Summary
כדי ללמוד את ההדדיות בין
Abstract
Symbioses, החיים משותפים של שניים או יותר אורגניזמים, הם נפוצים לאורך כל ממלכות חיים. כשתיים מכל מקום אורגניזמים ביותר על פני אדמה, נמטודות וחיידקים יוצרים מגוון רחב של עמותות סימביוטיים שנע בין מועיל לפתוגניים 1-3. עמותה אחת כזו היא מערכת היחסים הדדיים המועילה בין חיידקי Xenorhabdus ונמטודות Steinernema, שהתפתחה כמערכת מודל של סימביוזה 4. נמטודות Steinernema היא entomopathogenic, באמצעות חיידקי סימביונט להרוג חרקים 5. להעברה בין מארחי חרקים, החיידקים להתנחל המעי של שלב נעורי התולעת של נמטודות 6-8. לאחרונה, כמה מינים נמטודות אחרים הוכחו לנצל חיידקים להדברת חרקים 9-13, וחקירות שהחלו לבחון את יחסי הגומלין בין נמטודות והחיידקים במערכות אלה <sup> 9.
אנו מתארים שיטה להדמיה של סימביונט חיידקים בתוך או על מארח נמטודות, מנצלים את השקיפות האופטית של נמטודות כאשר נצפו על ידי מיקרוסקופ. את החיידקים שהונדסו חלבון פלואורסצנטי, המאפשר ההדמיה שלהם על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. פלסמידים רבים זמינים שנושאים גני מקודדי חלבונים כי לזרוח באורכי גל שונים (כלומר ירוק או אדום), וצמיד של פלסמידים מזן חיידקי Escherichia תורם לסימביונט חיידקי נמען היא מוצלחת למגוון רחב של חיידקים. בשיטות המתוארות פותחו כדי לחקור את הקשר בין Steinernema carpocapsae וXenorhabdus nematophila 14. שיטות דומות שמשו כדי לחקור עמותות אחרות נמטודות-חיידק 9, 15-18 והגישה לכן היא באופן כללי.
נפגשהוד מאפשר אפיון של נוכחות ולוקליזציה חיידקים בתוך נמטודות בשלבים שונים של פיתוח, לספק תובנה על טבעה של העמותה והתהליך של קולוניזציה 14, 16, 19. ניתוח מיקרוסקופי מגלה שכיחות הקולוניזציה בתוך אוכלוסייה ולוקליזציה של חיידקים לארח רקמות 14, 16, 19-21. זה יתרון על פני שיטות אחרות לניטור חיידקים בתוך אוכלוסיות נמטודות, כגון sonication 22 או טחינת 23, אשר יכול לספק רמות ממוצעות של התישבות, אבל לא יכול, למשל, להפלות אוכלוסיות עם שכיחות גבוהה של עומסי סימביונט נמוכים מאוכלוסיות עם תדירות נמוכה של עומסי סימביונט גבוהים. להפלות את התדירות והעומס של חיידקים מיישבים יכול להיות חשוב במיוחד כאשר הקרנה או אפיון מוטציות חיידקים לפנוטיפים קולוניזציה 21, 24. אכן, מיקרוסקופ פלואורסצנטי נעשה שימוש בהקרנת תפוקה גבוהה של מוטציות חיידקים לפגמים ב17 קולוניזציה, 18, והוא פחות מייגע מאשר שיטות אחרות, כולל sonication 22, 25-27 ונתיחת פרט נמטודות 28, 29.
Protocol
1. בנייה של זן חיידקי פלורסנט באמצעות צימוד
- לגדול מתח הנמען (סימביונט להיבחן) ומתח תורם בן לילה. המתח התורם, בדרך כלל חיידקי Escherichia, צריך להיות מסוגל לתרום דנ"א באמצעות נטייה ויש לשנותה עם פלסמיד (טבלה 2) שנושא את גן מקודד חלבון פלואורסצנטי. בהתאם לפלסמיד, מתח עוזר נטייה עשוי להיות גם נדרש. אם כך, זן זה צריך להיות גם גדל בן לילה. המתח התורם ועוזר המתח צריך להיות מבוגר עם אנטיביוטיקה כדי לבחור לאחזקה של פלסמיד.
- תת התורם, עוזר, וזני נמען לתקשורת צמיחה העשירה ברכיבים המזינה חסרת אנטיביוטיקה ביחס 1:100 של התרבות עד בינוני.
- לגדל את התרבויות בטמפרטורה המתאימה לכל מאמץ עד שהם מגיעים לשלב צמיחת אמצע יומן (OD 600 ~ 0.6). לXenorhabdus וא חיידק זה שלב של לגדולה הגיעה לכ 3-4 שעות לאחר subculturing. זה עשוי להשתנות בהתאם לעומס, או במקרים מסוימים פלסמיד, בשימוש.
- מערבב את הזנים בצינור microcentrifuge וצנטריפוגה עבור 2 דקות ב17900 XG (13,000 סל"ד ברוב microfuges). חלקם של תורם ומקבל שמניב תוצאות הטובות ביותר ישתנה לשילובים שונים, וייתכן ויש לקבוע באופן אמפירי. לXenorhabdus נמען וא תורם coli, אנו משתמשים 03:01 או ביחס 1:1. אם מתח עוזר נחוץ (E. coli, למשל), יש להוסיף באותו היחס כמו לתורם.
- למזוג supernatant.
- Re-להשעות את התא גלול ב 30 μl של מדיה חדשה.
- ספוט ההשעיה על גבי צלחת מדיה עשירה מזין ללא אנטיביוטיקה, ולאפשר המקום לייבוש.
