100-50 | |
| LabDiet 5001 rodent chow | LabDiet | 5001 | |
| Septra 200 mg / 40 mg per 5 ml, USP | Hi-Tech Pharmacal | 50383-824-16 | |
| Isoflurane, USP | Phoenix Pharmaceuticals | 57319-507-06 |
References
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