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Biology

Visualisation des bactéries dans nématodes en utilisant la microscopie à fluorescence

Published: October 19, 2012 doi: 10.3791/4298
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Bacteriology, University of Wisconsin-Madison

Summary

Pour étudier le mutualisme entre

Abstract

Symbioses, le vivre ensemble de deux ou plusieurs organismes, sont répandues dans tous les règnes du vivant. Comme deux des organismes les plus répandus sur la terre, les nématodes et les bactéries forment un large éventail d'associations symbiotiques qui vont de bénéfique pour les pathogènes 1-3. Une telle association est la relation mutuellement bénéfique entre les bactéries et nématodes Steinernema Xenorhabdus, qui a émergé en tant que système modèle de symbiose 4. Nématodes entomopathogènes Steinernema sont, en utilisant leur symbiote bactérien pour tuer les insectes 5. Pour la transmission entre les hôtes d'insectes, les bactéries colonisent l'intestin de l'étape du nématode infectieux juvénile 6-8. Récemment, plusieurs autres espèces de nématodes a été démontré que les bactéries utilisent pour tuer les insectes 9-13, et les enquêtes ont commencé à étudier les interactions entre les nématodes et les bactéries dans ces systèmes <sup> 9.

Nous décrivons une méthode pour la visualisation d'un symbiote bactérien dans ou sur un hôte de nématodes, profitant de la transparence optique de nématodes lorsqu'ils sont vus au microscope. Les bactéries sont modifiées pour exprimer une protéine fluorescente, ce qui permet leur visualisation par microscopie de fluorescence. Il existe de nombreux plasmides qui portent des gènes codant pour des protéines qui sont fluorescents à différentes longueurs d'onde (c.-vert ou rouge), et la conjugaison des plasmides provenant d'une souche d'Escherichia coli donateurs dans un symbiote bactérien destinataire est positive pour une large gamme de bactéries. Les méthodes décrites ont été développés pour étudier l'association entre Steinernema carpocapsae et Xenorhabdus nematophila 14. Des méthodes similaires ont été utilisées pour étudier d'autres nématodes bactérie associations 9, 15-18 et l'approche est donc généralement applicable.

Le rencontréhod permet de caractériser la présence de bactéries et de localisation au sein de nématodes à des stades de développement différents, donnant un aperçu de la nature de l'association et le processus de la colonisation 14, 16, 19. L'analyse microscopique révèle la fréquence de colonisation à l'intérieur d'une population et la localisation des bactéries aux tissus de l'hôte 14, 16, 19-21. Il s'agit d'un avantage sur les autres méthodes de surveillance des bactéries au sein des populations de nématodes, tels que la sonication 22 ou meulage 23, qui peuvent fournir des niveaux moyens de la colonisation, mais ne peut pas, par exemple, distinguer les populations avec une fréquence élevée de faibles charges symbiotes des populations une basse fréquence de charges élevées symbiotes. Discriminer la fréquence et la charge de bactéries colonisant peut être particulièrement important lors du dépistage ou de caractérisation de mutants bactériens des phénotypes colonisation 21, 24. En effet, la microscopie à fluorescence a été utilisé dans criblage à haut débit de mutants bactériens pour les défauts de la colonisation 17, 18, ​​et est moins pénible que les autres méthodes, y compris sonication 22, 25-27 et dissection des nématodes individuelle 28, 29.