- דגירה את הצלחת, הפוכה, בלילה בטמפרטורה אופטימלית לחיידק הנמען ומותר לתורם (ועוזר, אם רלוונטי). הצלחת צריכהלהיות מודגרות לפחות 18 שעות.
- לגרד את הכתם והקו למושבות בודדות על צלחת אנטיביוטיקה סלקטיבית. האנטיביוטיקה צריכה לבחור נגד התורם ומקבל המכיל את הפלסמיד. אחד או שניים פסי בידוד נוספים עשויים להיות נחוצים כדי לבודד תרבות טהורה.
- ודא מושבות התוצאה הן סימביונט הנמען, ולא בלחץ התורם, על ידי הקרנה לנוכחות של פנוטיפים ספציפיים נמען, כגון מורפולוגיה מושבה, או גילוי תגובת שרשרת פולימרז של גני נמען ספציפיים. מסך המושבות לנוכחותו של פלסמיד ידי תגובת שרשרת פולימרז של רצף הפלסמיד ידוע וקרינה. המושבות צריכות לזרוח תחת אורך הגל המתאים לחלבון פלואורסצנטי הנכון.
2. ייצור של ביצי נמטודות Axenic
- לגדול 5 מ"ל של סימביונט החיידקים הטבעיים בן לילה. כדי להתחיל תרבות, חיידקים עשויים להיות מחוסנים לLysogeny מרק (LB) או מ"ק אחרתקשורת lture ישירות ממניות או ממקפיא צלחת פס.
- מורח 600 μl של תרבות החיידקים על גבי צלחות אגרו 10 ליפידים מ"מ (לוס אנג'לס) 29. שמונה עד עשר צלחות תנבנה מספיק נמטודות עבור רוב המינים.
- דגירה בחושך ללא לחות ב 25 מעלות צלזיוס במשך ימים.
- הוסף 5000 נמטודות זיהומיות נוער, או בשלבים אחרים, בהתאם לנמטודות בשימוש, ב500 μl של תקשורת למדשאות חיידקיים. דגירת הצלחות ב 25 ° C במשך 3 ימים.
- בדקו את הצלחת שלו לנוכחות של נמטודות וביצים הבוגרות. הנח 20 μl מים לשקופית מיקרוסקופ. בעזרת מקל סטרילי לגרד מעלה כמות קטנה של נמטודות מהדשא בקטריאלי. הנח את המקל לתוך המים ולאפשר לנמטודות לשחות כבויה. יראה השקופית בהגדלה נמוכה. לקבלת מידע נוסף על מראה לראות את הדיון והאיור 2.
- אם ביצים ונקבות נראות לעין, תמשיך, אחרת דגירת הצלחות ב 25 & dלדוגמה: C ולבדוק להתפתחות תקינה בכל 6-12 שעות. כאשר נקבות מכילות ביצים, הנח כמה מ"ל של מים על פני השטח של הצלחות. ערבלו בעדינות את הצלחות ולשפוך את המים לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל. נמטודות צריכות לבוא מן הצלחות וכבר לא תהיינה גלוי על פני שטח הצלחת. כמה שטיפות עשויות להיות נחוצות.
- לאפשר לנמטודות להתיישב לתחתית של התחתית.
- שטוף נמטודות. פיפטה את עודפי מים מהחלק העליון של הצינור. למלא במים נקיים ולאפשר נמטודות המבוגרת להתיישב. פיפטה את המים העודפים.
- מלא את צינורות חרוטים עם פתרון ביצה. ברגע שפתרון הביצית הוסיף העיתוי של כל שלבי פתרון עם ביצה חייב להמשיך בדיוק כפי שתאר לתשואה מרבית ביצה. דגירת הצינורות תוך עדינות רועדת לבדיוק 10 דקות. רוב נמטודות צריכה להיות מומסת עד סוף הדגירה.
- מייד סרכזת צינורות החרוטים ב1250 XG לבדיוק 10 דקות (כולל הבאת צנטריפוגה עד מהירותאבל לא עד 0 x גרם. השתמש בבלמים).
- מייד למזוג supernatant.
- מייד מחדש להשעות את הגלולה עם ביצת פתרון על ידי pipetting.
- מייד למלא צינור חרוטים עם פתרון ביצה ומערבבת היטב על ידי 3-5 פעמי היפוך. אחר כך להסתובב באופן מיידי כמו ב2.10.
- מייד למזוג supernatant.
- Re-להשעות הגלולה בLB ידי pipetting, העברה לצינור חרוטים 15 מ"ל לpelleting המשופר במהלך שלבי שטיפה. LB הוא סטנדרטי לSteinernema spp. חוצצים אחרים (למשל בינוני מלחים מינימאליים) ניתן להשתמש בהתאם לנמטודות והחיידק, תוך התחשבות החיץ אסור לפגוע באף נמטודות או החיידק.
- מלא את הצינור עם LB וספין כמו ב2.10.
- למזוג supernatant, מחדש להשעות בLB.
- יש לשטוף את נמטודות כוללות של 3 פעמים על ידי חזרה על 2.14 ו -2.15.
- לדלל את הביצים נמטודות מחדש מושעות לנפח מתאים. לא צריך להיות לפחות 10 ביצים לכל microliter. לדוגמהgs ניתן לאחסן בצלחת פטרי 6-סנטימטר בLB 5 מ"ל במשך לפחות ארבעה ימים על ידי הוספת אנטיביוטיקה שמעכבת את הצמיחה של חיידקים מיישבים ועוטף את הצלחת בparafilm. את הביצים צריכות להיות כובסו פעם בLB 15 מ"ל (כמו ב2.13 ו2.14) לפני inoculating על מדשאות חיידקיים. שים לב שהביצים תבקענה בזמן זה ולא יכולה להיות מסונכרן התפתחותית בעת שימוש במבחני קולוניזציה.
