Summary
Biz hepatik neo-adacık STZ formasyonu (streptozotosin)-indüklenen helper bağımlı adenoviral vektör (HDAd) ve hiperglisemi ters kullanılarak gen Neurogenin3 transferi (Ngn3) ve Betacellulin (BTC) ile diyabet oluşturulan farelerde. Tarif Bizim metodumuz vivo iletimi ve uzun ömürlü gen ekspresyonu kendi yüksek verimli olan helper-bağımlı adenoviral vektörlerin avantajları alır.
Abstract
Tip 1 diyabet pankreasın insülin üreten hücrelerin T hücre-aracılı otoimmün yıkıma neden olur. Adacık transplantasyonu donör durumuna göre ve uzun vadeli immünosupresyon ihtiyacı ile sınırlı kalmıştır, çünkü şimdiye kadar insülin yerine, hala önemli bir tedavi yöntemidir. Neuogenin3 gen transferi (Ngn3), adacık soy tanımlayan spesifik transkripsiyon faktörü ve Betacellulin (BTC) Göre İsteyerek adacık neogenesis, bir adacık büyüme faktörü tip 1 diyabet tedavisi için bir potansiyele sahiptir.
Adenoviral vektörlerin (Reklamlar) yüksek verimli gen transferi vektör olmakla birlikte, erken nesil İlanlar vivo kullanımı için çeşitli dezavantajları vardır. Helper bağımlı Reklamları (HDAds) Reklamlar erken nesil güvenlik profilini artırmak ve transgen ekspresyonu 1 uzatmak için geliştirilen en gelişmiş Reklamlar vardır. Viral kodlama dizilerinin 2-5 yoksun ve yalnızca Reklam cis El korumak çünkü kronik toksisite eksikliğivektör çoğaltma ve paketleme için gerekli, anahtar kelimeleri. Bu 36 kb genlerin kadar klonlama sağlar.
Bu protokol, biz HDAd-Ngn3 ve HDAd-BTC oluşturmak ve STZ ile indüklenen diyabetik farelerde içine bu vektörler sunmak için yöntem açıklanmaktadır. Bizim sonuçlarımız HDAd-Ngn3 ve karaciğerde HDAd-BTC baskılanması 'neo adacık' co-enjeksiyon ve diyabetik farelerde hiperglisemi tersine çevirebilmektedir.
Protocol
1. HDAd Servisi Vektör içine Terapötik Genler Clone
- Her yerde bulunan bir uzama faktör-1 promotörü (BOS) ve bir poli A sinyal içeren pLPBL1 plazmid vektörü içerisine Klon fare Ngn3 ve BTC cDNA'ları. Tamamlayan dizi analizi ile vektörler doğrulamak ve daha sonra 6 plazmid pΔ28 HDAd mekik içine bu ekspresyon kasetleri subclone.
- Plazmid omurgası serbest PmeI tarafından Digest HDAd mekik vektörleri, transfeksiyon dereceli su ile etanol yağış ve sulandırmak takip fenol / kloroform / izoamil alkol ekstraksiyonu ile DNA'lar arındırmak.
2. Helper bağımlı adenoviral vektör Üretimi
HDAd vektör üretim dikkatle optimum sonuçlar için takip edilmesi gereken birden fazla adım içerir.
2.1 Transfeksiyon
- Transfeksiyon gününde% 70-80 konfluent ulaşmak için iki gün 6 cm çanak içine transfeksiyon, tohum 116 hücreleri önce 7.
- Transfeksiyon üç saat önce, orta kaldırmak ve taze büyüme ortamının 5 ml ekleyin [MEM% 10 FBS ve% 1 PSG (Penisilin, Streptomisin ve Glutamin), Invitrogen ile desteklenmiş].
- Üreticinin talimatlarına göre Promega gelen ProFectionR Memeli Transfeksiyon kiti kullanılarak Adım 1.2) 10 mg DNA ile transfekte 116 hücreleri,.