Protocol

1. Construction d'une souche bactérienne Fluorescent via Conjugaison

  1. Croître la souche receveuse (symbiote à examiner) et souche donneuse du jour au lendemain. La souche donneuse, en général Escherichia coli, devrait être capable de donner l'ADN par conjugaison et doivent être transformées avec un. Plasmide (tableau 2) qui porte un gène codant pour une protéine fluorescente Selon le plasmide, une souche d'aide conjugaison peut également être nécessaire. Si c'est le cas, cette souche devrait également être cultivées pendant une nuit. La souche donneuse et de la souche d'aide doit être cultivé avec des antibiotiques à sélectionner pour le maintien du plasmide.
  2. Repiquer le donateur, aide et souches receveuses en nutriments des milieux de croissance riches manquent antibiotiques dans un rapport 1:100 de la culture et moyennes entreprises.
  3. Développer les cultures à la température appropriée pour chaque souche jusqu'à ce qu'ils atteignent le stade de croissance semi-logarithmique (DO600 ~ 0,6). Pour Xenorhabdus et E. coli ce stade de croissancee est atteint environ 3 à 4 heures après repiquage. Cela peut varier en fonction de la souche, ou, dans certains cas, le plasmide utilisé.
  4. Mélanger les souches dans un microtube et centrifuger 2 min à 17900 xg (13.000 rpm dans la plupart des microfuges). La proportion de donneur et du receveur qui donne les meilleurs résultats peuvent varier pour différentes combinaisons, et peut être déterminée de manière empirique. Pour un destinataire Xenorhabdus et E. coli donateurs, nous utilisons un mélange 3:1 ou 1:1. Si une souche d'aide est nécessaire (par exemple E. coli), il convient d'ajouter dans le même rapport que le donneur.
  5. Décanter le surnageant.
  6. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 30 pl de milieu frais.
  7. Repérez la suspension sur une plaque de milieux riches en nutriments sans antibiotiques, et de permettre l'endroit pour sécher.
  8. Incuber la plaque, inversé, du jour au lendemain à une température optimale pour la bactérie receveuse et admissible pour le donateur (et d'un assistant, le cas échéant). La plaque doitêtre incubées au moins 18 heures.
  9. Ramasser le spot et série pour les colonies isolées sur une plaque sélective des antibiotiques. Les antibiotiques doivent choisir contre le donneur et pour le receveur contenant le plasmide. Un ou deux stries d'isolement supplémentaires peuvent être nécessaires pour isoler une culture pure.
  10. S'assurer que les colonies résultantes sont le symbiote destinataire, et non la souche donneuse, par le dépistage de la présence de phénotypes bénéficiaires spécifiques, tels que la morphologie des colonies, ou la détection réaction en chaîne par polymérase du destinataire des gènes spécifiques. Cribler les colonies de la présence du plasmide par réaction de polymérisation en chaîne d'une séquence connue plasmide et la fluorescence. Les colonies doit fluorescence sous la longueur d'onde correcte correspondant à la protéine fluorescente.

2. Production d'oeufs de nématodes axéniques

  1. Croissance de 5 ml du symbiote bactérien naturel du jour au lendemain. Pour commencer une culture, les bactéries peuvent être inoculés dans Lysogénie Broth (LB) ou cu autresmédias lture directement à partir d'un stock ou d'un congélateur plaque de porcelaine.
  2. Étaler 600 ul de la culture bactérienne sur 10 mm Agar lipides (LA) plaques 29. Huit à dix plaques donnera suffisamment de nématodes pour la plupart des espèces.
  3. Incuber dans l'obscurité sans humidité à 25 ° C pendant deux jours.
  4. Ajouter nématodes infectieux 5.000 mineurs, ou d'autres étapes selon le nématode utilisé, dans 500 ul de médias pour les pelouses bactériennes. Incuber les boîtes à 25 ° C pendant 3 jours.
  5. Vérifiez vos plaques pour la présence de nématodes adultes et les œufs. Placer 20 ul d'eau sur une lame de microscope. À l'aide d'un bâton stérile racler en place une petite quantité de nématodes dans le tapis bactérien. Placez le bâton dans l'eau et permettre aux nématodes à nager au large. Regardez votre diapositive à faible grossissement. Pour plus d'informations sur l'apparence reporter à la discussion et à la figure 2.
  6. Si les œufs et les femelles sont visibles, continuer, sinon, incuber les plaques à 25 ans & dpar exemple, C et vérifier le bon développement tout hr 6-12. Lorsque les femelles contiennent des oeufs, placez quelques ml d'eau sur la surface des plaques. Remuer doucement les plaques et verser l'eau dans un tube conique de 50 ml. Les nématodes doit se détacher des plaques et ne sera plus visible sur la surface de la plaque. Plusieurs rinçages peut être nécessaire.
  7. Permettre aux nématodes de se déposer au fond du tube.
  8. Rincer les nématodes. Pipeter l'excès d'eau de la partie supérieure du tube. Remplir avec de l'eau propre et laisser nématodes adultes à régler. Pipeter l'excès d'eau.
  9. Remplir les tubes coniques avec une solution d'oeuf. Une fois la solution d'œuf est ajouté le calendrier de toutes les étapes avec une solution d'œuf doit procéder exactement comme décrit pour le rendement maximal d'œufs. Incuber les tubes tout en agitant doucement pendant exactement 10 min. La plupart des nématodes doit être dissous à la fin de l'incubation.
  10. Immédiatement centrifuger les tubes coniques à 1250 xg pendant 10 min exactement (ce qui comprend la mise en place de la centrifugeuse afin d'accélérermais pas à 0 x g. Utilisez le frein).
  11. Décanter immédiatement le surnageant.
  12. Immédiatement remettre en suspension le culot avec une solution d'oeufs par pipetage.
  13. Remplir immédiatement tube conique avec une solution d'oeuf et bien mélanger en inversant 3-5 fois. Puis, aussitôt, tourner comme dans 2.10.
  14. Décanter immédiatement le surnageant.
  15. Remettre en suspension le culot dans du LB à la pipette, transférer dans un tube conique de 15 ml de granulation amélioré au cours des étapes de lavage. LB est la norme pour Steinernema spp. D'autres tampons (par exemple, un milieu minimal sels) peuvent être utilisés en fonction du nématode et la bactérie, en gardant à l'esprit la mémoire tampon ne doit pas nuire soit le nématode ou une bactérie.
  16. Remplir le tube avec LB et de spin que dans la version 2.10.
  17. Décanter le surnageant et remettre en suspension dans du LB.
  18. Rincer les nématodes un total de 3 fois en répétant 2,14 et 2,15.
  19. Diluer les œufs de nématodes re-suspendues à un volume approprié. Il devrait y avoir au moins 10 œufs par microlitre. Par exemple,gs peuvent être stockées dans une boîte de Petri 6-cm dans 5 ml de LB pendant au moins quatre jours par adjonction d'antibiotiques pour inhiber la croissance de bactéries colonisant les emballages dans la plaque de parafilm. Les œufs doivent être lavés une fois dans 15 ml de LB (comme dans 2.13 et 2.14) avant d'inoculer sur les pelouses bactériennes. Notez que les œufs éclosent pendant ce temps et ne peuvent pas être synchronisés de développement lorsqu'ils sont utilisés dans des essais de colonisation.