3. Assay שיתוף עם חיידקי טיפוח פלורסנט
- לגדול חיידקי ניאון לילה, בחירה לפלסמיד במידת צורך.
- מורח 600 μl של תרבות החיידקים על 10 צלחות אגרו ליפידים מ"מ עם מקל סטרילי. לדגור על 25 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים.
- מקום 500-5,000 ביצים נמטודות axenic בסך של 100-400 μl (אופטימלי 2000 נמטודות ב200 μl) על כל צלחת אגרה שומנים בדם.
- דגירה בחושך ללא לחות ב 25 ° C עד IJs, או בשלבים אחרים של עניין, טופס. IJs יהיה גלוי כפוטבעת לבנה zzy על קצה הצלחת. להסתכל על שלבי חיים אחרים, ראה פרוטוקול 4.
- מקם את הצלחות במלכודת שונה לבנה 30. הסר את המכסה של הצלחת אגרה שומנים ולמקם את התחתית לתחתית של 100 מ"מ ריק x 20 מ"מ צלחת פטרי. מלא את צלחת פטרי הגדולה עם מים, או בולם מתאים לנמטודות שנייה, כדי להקיף את הצלחת הקטנה. מפלס המים צריך להיות כמחצית מגובו של הצלחת הקטנה.
- דגירת מלכודת המים עד IJs צאצאים צמח למאגר.
- נמטודות נוער זיהומיים ניתן לאחסן מים בבקבוק תרבית רקמה.
4. אוסף משלבי חיים מוקדמים להקרנה
- השתמש בשלבים 3.1 עד 3.4 להגדיר את assay.
- דגירת הצלחות עד לשלבי החיים הרצויים נמצאים. בדיקה חזותית יומית עשויה להיות נחוצה כדי לקבוע עיתוי. כדי לבדוק את הצלחות, השתמש בהליך המתואר בפרוטוקול 2.5. בשביל ש ' carpocapsae X. nematophila על צלחות LA, נשים הרות תהיינה נוכחות ב4-5 ימים, בני הנוער יהיו נוכחים ב7 ימים, ובני נוער זיהומיות יתחילו להיות מיוצרים על ידי 15-17 ימים.
- כאשר שלבי החיים הרצויים נמצאים, לאסוף המדגם שלך. מלא גם מצלחת גם 96 עם 200 μl של PBS או הבולם מתאים אחרים. עדינות לגרד מעליו קצת דשא החיידקים המכיל נמטודות. כמות גודלה כגודל אפון (~ 50 מ"ג) תספק לפחות כמה מאה נמטודות פעם צאצאי F1 מיוצרים, אבל יותר עשויה להיות נחוץ לנקודתי זמן קודמות. הנח את המקל למאגר גם מכיל.
- דגירה למשך 30 שניות עד דקה. מוציא את המקל ומגרד את השאריות שנותרו. השתמש במקל כדי להסיר כל אגר מהבאר. נמטודות צריכות להיות גלויות בתוך המאגר. העבר את התערובת לחיץ צינור microfuge נקי.
- פנק את נמטודות עם levamisole או סוכן משתק אחר. לפזר כמה גרגרים של levamisole ל30 & mu; ליטר המים. הוסף 1-2 μl תמהיל זה עבור כל 50 μl של מדגם. לאחר טיפול levamisole את נמטודות תהיינה בלתי כדאיות מבחינה כלכלית.
- אם תהיינה לצפות דגימות במועד מאוחר יותר, לתקן כמתואר בשלב זה. אם לא, דלג לשלב 4.6. הוסף 200 μl של פתרון מקבע המכיל 1X חיץ ו4% paraformaldehyde. מערבב בעדינות, pipetting עלול לגרום שלבי חיים עדינים לlyse. מכסים בנייר כסף, והדגירה בטמפרטורת חדר שבייקר על נמוך במשך לפחות 18 שעות.
- מניח את הצינורות במעמד צינור, ולאפשר לנמטודות להתיישב לתחתית של התחתית.
- שטוף נמטודות להסיר רקע. פיפטה את הנוזל עודף ולהוסיף 200-500 μl של חיץ ועדינות לערבב. חזור. זה עשוי לחזור כמה פעמים כדי להסיר יותר רקע אם רוצה.
- לאפשר לנמטודות להתיישב לתחתית של תחתית ומחדש להשעות בעצמה הרצויה.
- אם נמטודות אינה קבועה, מסך באופן מיידי. נמטודות קבועות עשויות להיות מאוחסנות במקרר עדלשבועות. אחסן בחושך.
5. נמטודות הקרנה לאיגוד על ידי חיידקים מיקרוסקופים
- בחר כמה נמטודות כדי להציג תחת המיקרוסקופ על ידי הסרת דגימה קטנה של התערובת שלך.
- כדי להבטיח שנמטודות עדיין לתמונה, לטפל עם סוכן משותק כמתואר בפרוטוקול 4.5. אם אתה לא לוקח את תמונה או את נמטודות כבר קבועות, בשלב זה ניתן לדלג עליו.
- הוסף 20-30 μl של נמטודות במים לשקופית מיקרוסקופ ואת מקום coverslip על גבי.
- צפה בנמטודות השלמה באמצעות מיקרוסקופ אור כדי להבטיח נמטודות היא בשדה הראייה.
- צפה בנמטודות באמצעות הגדרת הניאון במיקרוסקופ שמתאים לקרינה שהביעה על ידי החיידקים.