- Ertesi gün, büyüme ortamı, 1 ml 2 kez yıkayın hücrelerini. PBS içeren kalsiyum ve magnezyum 0.1 ml 500 vektör parçacıkların (vp) / hücre de yardımcı virüsü (HV) ekle (PBS + +) hücreleri ve kaplama. Yavaşça eşit HV her 10 dakikada dağıtmak için yemekler sallayın.
- 60 dakika sonra, bakım ortamı (MEM,% 5 FBS,% 1 PSG), 1.5 ml eklenir.
- Ertesi gün orta bakım başka bir 1 ml ilave edilir.
- CPE hücreleri (- hücreleri yuvarlak ve müstakil hale sitopatik etkisi) dikkate alınmalıdır. Hücrelerin Büyükşehir% 80'inden 2 gün sonra enfeksiyon CPE göstermelidir.
- Ham hücre lizat (CVL, hücreler ve orta), toplayın, bir-80% 40 sakaroz ve mağaza gg% 10 hacim ° C. CVL geçit 0 olarak etiketlenmiş - (CVL-P0).
2.2 Vektör amplifikasyon
- Freze (-80 ° C, 3-5 dakika) / çözülme (37 ° C, 1-2 dakika) 3 kez.
- Overlay 0.5 ml CVL 6 cm çanak confluent 116 hücrelere 200 vp / hücre, YG ile desteklenmiş ve yavaşça her 5 dk çanak sallayın. 30 dakika sonra, 1 ml bakım ortamı ilave edin.
- Bakım ortamı sonraki gün 1 ml ilave edilir. 2 gün sonra, hücrelerin en CPE göstermesi gerekir.
- -80 ° C (CVL-P1) adım 2.1.8 için tarif edildiği gibi) de CVL ve mağaza toplayın.
- CVL P2-P4 almak için 3 kez tekrarlayın.
- P1-P4 az CVL toplanan 0.2 ml DNA (DNeasy Kan ve Doku Takımı, Qiagen) ayıklayın ve HV-ve HDAd spesifik primerler (Tablo 1) kullanarak qPCR ile vektör amplifikasyon analiz. Katlanarak subsequen için (Şekil 2'de P3) HV göre amplifiye HDAd pasaj olan kullanmat prosedürü.
- 200 vp / hücre az 0.5 ml CVL ve HV ile 15cm çanak 90% konfluent 116 hücreleri Co-enfekte. Çanağı yavaşça her 5 dk Kaya. 30 dakika sonra, bakım ortamı 10 ml eklenir.
- 24 saat sonra ortam bakım 5 ml ilave edilir.
- 5 dk sonra enfeksiyon tam 48 saat boyunca 1.500 xg'de santrifüj hücreleri toplayın.
- PBS + -80 + ihtiva eden% 4 sakaroz (P5) ve dondurarak ° C'de 1 ml içinde tekrar askıya hücrelerin
2.3 Büyük ölçekli HDAd üretimi
- Süspansiyon hücre kültürü içinde enfeksiyon için 116 hücrelerini hazırlamak için, eğirme makinesi, 3 L bir şişeye 8 x 15 cm tabak 116 hücreler confluent aktarmak ve (Joklik modifiye MEM% 5 FBS, 0.1 mg / ml higromisin ve% 1 ile desteklenmiş büyüme ortamında süspansiyon eklemek PSG) son 1 L ve 60 rpm 8 iplik ile bir CO 2 inkübatör inkübe.
- Taze aracı madde içinde 2 gün için her gün (toplam 2 L) 0.5 L ekleyin.
- Üçüncü gününde hücreleri saymak. Hücreler t ulaşan eğer kullanıma hazır1x10 9 o total hücre sayısı.
- P5 3 kez Çözülme / dondurun.
- 5 dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüj ile 3 L spinner şişesi hücreleri toplayın. Yeniden askıya hücrelere süpernatan 100 ml kaydedin.