3. Co-culture avec des bactéries fluorescentes Assay

  1. Cultiver des bactéries fluorescentes jour au lendemain, la sélection pour le plasmide si nécessaire.
  2. Étaler 600 ul de la culture bactérienne sur des plaques de 10 mm lipidiques Agar avec un bâton stérile. Incuber à 25 ° C pendant 2 jours.
  3. Lieu 500-5000 œufs de nématodes axéniques sur un total de 100 à 400 pi (2.000 façon optimale les nématodes à 200 pi) sur chaque plaque de gélose lipides.
  4. Incuber dans l'obscurité sans humidité à 25 ° C jusqu'à ce que les JI, ou d'autres étapes de l'intérêt, de la forme. JI sera visible comme un fuzzy anneau blanc sur le bord de la plaque. Pour regarder les autres stades de vie, voir Protocole n ° 4.
  5. Placer les plaques dans un piège modifiée blanc 30. Retirez le couvercle de la plaque de gélose lipides et placez le bas dans le fond de quelque 100 vides mm x 20 mm boîte de Petri. Remplissez le grand plat de Pétri avec de l'eau ou autre tampon approprié à votre nématode, pour entourer la petite plaque. Le niveau de l'eau doit être d'environ la moitié de la hauteur de la plaquette.
  6. Incuber le piège à eau jusqu'à ce que les JI descendants ont vu le jour dans la mémoire tampon.
  7. Nématodes juvéniles infectieux peut être stockée dans l'eau dans un flacon de culture tissulaire.