- כדי לזהות לוקליזציה חיידקים, לקחת תמונות של נמטודות תחת הגדרת ניאון והגדרת מיקרוסקופ אור, ולאחר מכן להרכיב את התמונות. את התמונות צריכות להיות מאותו להרגיש אתד של נוף. ייתכן שיהיה צורך לנסות כמה הגדלה ונופים של נמטודות למצוא את החיידקים.
- ההפצה של הקולוניזציה נמטודות ניתן לכמת על ידי ספירת אוכלוסייה של נמטודות, בקיע לנוכחות או עדר של חיידקים, וחישוב האחוזים קולוניאליים. אנו ממליצים לספור לפחות עד 30 נמטודות בתוך האוכלוסייה נספרת בכל קטגוריה (עם או בלי קולוניזציה) כדי לקבל ערך אמין.
- כאשר רק מספר נמטודות באוכלוסייה הם התנחלו, זה עשוי להיות נחוץ כדי לספור כמה אלף נמטודות לפני 30 הם נצפו. לספירת תפוקה גבוהה להשתמש בשלבים הבאים.
- במקום לספור נמטודות בנפרד, aliquot האוכלוסייה לתוך צלחת רבה גם (למשל צלחת 24 היטב). לאחר נמטודות התיישבה לתחתית הצלחת, כל אחד גם ניתן לסרוק במיקרוסקופ ומספר נמטודות יישבו יכול להיות בקיע.
- המספר הכולל של נמטודותאוכלוסיית na ניתן לזהות על ידי דילולים סידוריים של נמטודות בבאר. לדוגמה, 1 מ"ל של נמטודות ניתן להוסיף גם, מעורב היטב על ידי ערבוב עם טיפ pipet, ו 3 μl ניתן להסיר וספרתי לכימות של כלל האוכלוסייה בבאר.
- אחוז נמטודות יישבה ניתן להשיג על ידי חלוקת המספר מאוכלס על ידי המספר הכולל של נמטודות בבאר.
6. נציג תוצאות
תמונות מיקרוסקופ דוגמה של נמטודות Steinernema קשורים חיידקי Xenorhabdus מוצגות באיור 3. כדי ליצור תמונה המורכבת לראות באיור 3 א, תמונה לעומת שלב כוסתה בתמונת ניאון. החץ באיור 3A מציין את חיידקי נוכח בתוך נמטודות נוער התולעת (הבר = 100 מיקרומטר). 3B האיור נבנה בצורה דומה ומתאר נמטודות wi נוערחיידקי ה ירוקים ניאון חלבון שכותרת (מוטות ירוקות) מקומיים לאורך לום המעיים נמטודות (הבר = 20 מיקרומטר). אוכלוסייה של נמטודות משתי אמצעי תקשורת נספרה ובקיע להתישבות על ידי חיידקי סימביונט (טבלה 1). לקבלת נתונים סטטיסטיים חזקים, עדיף לספור לפחות 100 נמטודות לדגימה עם לפחות 30 נופלים בכל קטגוריה. כפי שניתן לראות בטבלת 1, נמטודות אלה התנחלו ברמה של כ -14.6%, כאשר גדלו על אגר ושומנים 68.6% כאשר גדלו על אגר כליות כבד. נמטודות אחרות ומיני חיידקים הוכחו יש רמות שונות של התישבות. לדוגמא X. nematophila מאכלס 99% מס קטיני carpocapsae זיהומיות (מרטנס 2003), ופ luminescens מאכלס 26% מח קטיני זיהומיות bacteriophora (Ciche 2003).
איור 1. מתווה סכמטי של השיטה. א החיידק שהונדס חלבון פלואורסצנטי. ביצי נמטודות B. מבודדים מנמטודות בוגרות כדי לייצר נמטודות סטריליים. ג נמטודות סטריליים הם שיתוף טפח-עם חיידקי הניאון. ד שלבי חי כתוצאה מכך הם מוצגים תחת מיקרוסקופ להעריך נוכחות חיידקים בתוך נמטודות.
איור 2. תיאור של נשים בוגרות המכילות ביצים. א סכמטי מציג את המראה הכללי של נקבות Steinernema. תמונת דסק ס: הבלעה feltiae כרס נשי. החץ השחור מצביע על הפות. חצים לבנים להראות ביצים נראות לעין. תמונה היא בהגדלת 20X, וסרגל קנה המידה מייצג 100 מיקרומטר. תמונה ב דסק מפותח אבל עדיין לא בקע סfeltiae ביצת נמטודות. תמונה היא גדלת 40X, וסרגל קנה המידה מייצג 50 מיקרומטר. תמונת דסק"ש ג ביצים מבודדת מס feltiae נמטודות בהגדלת 10X. סרגל קנה מידה הוא 100 מיקרומטר.
איור 3. תמונות מיקרוסקופ דוגמה של עמותת נמטודות בקטריאלי. א 'ס' נמטודות puntauvense היו קשורות עם סימביונט חיידקיהם, X. bovienii, GFP להביע. התמונה היא תמונה מורכבת מיוצרת על ידי כיסה תמונה לעומת שלב עם תמונת ניאון מאותו שדה הראייה. החץ מציין סימביונט חיידקי הניאון בתוך פונדקאי נמטודות. סרגל קנה מידה מייצג 100 מיקרומטר. ב תמונה זו מראה ס נמטודות נוער carpocapsae עם X. GFP מבטא nematophila מקומי בתוך מעי נמטודות.תמונה זו נבנתה דרך כיסה תמונת ניאון מעל תמונה לעומת פער התערבות. סרגל קנה המידה מייצג 20 מיקרומטר.
| להתאמץ | מספר נמטודות עם acteria | סכה נמטודות נספרת | אחוז מנמטודות olonized |
| אגר שומני puntauvense ס | 30 | 205 | 14.60% |
| אגר כליות כבדות puntauvense ס | 72 | 105 | 68.60% |
טבלת 1. ניקוד דוגמה לאוכלוסיית נמטודות לנוכחות חיידקים. בניסוי זה, axenic ס נמטודות puntauvense גדלו עם סימביונט GFP מבטא בתקשורת צמיחה השונה (אגר אגרו שומנים וכליות הכבד 32) לבדיקת ליקויי קולוניזציה. כולל של hundre אחד לפחותנמטודות ד לדגימה נספרו והבקיע לנוכחות של חיידקים. לכוח סטטיסטי, שלוש ניסיוניים משכפל יש למנות עם לפחות 30 נמטודות נופלת בכל קטגוריה.