- 250 ml'lik spinner balona hücreleri aktarın. 37, 1 saat boyunca 200 VP / hücreleri için hücre ile inkübe 60 ° C 'de rpm'de P5 ve HV ekleyin.
- Transferi hücreleri ve 3 L spinner şişeyi orta, 2 L askı büyüme ortamı ekleyin. CPE hücreleri gözlemlemek için bir 12-plaka bir de 1 ml hücre süspansiyonu aktarın.
- 60 rpm'de bir CO2 kuluçka makinesi içinde 2 gün için eğirme makinesi şişeye hücreler inkübe edin.
- Hücreler santrifüjleme ile toplayın ve arıtma gününe kadar -80 ° C (P6), 15 ml 100 mM Tris-HCl (pH 8.0) ve depo ile yeniden askıya.
2.4 Vektör arıtma
- P6,% 5 sodyum deoksikolatın 1.0 ml ilave edilir. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir.
- 2 M MgCl2, 300 μ, 400 ul ekleRNaz A (10 mg / ml), ve 300 DNase I (10 mg / ml) ul ve 1 saat boyunca 37 ° C de inkübe l.
- Süpernatan toplamak için oda sıcaklığında 10 dakika için 6000 x g'de santrifüjleyin.
- Doku kültürü kaputu içinde 1 saat süreyle UV ışık altında NVT 65 ultrasantrifüjdeki tüpleri (Beckman) sterilize edin.
- Boyun tüp doldurmak için düşük yoğunluklu CsCl çözeltisi (1.25 g / ml), yüksek yoğunluklu CsCl yoğunluk çözeltisi altlık 2.8 ml (1.41g/ml) ve daha sonra üstte kalan sıvı kaplama 5-6 ml 2.8 ml ilave edilir. Tüp gerekirse doldurmak için 100 mM Tris-HCl (pH 8.0) kullanın.
- 10 Santrifüj 10 50,000 rpm'de 30 dakika süre ile Beckman ° C ° LE-80K NVT-65 rotor kullanılarak C.
- İğne için% 70 etanol ile alan silin, ve yan delinme (Şekil 3a) ile 22 G iğne ile donatılmış bir 3 ml bir şırınga ile alt grup yanardöner toplamak. Bazen çok soluk yardımcı bandı daha belirgin vektör bant aşağıda görülebilir. Th kadar elde etmeye çalışınhelper bandı olmadan mümkün gibi e vektör bant. Bu aşağıda daha sonraki bir gecede santrifüjle ayrılır edileceği gibi yardımcı grubun bir kısmı, aspire edilmiş olsa bile, hem bu aşamada kabul edilebilir.
- Yeni sterilize ultrasantrifüjdeki tüpleri içine toplandı bantları yerleştirin. 1.35 g / ml solüsyon yoğunluk CsCl ile kaplanacağı boyun için tüpler doldurun.
- 10 gecede 50.000 rpm ° C Santrifüj. Yanardöner bant (Şekil 3b) toplayın.
- Bir diyaliz kaset (Slide-a-Lyzer, 10.000 MWCO, Thermo-bilimsel) içine bant aktarın.
- 4 ° C'da gece boyunca 2 mM MgCl2 ve% 4 sukroz ihtiva eden otoklava, 10 mM Tis-HCl, pH 7.2, 3 L karşı Dialyze.
- Diyaliz kaset HDAd vektör çıkarın. Fiziksel titresi ve DNA karakterizasyonu için 50 ul için tablet 20 ul. (Not: Ngn3 vektörü, HDAd-Ngn3 verimi HDAd-BTC veya HDAd boş kıyasla zayıf olduğu için yeterli vektör elde etmek için "P6" üç kez tekrarlayın.)