4. Collection des premiers stades de vie pour le dépistage

  1. Utilisez les étapes 3.1 à 3.4 pour mettre en place le dosage.
  2. Incuber les plaques jusqu'à ce que les étapes de la vie souhaités sont présents. Daily inspection visuelle peut être nécessaire pour déterminer le moment. Pour inspecter les plaques, utilisez la procédure décrite dans le protocole 2.5. Pour S. carpocapsae X. nematophila sur des plaques de Los Angeles, les femelles gravides seront présents en 4-5 jours, les jeunes seront présents dans 7 jours, et les juvéniles infectieux commencent à être produites par 15-17 jours.
  3. Lorsque les étapes de la vie souhaités sont présents, de recueillir votre échantillon. Remplir un puits d'une plaque de 96 puits avec 200 pi de PBS ou un autre tampon approprié. Doucement gratter une partie du tapis bactérien qui contient les nématodes. Une noisette (~ 50 mg) fournira au moins plusieurs centaines de fois nématodes descendance F1 sont produites, mais plus peut être nécessaire pour les points de temps antérieurs. Placer le bâton dans la mémoire tampon et contenant.
  4. Incuber pendant 30 secondes à une minute. Retirer le bâton et racler le résidu restant. Utilisez le bâton pour enlever toute la gélose à partir du puits. Les nématodes doivent être visibles dans la zone tampon. Déplacez le mélange tampon dans un tube à centrifuger propre.
  5. Traiter les nématodes avec le lévamisole ou un autre agent paralysant. Dissoudre quelques grains de lévamisole dans 30 & mu, L d'eau. Ajouter 1-2 ul de ce mélange pour chaque 50 pi de l'échantillon. Après le traitement lévamisole les nématodes sera pas viable.
  6. Si les échantillons seront consultés à une date ultérieure, fixer comme décrit dans cette étape. Si non, passez à l'étape 4.6. Ajouter 200 ul de solution de fixateur contenant un tampon 1X et du paraformaldéhyde 4%. Mélanger doucement pipetage peut causer étapes de la vie délicats à lyser. Couvrir de papier aluminium et laisser incuber à température ambiante sur un agitateur à feu doux pendant au moins 18 heures.
  7. Placer les tubes dans un portoir, et permettre aux nématodes de se déposer au fond du tube.
  8. Rincer pour éliminer les nématodes arrière-plan. Pipeter l'excès de liquide et ajouter 200 à 500 pi de tampon et mélanger délicatement. Répéter. Ceci peut être répété plusieurs fois pour enlever plus de fond si désiré.
  9. Permettre aux nématodes de se déposer au fond du tube et remettre en suspension dans le volume désiré.
  10. Si les nématodes ne sont pas fixes, écran immédiatement. Nématodes fixes peuvent être stockés dans le réfrigérateur jusqu'àà deux semaines. A conserver dans l'obscurité.

5. Les nématodes dépistage de l'Association bactérienne par microscopie

  1. Sélectionnez certains nématodes à voir à la loupe par prélever un petit échantillon de votre mélange.
  2. Afin de s'assurer que les nématodes sont encore pour la photo, traiter avec un agent paralysant, comme décrit dans le protocole 4.5. Si vous ne prenez pas une image ou les nématodes sont déjà fixés, cette étape peut être sautée.
  3. Ajouter 20-30 ul de nématodes dans de l'eau à votre lame de microscope et placer une lamelle sur le dessus.
  4. Voir les nématodes entiers en utilisant la microscopie optique afin d'assurer les nématodes sont dans le champ de vision.
  5. Voir les nématodes à l'aide du paramètre fluorescent sur le microscope qui correspond à la fluorescence exprimée par les bactéries.
  6. Pour identifier la localisation bactérienne, prendre des photos du nématode en vertu ambiance lumineuse fluorescente, et un réglage de la microscopie optique, puis superposer les images. Les photos doivent être de la même field de vue. Il peut être nécessaire d'essayer plusieurs grossissements et les vues du nématode à trouver les bactéries.
  7. La distribution de la colonisation nématode peut être quantifiée en comptant une population de nématodes, marquant la présence ou l'absence de bactéries, et en calculant le pour cent colonisé. Nous vous recommandons de compter jusqu'à au moins 30 nématodes sein de la population sont comptés dans chaque catégorie (avec ou sans la colonisation) pour obtenir une valeur fiable.
  8. Lorsque seulement un peu de nématodes dans la population sont colonisés, il peut être nécessaire de compter plusieurs milliers de nématodes avant le 30 soient respectées. Pour haut débit comptage utilisez les étapes suivantes.
  9. Au lieu de compter les nématodes individuellement, aliquote de la population dans une plaque multi-puits (par exemple une plaque de 24 puits). Après les nématodes se sont installés au fond du plat, chaque puits peuvent être numérisés sur le microscope et le nombre de nématodes colonisés ne peut être marqué.
  10. Le nombre total de nématodes ipopulation na peuvent être identifiés par des dilutions en série de nématodes dans le puits. Par exemple, 1 ml de nématodes peuvent être ajoutés à un puits, on a bien mélangé par agitation avec une pointe de pipette, et 3 pi peuvent être retirés et comptés pour la quantification de la population totale dans le puits.
  11. Le pourcentage de nématodes colonisés peuvent être obtenus en divisant le nombre colonisé par le nombre total de nématodes dans le puits.