טבלה 2. פלסמידים המכילים חלבון פלורסנט. רשימה של פלסמידים פוטנציאליים להחדרה של חלבון פלואורסצנטי לתוך סימביונט החיידקים ניתנים מופיעה בשמו של פלסמיד. מידע אחר הכלולים הוא החלבון מקודדת קלטת הניאון, אנטיביוטיקה המשמשת לתחזוקת פלסמיד, הוראות אחרות לשימוש, המקור לפלסמיד. הריכוז שצוין בסוגריים הוא הריכוז של האנטיביוטיקה המשמשת לX. nematophila. כל פלסמידים אלו שמש בהצלחה בשנייה Xenorhabdus או Photorhabdus. מידע נוסף ניתן לקבל את הציטוטים האמורים. בהתאםעל החיידק הנבדק, כמה פלסמידים לא יכולים לעבוד על בסיס החלבון פלואורסצנטי, בחירת אנטיביוטיקה, אתר הכנסה, או מוצא של שכפול. את פלסמידים המפורטים לעיל מכילים תכונות שונות שעשויות לאפשר שימוש בחיידק של עניין. לדוגמה, מוסיף מיני Tn7-KSGFP לattTn7 האתר של כרומוזום, בעוד pECM20 מחדיר לתוך X. כרומוזום nematophila ידי הומולוגי רקומבינציה. לחלופין, פלסמידים pPROBE נשמרים extrachromosomally, וכל pPROBE פלסמיד יש את אותו עמוד שדר וfluorophore אבל יש סמנים שונים לבחירה או למוצא של שכפול כדי לאפשר את השימוש בם במגוון הטקסונומי או רקע מוטציה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מספק שיטה לזיהוי האופטי של חיידקים בתוך מארח נמטודות (איור 1). שיטה זו מנצלת את השקיפות האופטית של נמטודות ויכולת fluorescently חיידקי תווית, מה שמאפשר בניתוח vivo של חיידקים בתוך פונדקאי נמטודות (איור 3). באופן ספציפי, גישה זו מזהה לוקליזציה חיידקים בתוך המארח שלו. על ידי ספירת אוכלוסיית נמטודות וניקוד לנוכחות חיידקים, התדירות של התישבות חיידקים על פני אוכלוסיית נמטודות ניתן לקבוע (טבלה 1). שיטה זו היא אחת מטכניקות פוטנציאליות רבות שיכולים להיות מנוצלות ללימוד האינטראקציות בין מארחים נמטודות וsymbionts חיידקיים. שיטות קשורות כבר תאר בעבר כדי לבודד סימביונט החיידקים, נמטודות axenically לגדול, ולטפל גם שותפי 25-27.
הפרוטוקול מתואר חere פותח במערכת Xenorhabdus nematophila-Steinernema carpocapsae מודל 14, וגישות דומות היו בשימוש בעמותות אחרות entomopathogenic נמטודות בקטריאלי 9,15,17,18. מספר תנאים חייבים להתקיים על מנת ליישם את השיטה במערכות נמטודות-חיידקים אחרות. ראשית, סימביונט החיידקים חייב להיות מסוגל להיות מבודד מהמארח וגדל באופן עצמאי בתחום התרבות. שנית, סימביונט חייב להיות מסוגל לקחת את הדנ"א דרך שינוי או נטייה כדי להציג את חלבון פלואורסצנטי. שלישית, לתוצאות הטובות ביותר, נמטודות חייבים להיות שלב שניתן לעשות axenic והחזיר לחיידקים. עם זאת, גם אם נמטודות אינה יכולה להיות מבודדת מהחיידקים זה עדיין עשוי להיות אפשרי כדי להמחיש את הקשר: במקום הוספת ביצי axenic לדשא של חיידקי ניאון, להוסיף שלב בחיים גדל באופן קונבנציונלי ולהמשיך בפרוטוקול כמתואר. תוצאות תסבולנה מה האזהרהבחיידקים שאינם מפורש GFP יתחרה עם חיידקים המבטאים GFP-ללוקליזציה לרקמות ספציפיות נמטודות, ובגלל זה, קולוניזציה לא צריכה להיות נמדד על ידי ספירה מיקרוסקופית. עם זאת, אלא אם כן את החיידקים שלא מבטאים GFP דרסטי outcompete GFP-להביע חיידקים, GFP-לבטא חיידקים צריכים למקם לרקמות נמטודות לפחות בבעלי חיים מסוימים באוכלוסייה ולהציע אתרי רקמות חשובים להתישבות חיידקים. אזהרה ארוכת שנים של שימוש בזנים המבטאים את החלבון זרחני, היא שהם יכולים ליישב מארח ביעילות שונה מזן שאינו מבטא את חלבוני ניאון (למשל 12).