HDAd vektörler 2.5 Karakterizasyon
- Optik yoğunluk kullanılarak fiziksel titresi (vp / ml) (OD) belirleyin. 20 dakika boyunca 56% 0.1 SDS ve inkübe ° C ihtiva eden 380 ul TE tamponu ile 20 ul vektör ya da 20 ul diyaliz tampon ekleyin. 260 nm'de OD ölçün. Fiziksel titresi OD260 = 1.1 x 10 x 12 x 20 (VP / ml).
- QPCR tarafından HV kirlenme analiz edin. DNeasy doku / kan DNA çıkarma takımı (Qiagen) kullanılarak DNA elde etmek için 50μl kısım kullanın. DNA 1000 kat seyreltilir ve yardımcı ve vektör spesifik primerler (Tablo 1) kullanarak analiz için qPCR 5 ul alır. Yardımcı kirlilik olarak Şekil 4A'da gösterildiği gibi,% 1 'den az olmalıdır.
- Vektör yapısını analiz etmek Southern blot kullanın. Ters terminali tekrar (ITR) için bir prob kullanarak Southern blot analizi 10 gerçekleştirin. Temsilci Sonuç, Şekil 4B 'de gösterilmiştir.
- Vitro etkinliğine belirleyin. Bilinen Infect1000 dört nüsha olarak vp / hücreden HDAd vektörü ile 12 plaka içinde 116 hücre sayısı. 48 saat sonra, hücreler hasat ve qRT-PCR (Tablo 1) ile Ngn3 ve BTC mRNA'ların ifadesini belirlemek için RNA özütünden. Örnek sonuçlar Şekil 5 de gösterilmiştir.
3. HDAd-Ngn3 ve-BTC tarafından Diyabetik Fare Tedavisi
3.1 farelerde diyabetin İndüksiyon ve HDAd vektörlerin enjeksiyonu
- STZ Hazırlanması: 0.1M sitrat tamponu hazırlayın ve 4.3-4.5 PH ayarlayın. 0.22 mm şırınga filtre aracılığıyla bu filtre. Steril su kullanımı 0.01 M Na pH 4,2-4,5 sitrat bu sulandırmak. 12.5 mg / ml 'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için bu çözelti içinde STZ (Sigma), uygun miktarda eritilir. Bu konsantrasyonda hiçbir yağış var. ° C kadar kullanılan 4 bu STZ çözümü tutun. Enjeksiyondan hemen önce oda sıcaklığına kadar enjekte çözeltinin sıcaklığını getirin. STZ çözümü omuzd her gün taze hazırlanan ve kapatılma korkusu 5-10 dakika içinde enjekte olabilir.
- 5-7 pm (ışıkları fare tesiste kapalı ve farelerin aktif beslemeye başlarlar önce) arasındaki akşamları bu STZ çözüm intraperitoneal (125 mikrogram / g vücut ağırlığı dozunda elde etmek için 10 ul / g), enjekte, İki gün üst üste 9.
HDAd vektörlerin 3.2 İzleme farelerde glukoz ve enjeksiyon.
- 6 saat ve fareler kadar haftalık ölçüsü vücut ağırlığı ve kan şekeri için Hızlı fareler hiperglisemi (≥ 250mg/dl) var. Kuyruk kırt tarafından toplanan kan için One Touch glukometre kullanın. 250-500 mg / dl: kan şekeri glukoz tedavisi için hedef aralığında persistan hiperglisemi ve kan sağlamak için hızlı bir 6 saat sonra 48 saat içinde tekrar ≥ 250 mg / dl, yeniden kontrol kan şekeri olduğunu bir kez.
- Kuyruk veni yoluyla HDAd vektörler, tek bir intravenöz enjeksiyon yoluyla kalıcı hiperglisemi ile farelerin davranın. Toplam vektör dozu 6x10 11 vp olduğunu; Ngn3 grup için 5x10 11 vp Ngn3 + 1x10 11 vp ve BTC grup için 1x10 11 vp BTC + 5x10 11 vp boş vektör ve kombinasyon grubu için 5x10 11 vp Ngn3 +1 x10 11 vp BTC: tüm tedavi gruplarında (0.25 ml) için Kontrol grubu için 6x10 11 vp boş bir vektör.