6. Les résultats représentatifs

Images au microscope Exemple de nématodes Steinernema associées à des bactéries Xenorhabdus sont présentés dans la figure 3. Pour créer l'image composite vu sur la figure 3A, une image à contraste de phase a été recouverte d'une image fluorescente. La flèche sur la figure 3A indique les bactéries présentes dans le nématode infectieux juvénile (barre = 100 um). Figure 3B a été construit d'une manière similaire et représente un nématode juvénile wie bactéries vertes protéines fluorescentes marquées (barres vertes) localisés à travers la lumière de nématodes intestinaux (barre = 20 mm). Une population de nématodes à partir de deux médias ont été comptés et a marqué à la colonisation par le symbiote bactérien (tableau 1). Pour des statistiques fiables, il est préférable de compter au moins 100 nématodes par échantillon avec au moins 30 correspondant à chaque catégorie. Comme on le voit dans le tableau 1, ces nématodes sont colonisés à un niveau d'environ 14,6% lorsqu'elle est cultivée sur gélose de lipides et 68,6% lorsqu'elle est cultivée sur gélose reins foie. Nématodes et d'autres espèces bactériennes ont été montré pour avoir différents niveaux de colonisation. Par exemple X. nematophila colonise 99% des S. juvéniles infestants carpocapsae (Martens 2003), et P. luminescens colonise 26% des H. juvéniles infestants bacteriophora (Ciche 2003).

Figure 1
Figure 1. Aperçu schématique de la méthode. A. La bactérie est conçu pour exprimer une protéine fluorescente. Œufs de nématodes sont isolés de B. nématodes adultes de produire des nématodes stériles. C. Les nématodes sont stériles co-cultivées avec des bactéries fluorescentes. D. Les étapes de la vie qui en résultent sont vu sous un microscope pour évaluer la présence de bactéries dans le nématode.

Figure 2
Figure 2. Représentation des femmes adultes contenant des oeufs. A. Le schéma montre l'aspect général des femmes Steinernema. En médaillon: l'image d'une CIVD S. feltiae femelle gravide. La flèche noire indique la vulve. Les flèches blanches indiquent les œufs visibles. L'image est à un grossissement de 20x, et la barre d'échelle représente 100 um. B. DIC image d'un point, mais non éclos S.feltiae œuf de nématode. L'image est un grossissement 40X, et la barre d'échelle représente 50 um. C. image DIC d'œufs isolée de S. feltiae nématodes sous un grossissement de 10X. La barre d'échelle est de 100 um.

Figure 3
Figure 3. Exemple d'images au microscope nématodes-bactéries association. A. S. nématodes puntauvense ont été associés à leur symbiote bactérien, X. bovienii, exprimant la GFP. L'image est une image composite produite par superposition d'une image de contraste de phase avec une image fluorescente du même champ de vision. La flèche indique le symbiote fluorescente bactérienne chez l'hôte des nématodes. La barre d'échelle représente 100 um. B. Cette image montre un S. carpocapsae nématodes juvéniles avec exprimant la GFP X. nematophila localisée dans l'intestin des nématodes.Cette image a été construit par superposition d'une image fluorescente sur une image au contraste d'interférence différentielle. La barre d'échelle représente 20 um.

Souche Nombre de nématodes Avec acteria Les nématodes total compté Pour cent des nématodes olonized
S. Agar lipides puntauvense 30 205 14,60%
S. Agar puntauvense Foie Reins 72 105 68,60%

Tableau 1. Exemple de notation d'une population de nématodes pour la présence de bactéries. Dans cette expérience, axénique S. puntauvense nématodes ont été cultivées avec leur exprimant la GFP symbiote sur différents milieux de culture (agar agar et des lipides du foie rein 32) pour tester les défauts de colonisation. Un total d'au moins un hundrenématodes d par échantillon ont été comptés et marqué pour la présence de bactéries. Pour la puissance statistique, trois expérimental identique doit être compté au moins 30 nématodes correspondant à chaque catégorie.