שלבים שתוארו בפרוטוקול זה עשויים לדרוש אופטימיזציה בהתאם לנמטודות ומיני חיידקים שנמצאים בשימוש. לנטייה של החיידק מספר מצבים שניתנים לשינוי הם באורך ובטמפרטורה של צמיחה, היחס של תורם למקבל, ופלזמה שלid שימוש. דוגמאות לפלסמידים רלוונטיים מפורטות בטבלה 2. כל פלסמידים אלה היו בשימוש בהצלחה באו חיידקים או Xenorhabdus Photorhabdus בשיתוף עם מארח נמטודות 14,17,20,24,33-35. כדי להבטיח תחזוקה יציבה של החלבון פלואורסצנטי בעקבות קולוניאליזם נמטודות עדיף להשתמש פלסמיד שיוסיף לכרומוזום של חיידק היעד. יתר על כן, חלק מהחיידקים לא יכולים לקחת פלסמידים אלה. לדוגמה, pECM20 נעשה שימוש רק בX. nemtaophila וקרוב מאוד זני חיידקים 14 בגלל מוסיף פלסמיד זה לכרומוזום הומולוגי באמצעות אזור בין פלסמיד וכרומוזום; פלסמיד לא להכניס אם חיידק היעד חסר אזור זה. כדי להשתמש בזה פלסמיד לחיידקים אחרים, X. אזור nematophila ספציפי יש להחליף עם אזור גנומי מחיידק היעד. חלק מהתוכניות, שינוי תהיינה גם פלסמיד require שינויים מסוימים מפרוטוקול 1. לדוגמה, מיני Tn 7-KSGFP וPbk-7-miniTn ΩGm-DsRed יחייבו גני helper פלסמיד המכיל טרנספוזיציה (tsnABCDE) 33,35,36 להכניס לתוך כרומוזום החיידק. נטייה היא יעילה ביותר עם אלה 7-Tn מבוסס פלסמידים, כאשר תרבויות 2-שעה (~ 600 OD 0.3-0.4) מעורבות ביחסים שווים.
לאחר הצמיד מוצלח חשוב לנצל צלחות סלקטיביות נכונות מתאימות לפלסמיד בשימוש. הצלחות סלקטיביות צריכות להכיל האנטיביוטיקה המקודדת בפלסמיד כדי לבחור את קיומו של פלסמיד בנמען ונגד בחירה נגד הזנים התורמים ועוזר. לדוגמה, כאשר conjugating pECM20 בX. nematophila נגד הבחירה בשימוש היא אמפיצילין בגלל X. nematophila הוא אמפיצילין עמיד והמתח התורם הוא אמפיצילין רגיש. אם בחירה נגד אנטיביוטיקה אינה זמינה בyהמערכת שלנו, חומצת diaminopimelic (DAP) דורשת תורם עשויה לשמש. הזנים לגדול DAP-הדורשים, DAP מתווסף לתקשורת צמיחה המוצקה והנוזלית במהלך שלבים-צמידה מראש והזדווגות, והשמיט במהלך שלבים נגד בחירה. כאשר DAP חסר המתח התורם לא יגדל והוא יעיל נגד נבחר.
כדי להבטיח בידוד ביצה מוצלחת הוא חיוני כדי לבדוק במדויק לייצור ביצים (איור 2). בעת הבידוד, נמטודות נשים צריכה להיות מלאה בביצים וכמה ביצים צריכות להיות גלויות בתקשורת (איור 2 א). אם נמטודות נקבות מייצרות ביציות מופרות לפחות כמה ביצי supernatant תהיינה מפותחות בעליל כנמטודות עדיין לא בקעה (איור 2 ב '). בשביל ש ' carpocapsae, את הביצים תשתנינה מכדוריות מעט מוארכות לפני פיתוח נמטודות ובקיעה. התזמון או לתנאים של צמיחה נמטודות ייתכן גם צריך לשנות כדי למקסם את הביצית מופרהתשואה, לרבות קיצור או הארכת משך הזמן עד הגעת קצירת ביצה, או באמצעות תקשורת החלופית המתאימה למין נמטודות הספציפי. בסופו של הבידוד, ביצים צריכות להיות גלויות בקלות בתוך המאגר (האיור 2C). פרמטרים בפרוטוקול בידוד הביצה שעשויה לדרוש אופטימיזציה כוללים ריכוזי אקונומיקה וKOH בפתרון הביצה, זמן דגירה בתמיסת ביצה, או מהירויות צנטריפוגה. אם בידוד הביצה מייצר ביצים אבל לא נמטודות לפתח במהלך שיתוף הטיפוח, זה אפשרי שהביצים הן המבודדות שאינן בת קיימא. כדי לבדוק את הכדאיות ל, משאיר את הביצים המבודדות במאגר ולהמתין לנמטודות לבקוע. את הביצים צריכות לבקוע תוך יום או ימים של בידוד ולאחר מכן את נמטודות הנוער ניתן להשתמש בבדיקת שיתוף הטיפוח. אם הביצים תבקענה אך אינו מתפתחות במהלך assay שיתוף הטיפוח, ייתכן שיהיה צורך לשנות את תנאי צמיחה או בינוני המשמשים לשיתוף טיפוח. נציין כי studie הקודםשלהם הצליחו לבודד חיידק נמטודות חופשיות על ידי השריית נמטודות בקוקטייל אנטיביוטיקה (למשל 3,37). הגישה שאנו מתארים כאן היא חופשיה של חלק מהאזהרות של שריית אנטיביוטיקה, כוללים סיבוכים בשימוש באנטיביוטיקה, חיידקים מזהמים bacteriostatic עמידים לאנטיביוטיקה, ואפקטים אנטיביוטיים על נמטודות. שלבים מסוימים של נמטודות יכולים להיות גם עמידים לאנטיביוטיקה ולשמר symbionts חיידקיים 3. לבסוף, יציינו כי למיקרוסקופיה, ריכוז levamisole ההכרחי לקיבוע נמטודות עשוי להשתנות עם clades נמטודות שונה.
ברגע ששיטה זו כבר נקבעה במערכת של עניין, ניתן לשנות את הטכניקה כדי להפיק יותר מידע. על ידי התבוננות בנקודתי זמן מוקדמות במחזור חי נמטודות (פרוטוקול 4), אחד עשוי להיות מסוגל לזהות כיצד החיידק ונמטודות ליזום את הקשר שלהם 14,16. בנוסף, גישה זו יכולה לשמש to לנהל מסכי מוטצית תפוקה גבוה כדי לזהות גורמי חיידקים מעורבים בסימביוזה, באמצעות פלואורסצנטי לזהות קולוניזציה 17,18. שיטות אחרות כגון mutagenesis חתימה מתויג מחייבות את השימוש בבדיקות שכותרת רדיואקטיבית והם יותר זמן 22,28 רב. לכן, השימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי להדמית סימביונט חיידקים בנמטודות הוא כלי מיון אפקטיביים ויעילים לחקר אינטראקציות חיידקים בעלי מארח נמטודות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לאוג'ניו Vivas, הקורט Heungens, אריק מרטינס, צ'ארלס קאולס, דארבי סוכר, אריק Stabb, וטוד Ciche על תרומתם לפיתוח של פרוטוקול זה וכלים בשימוש. KEM וJMC נתמכו על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) בפרס לאומי לחקר שרותים T32 (AI55397 "חיידקי מחלה ובריאות"). המרכז למוסיקת ירושלים נתמך על ידי מלגת מחקר למוסמכי קרן לאומית למדע (NSF). עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומי למדע (IOS-0920631 וIOS-0950873).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipid Agar (sterile) |
8 grams nutrient broth, 15 grams agar, 5 grams yeast extract, 890 ml water, 10 ml 0.2 g/ml MgCl2. 6H20, 96 ml corn syrup solution*, 4 ml corn oil* Stir media while pouring plates *add sterile ingredient after autoclaving |
||
| Corn Syrup Solution (sterile) |
7 ml corn syrup, 89 ml water mix and autoclave |
||
| Egg Solution | 16.6 ml 12% sodium hypochlorite, 5 ml 5M KOH, 80 ml water | ||
| Lysogeny Broth (sterile) |
5 grams yeast extract, 10 grams tryptone, 5 grams salt, 1 L water mix and autoclave |
||
| Microfuge | Fisher | 13-100-675 | Any microfuge that holds microfuge tubes will work |
| Centrifuge | Beckman | 366802 | Large table top centrifuge that holds 15 ml and 50 ml conical tubes |
| Sterile 60 mm X 15 mm Petri Dish | Fisher | 0875713 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Fisher | 05-539-6 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Fisher | 05-531-6 | |
| Sterile 100 mm X 20 mm Petri Dish | Fisher | 0875711Z | Deeper than standard Petri dishes |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662000-06 | |
| Microscope | The microscope needs florescent capabilities compatible with your fluorophore | ||
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| PBS (sterile) |
8 g NaCL 0.2 g KCL 1.44 g Na2HPO4 0.24 g KH2PO4 1 L water Adjust to a pH of 7.4 and water to 1 L and autoclave |
||
| Microfuge tubes | Fisher | 05-408-138 | 2 ml or 1.5 ml tubes |
| Shaker | Any shaker that causes the liquid to gently move will work | ||
| Diaminopimelic acid | Sigma | D-1377 | If needed, supplement media to a concentration or 1 mM |
References
- Holterman, M., van der Wurff, A. Phylum-wide analysis of SSU rDNA reveals deep phylogenetic relationships among nematodes and accelerated evolution toward crown clades. Mol. Biol. Evol. 23, 1792-1800 (2006).
- Lambshead, P. J. D., Boucher, G. Marine nematode deep-sea biodiversity - hyperdiverse or hype. J. Biogeogr. 30, 475-485 (2003).
- Poinar, G. O. J., Thomas, G. M. Significance of Achromobacter nematophilus Poinar and Thomas (Achromobacteraceae: Eubacteriales) in the development of the nematode, DD-136 (Neoaplectana sp. Steinernematidae). Parasitol. 56, 385-390 (1966).
- Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila. Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).
- Kaya, H. K., Gaugler, R.
- Bird, A. F., Akhurst, R. J. The nature of the intestinal vesicle in nematodes of the family Steinernematidae. Int. J. Parasitol. 13, 599-606 (1983).
- Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. The Steinernema carpocapsae intestinal vesicle contains a subcellular structure with which Xenorhabdus nematophila associates during colonization initiation. Cell. Microbiol. 7, 1723-1735 (2005).
- Snyder, H. A., Stock, S. P., Kim, S. K., Flores-Lara, Y., Forst, S. New insights into the colonization and release process of Xenorhabdus nematophila and the morphology and ultrastructure of the bacterial receptacle of its nematode host, Steinernema carpocapsae. Appl. Environ. Microbiol. 73, 5338-5346 (2007).
- Abebe, E., Abebe-Akele, F., Morrison, J., Cooper, V., Thomas, W. K. An insect pathogenic symbiosis between a Caenorhabditis and Serratia. Virulence. 2, 158-161 (2011).
- Abebe, E., Jumba, M.
- Torres-Barragan, A., Suazo, A., Buhler, W. G., Cardoza, Y. J. Studies on the entomopathogenicity and bacterial associates of the nematode Oscheius carolinensis. Biol. Control. 59, 123-129 (2011).
- Ye, W. M., Torres-Barragan, A., Cardoza, Y. Oscheius carolinensis n. sp (Nematoda: Rhabditidae), a potential entomopathogenic nematode from vermicompost. Nematology. 12, 121-135 (2010).