Tableau 2
Tableau 2. Plasmides contenant des protéines fluorescentes. Une liste des plasmides possibles pour l'insertion d'une protéine fluorescente dans le symbiote bactérien est donnée triées par nom de plasmide. D'autres informations sont incluses pour la protéine fluorescente codées, cassette d'antibiotique utilisé pour le maintien du plasmide, d'autres instructions pour l'utilisation, la source du plasmide. La concentration indiquées entre parenthèses est la concentration de l'antibiotique utilisé pour X. nematophila. Chacun de ces plasmides a été utilisé avec succès dans Xenorhabdus soit ou Photorhabdus. Des renseignements supplémentaires peuvent être obtenus à partir des citations relevées. Selonsur la bactérie testée, certains plasmides peuvent ne pas fonctionner sur la base de la protéine fluorescente, le choix des antibiotiques, site d'insertion, ou de l'origine de réplication. Les plasmides mentionnés ci-dessus présentent des caractéristiques différentes qui peuvent permettre l'utilisation de la bactérie d'intérêt. Par exemple, des mini-Tn7-KSGFP insère dans le site attTn7 du chromosome, tandis que les insertions dans le pECM20 X. nematophila chromosome par recombinaison homologue. Alternativement, les plasmides sont maintenus pPROBE extrachromosomique, et chaque pPROBE plasmide a le même squelette et fluorophore mais ont des marqueurs de sélection ou des origines de réplication afin de permettre leur utilisation dans une variété de milieux taxonomiques ou mutantes.

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Discussion

Le protocole décrit ici fournit une méthode pour la détection optique de bactéries dans un hôte de nématodes (Figure 1). Cette méthode tire avantage de la transparence optique des nématodes et la capacité de bactéries étiquettes par fluorescence, permettant l'analyse in vivo des bactéries à l'intérieur de l'hôte de nématodes (Figure 3). Plus précisément, cette approche identifie la localisation bactérienne au sein de son hôte. En comptant une population de nématodes et la notation de la présence de bactéries, la fréquence de la colonisation bactérienne sur les populations de nématodes peut être déterminé (tableau 1). Cette méthode est l'une des nombreuses techniques potentielles qui peuvent être utilisés pour étudier les interactions entre les hôtes des nématodes et des symbiotes bactériens. Méthodes associées ont été décrites précédemment pour isoler le symbiote bactérien, croissance axénique nématodes, et de manipuler les deux partenaires 25-27.

Le protocole décrit here a été développé dans le système Xenorhabdus nematophila-Steinernema carpocapsae modèle 14, et des approches similaires ont été utilisées dans d'autres nématodes entomopathogènes-bactériennes associations 9,15,17,18. Plusieurs conditions doivent être remplies afin d'appliquer cette méthode à d'autres nématodes-bactéries systèmes. Tout d'abord, le symbiote bactérien doit pouvoir être isolé de l'hôte et cultivé en culture de façon indépendante. Deuxièmement, le symbiote doit être en mesure de prendre l'ADN par transformation ou conjugaison afin d'introduire la protéine fluorescente. Troisièmement, pour les meilleurs résultats, le nématode doit avoir un stade qui peut être faite axénique et réintroduite pour les bactéries. Cependant, même si le nématode ne peut pas être isolé des bactéries, il peut toujours être possible de visualiser l'association: au lieu d'ajouter les œufs axéniques sur la pelouse de bactéries fluorescentes, ajouter une étape de la vie conventionnelle soulevées et procéder avec le protocole tel que décrit. Tous les résultats vont souffrir de la mise en garde èmeà des bactéries qui ne expriment la GFP sera en concurrence avec GFP-bactéries exprimant pour la localisation des tissus spécifiques de nématodes, et de ce fait, la colonisation ne doit pas être mesurée par comptage microscopique. Toutefois, à moins que les bactéries n'exprimant pas la GFP considérablement supplanter exprimant la GFP bactéries, les bactéries exprimant la GFP devrait se localisent dans les tissus de nématodes dans au moins quelques animaux de la population et de proposer des sites tissulaires importants pour la colonisation bactérienne. Une mise en garde de longue date de l'aide fluorescent souches exprimant des protéines est qu'elles peuvent coloniser un hôte avec une efficacité différente de celle d'une souche qui n'exprime pas les protéines fluorescentes (par exemple 12).