- Zhang, C., Liu, J. Heterorhabditidoides chongmingensis gen. nov., sp. nov. (Rhabditida: Rhabditidae), a novel member of the entomopathogenic nematodes. J. Invertebr. Pathol. 98, 153-168 (2008).
- Martens, E. C., Heungens, K., Goodrich-Blair, H. Early colonization events in the mutualistic association between Steinernema carpocapsae nematodes and Xenorhabdus nematophila bacteria. J. Bacteriol. 185, 3147-3154 (2003).
- Ciche, T. A., Ensign, J. C. For the insect pathogen, Photorhabdus luminescens, which end of a nematode is out. Appl. Environ. Microbiol. 69, 1890-1897 (2003).
- Ciche, T. A., Kim, K. S., Kaufmann-Daszczuk, B., Nguyen, K. C., Hall, D. H. Cell invasion and matricide during Photorhabdus luminescens transmission by Heterorhabditis bacteriophora nematodes. Appl. Environ. Microbiol. 74, 2275-2287 (2008).
- Easom, C. A., Joyce, S. A., Clarke, D. J. Identification of genes involved in the mutualistic colonization of the nematode Heterorhabditis bacteriophora by the bacterium Photorhabdus luminescens. BMC Microbiol. 10, 45 (2010).
- Somvanshi, V. S., Kaufmann-Daszczuk, B., Kim, K. S., Mallon, S., Ciche, T. A. Photorhabdus phase variants express a novel fimbrial locus, mad, essential for symbiosis. Mol. Microbiol. 77, 1021-1038 (2010).
- Martens, E. C., Russell, F. M., Goodrich-Blair, H. Analysis of Xenorhabdus nematophila metabolic mutants yields insight into stages of Steinernema carpocapsae nematode intestinal colonization. Mol. Microbiol. 51, 28-45 (2005).
- Sugar, D. R., Murfin, K. E. Phenotypic variation and host interactions of Xenorhabdus bovienii SS-2004, the entomopathogenic symbiont of Steinernema jollieti nematodes. Env. Microbiol. 14, 924-939 (2012).
- Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. The Xenorhabdus nematophila nilABC genes confer the ability of Xenorhabdus spp. to colonize Steinernema carpocapsae nematodes. J. Bacteriol. 190, 4121-4128 (2008).
- Heungens, K., Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. Identification of Xenorhabdus nematophila genes required for mutualistic colonization of Steinernema carpocapsae nematodes. Mol. Microbiol. 45, 1337-1353 (2002).
- Goetsch, M., Owen, H., Goldman, B., Forst, S. Analysis of the PixA inclusion body protein of Xenorhabdus nematophila. J. Bacteriol. 188, 2706-2710 (2006).
- Bhasin, A., Chaston, J. M., Goodrich-Blair, H. Mutational Analyses Reveal Overall Topology and Functional Regions of NilB, a Bacterial Outer Membrane Protein Required for Host Association in a Model of Animal-Microbe Mutualism. J. Bacteriol. 194, 1763-1776 (2012).
- Ciche, T. A., Goffredi, S. K. Methods in General and Molecular Microbiology. Reddy, C. A. , ASM Press. 394-419 (2007).
- Goodrich-Blair, H., Clarke, D., Grewal, P. S., Ciche, T. A. Insect Pathogens, Molecular Approaches and Techniques. Stock, S. P., Boemare, N., Vandenberg, J., Glazar, I. , CABI Publishing. 239-269 (2009).
- Stock, S. P., Goodrich-Blair, H. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. Lacey, L. A. , Elsevier Press. 375-425 (2012).
- Martens, E. C., Gawronski-Salerno, J. Xenorhabdus nematophila requires an intact iscRSUA-hscBA-fdx locus to colonize Steinernema carpocapsae nematodes. J. Bacteriol. 185, 3678-3682 (2003).
- Vivas, E. I., Goodrich-Blair, H. Xenorhabdus nematophilus as a model for host-bacterium interactions: rpoS is necessary for mutualism with nematodes. J. Bacteriol. 183, 4687-4693 (2001).
- White, G. F. A method for obtaining infective nematode larvae from cultures. Science. 66, 302-303 (1927).
- Ciche, T. A., Ensign, J. C. For the insect pathogen Photorhabdus luminescens, which end of a nematode is out. Appl. Environ. Microbiol. 69, 1890-1897 (2003).
- Sicard, M., Brun, N. L. e Effect of native Xenorhabdus on the fitness of their Steinernema hosts: contrasting types of interaction. Parasitol. Res. 91, 520-524 (2003).
- Lambertsen, L., Sternberg, C., Molin, S. Mini-Tn7 transposons for site-specific tagging of bacteria with fluorescent proteins. Environ. Microbiol. 6, 726-732 (2004).
- Miller, W. G., Leveau, J. H., Lindow, S. E. Improved gfp and inaZ broad-host-range promoter-probe vectors. Mol. Plant Microbe Int. 13, 1243-1250 (2000).
- Teal, T. K., Lies, D. P., Wold, B. J., Newman, D. K. Spatiometabolic stratification of Shewanella oneidensis biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 72, 7324-7330 (2006).
- Bao, Y., Lies, D. P., Fu, H., Roberts, G. P. An improved Tn7-based system for the single-copy insertion of cloned genes into chromosomes of Gram-negative bacteria. Gene. 109, 167-168 (1991).
- Woodring, J. L., Kaya, H. K. Steinernematid and Heterorhabditid Nematodes: A Handbook of Biology and Techniques. Southern Cooperative Series Bulletin 331. , Arkansas Agricultural Experiment Station. (1988).