Les étapes décrites dans ce protocole peut exiger d'optimisation en fonction du nématode et espèces bactériennes qui sont utilisés. Pour la conjugaison de la bactérie certaines conditions qui peuvent être modifiés sont la longueur et la température de croissance, le rapport du donneur au receveur et plasmaIdentifiant utilisé. Des exemples de plasmides pertinentes sont énumérées dans le tableau 2. Tous ces plasmides ont été utilisés avec succès dans une bactérie ou Xenorhabdus Photorhabdus en association avec leur hôte des nématodes 14,17,20,24,33-35. Pour assurer le maintien stable de la protéine fluorescente pendant la colonisation des nématodes, il est préférable d'utiliser un plasmide qui permet d'insérer dans le chromosome de la bactérie cible. En outre, certaines bactéries peuvent pas prendre ces plasmides. Par exemple, pECM20 n'a été utilisé que dans X. nemtaophila et très étroitement liée souches bactériennes 14, car cela inserts plasmide dans le chromosome en utilisant une région homologue entre le plasmide et le chromosome du plasmide; n'insère pas si la bactérie cible ne dispose pas de cette région. Pour utiliser ce plasmide pour d'autres bactéries, l'X. nematophila-région spécifique doit être substitué par une région génomique de la bactérie cible. Certains régimes plasmide de transformation sera également rEquire certaines modifications du protocole 1. Par exemple, un mini-Tn 7-KSGFP et pBK-miniTn 7-ΩGm-DsRed besoin d'un plasmide auxiliaire gènes contenant de transposition (tsnABCDE) 33,35,36 à insérer dans le chromosome bactérien. La conjugaison est plus efficace avec les 7-Tn base de plasmides, lorsque 2-heure cultures (~ 600 DO de 0,3 à 0,4) sont mélangés dans des proportions égales.

Après conjugaison réussie, il est important d'utiliser les bons plaques sélectives correspondant au plasmide utilisé. Les plaques sélectives devrait contenir l'antibiotique codé sur le plasmide de sélectionner la présence du plasmide chez le receveur et une contre-sélection contre les souches donneuses et auxiliaire. Par exemple, lorsque la conjugaison pECM20 dans X. nematophila la contre-sélection utilisé est l'ampicilline en raison X. nematophila est résistant à l'ampicilline et la souche donneuse est l'ampicilline sensibles. Si antibiotique contre-sélection n'est pas disponible en ynotre système, un acide diaminopimélique (DAP) exiger des bailleurs de fonds peuvent être utilisés. Pour grandir DAP-souches exigeant, le DAP est ajouté au milieu de culture solides et liquides pendant les étapes de pré-conjugaison et la conjugaison, et omis lors de la contre-sélection étapes. Lorsque DAP est absent de la souche donneuse ne poussent pas et est efficace contre-sélectionné.

Pour assurer l'isolation oeuf réussie, il est essentiel de vérifier avec précision la production d'œufs (Figure 2). Au moment de l'isolement, nématodes femelles doivent être remplis d'œufs et des œufs doivent être visibles dans les médias (figure 2A). Si nématodes femelles produisent des œufs fécondés au moins quelques oeufs surnageant aura visiblement développé comme les nématodes non éclos (figure 2B). Pour S. carpocapsae, les oeufs vont changer de forme sphérique ou légèrement oblongue avant d'élaborer les nématodes et les couver. Le moment ou les conditions de la croissance des nématodes peuvent également avoir besoin d'être modifié pour optimiser œuf fécondéproduire, y compris le raccourcissement ou l'allongement de la période de temps avant la récolte des oeufs, ou en utilisant un autre support approprié pour les espèces de nématodes spécifiques. À la fin de l'isolation, les oeufs doivent être bien visibles à l'intérieur de la mémoire tampon (figure 2C). Paramètres dans le protocole d'isolement œuf qui peut nécessiter l'optimisation inclure des concentrations de blanchiment et KOH dans la solution d'oeuf, le temps d'incubation dans une solution d'oeuf, ou la vitesse de centrifugation. Si l'isolement œufs produisent des œufs mais pas de nématodes se développent pendant la co-culture, il est possible que les œufs isolés ne sont pas viables. Pour vérifier la viabilité, laisser les œufs isolés dans un tampon et d'attendre que les nématodes à éclore. Les oeufs devraient éclore dans un ou deux jours d'isolement, puis les nématodes juvéniles peuvent être utilisés dans le test de co-culture. Si les œufs éclosent, mais ne développent pas pendant le test de co-culture, il peut être nécessaire de modifier les conditions de croissance ou support utilisé pour la co-culture. Nous notons que studie précédentes ont isolé des bactéries sans les nématodes en trempant les nématodes dans un cocktail d'antibiotiques (par exemple 3,37). L'approche que nous décrivons ici est exempt de quelques-unes des mises en garde de trempage antibiotique, y compris des complications avec l'utilisation d'antibiotiques bactériostatiques, résistants aux antibiotiques des bactéries contaminantes, et les effets des antibiotiques sur les nématodes. Certains stades de nématodes peuvent également être résistantes aux antibiotiques et de conserver leurs symbiotes bactériens 3. Enfin, nous notons que pour la microscopie, la concentration du lévamisole nécessaire pour l'immobilisation des nématodes peut varier en fonction de nématodes clades différents.

Une fois que cette méthode a été établie dans le système d'intérêt, il est possible de modifier la technique pour obtenir plus d'informations. En regardant les points plus tôt dans le cycle de vie des nématodes (protocole 4), on peut être en mesure d'identifier comment la bactérie et le nématode à lancer leur association 14,16. En outre, cette approche peut être utilisée to la tenue d'un haut débit écrans mutantes pour identifier les facteurs bactériens impliqués dans la symbiose, en utilisant la fluorescence pour détecter la colonisation 17,18. D'autres méthodes telles que la mutagenèse signature marqués nécessitent l'utilisation de sondes marquées radioactivement et prennent plus de temps 22,28. Par conséquent, l'utilisation de la microscopie à fluorescence pour la visualisation symbiote bactérien chez les nématodes est un outil de contrôle efficace et efficient pour l'étude des interactions bactériennes avec un hôte de nématodes.

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Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier Eugenio Vivas, Kurt Heungens, Eric Martens, Charles Cowles, Darby sucre, Eric Stabb, et Todd Ciche pour leurs contributions à l'élaboration de ce protocole et les outils utilisés. KEM et JMC ont été pris en charge par National Institutes of Health (NIH) Prix National Research Service T32 (AI55397 "Microbes en matière de santé et de la maladie"). JMC a été soutenue par un National Science Foundation (NSF) Bourse de recherche doctorale. Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Science Foundation (IOS-0920631-0950873 et IOS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lipid Agar
(sterile)		 8 grams nutrient broth, 15 grams agar, 5 grams yeast extract, 890 ml water, 10 ml 0.2 g/ml MgCl2. 6H20, 96 ml corn syrup solution*, 4 ml corn oil*
Stir media while pouring plates
*add sterile ingredient after autoclaving
Corn Syrup Solution
(sterile)		 7 ml corn syrup, 89 ml water
mix and autoclave
Egg Solution 16.6 ml 12% sodium hypochlorite, 5 ml 5M KOH, 80 ml water
Lysogeny Broth
(sterile)		 5 grams yeast extract, 10 grams tryptone, 5 grams salt, 1 L water
mix and autoclave
Microfuge Fisher 13-100-675 Any microfuge that holds microfuge tubes will work
Centrifuge Beckman 366802 Large table top centrifuge that holds 15 ml and 50 ml conical tubes
Sterile 60 mm X 15 mm Petri Dish Fisher 0875713
50 ml centrifuge tubes Fisher 05-539-6
15 ml centrifuge tubes Fisher 05-531-6
Sterile 100 mm X 20 mm Petri Dish Fisher 0875711Z Deeper than standard Petri dishes
24-well plate Greiner Bio-One 662000-06
Microscope The microscope needs florescent capabilities compatible with your fluorophore
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
PBS
(sterile)		 8 g NaCL
0.2 g KCL
1.44 g Na2HPO4
0.24 g KH2PO4
1 L water

Adjust to a pH of 7.4 and water to 1 L and autoclave
Microfuge tubes Fisher 05-408-138 2 ml or 1.5 ml tubes
Shaker Any shaker that causes the liquid to gently move will work
Diaminopimelic acid Sigma D-1377 If needed, supplement media to a concentration or 1 mM

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References

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Visualisation des bactéries dans nématodes en utilisant la microscopie à fluorescence
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Murfin, K. E., Chaston, J.,… More

Murfin, K. E., Chaston, J., Goodrich-Blair, H. Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy. J. Vis. Exp. (68), e4298, doi:10.3791/4298 (2012).

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