- Kuyruk ven enjeksiyon. Tailveiner süzgeç (TV-150, Braintree Scientific Inc) içine fare koyun ve kuyruk damarları genişletmek için ılık su kullanın,% 70 alkol ile kuyruk temizleyin. Başparmak ve el işaret parmağı arasındaki enjeksiyon yerinde aşağıda kuyruk tutun, enjeksiyon için başka bir elinizi kullanın. Enjeksiyon şırıngada hava kabarcığı (30 1/2 G iğne ve 1 ml şırınga kullanarak) olmadığından emin olun önce. Iğne takın ve vektör yavaş enjekte edin. Iğne ven ise, kan flaş iğne hub görülen ve hiçbir direniş enjeksiyon sırasında da var olabilir. Iğne çıkardıktan sonra, fareler t dönmeden önce kanamayı durdurmak için gazlı bez ile enjeksiyon yerinde tutuno kafesi.
Iğne damar değil ise enjeksiyon için önemli direnç ve küçük bir deri altı kenar ortaya çıkar vardır. Şu anda iğne kaldırmak ve farklı bir sitede tekrar deneyin.
HDAd-Ngn3 + HDAd-BTC tedavinin etkilerinin 3.3 analizi.
- Monitör 6 saat açlık glukozu ve vektör tedavi sonrası haftalık vücut ağırlığı.
- Her 2 haftada bir tahlil insülin (Fare İnsülin ELISA kiti, Mercodia) ve ticari kitleri kullanılarak karaciğer enzimleri (AST ve ALT Infinity Reaktifler, Thermo Scientific) ile bacak safen ven veya kuyruk damarından kan toplayın.
- Kapalı ucuna yapılan delikleri olan bir kapağını açıp 50 ml Falcon tüp içinde fare yerleştirin.
- Fare kafası tüpün açık tarafında tüp ve bacaklar ve kuyruk kapalı sonundadır. Sol bacak kan toplamak için, boru dış sol bacak uzatmak ve hafifçe başparmak ve bacak hareketsiz işaret parmağı arasında uyluk cilt çimdik.
- Kullanmakalt bacak lateralinde mevcut safen ven, açığa, incik / alt bacak bölgesinden saç kaldırmak için bir tıraş makinesi. % 70 alkol ile traş cildi temizleyin ve kurumaya bırakın.
- Delinme 25 gauge iğne ile safen ven, Microvette CB300 tüp (Sarstedt) ile kan toplayın ve buz üzerinde tüp koydu.
- Kafeslere fareler dönmeden önce kanamayı durdurmak için gazlı bez ile ponksiyon basın.
- 5 dakika boyunca 3000 x g'de santrifüje tüpler, daha fazla analiz için -20 ° C'de süpernatantı ve mağaza al.
3.4 Tedavi sonrası 6. haftada glukoz tolerans testi (GTT) gerçekleştirin.
- % 15 glikoz (15 g / 100 mi) ve steril filtre glikoz yapmak için damıtılmış su, D-glukoz (Sigma) çözündürüldü.
- 6 saat boyunca Hızlı fareler. Fareler ısıtmak ve kan (0 dak zaman noktası) toplamak için sıcak ped kullanın. Sonra, D-glikoz ip yaklaşık 1.5 g / kg (% 15 glikoz 10 ml / g) enjekte edilir.
- Col15, 30, 60, 120 dk kan bilirsiniz.
- Tüm bu örneklerde glikoz ve insülin ölçün.
3.5 Doku analizi vektörlerin ifade değerlendirmek ve adacık neogenesis indüksiyonu değerlendirmek.
Tüm bu adımlarda güvenilir sonuçları yorumlamak için gerekli olan kontroller şunlardır: (1) Boş vektör diyabetik farelerde tedavi (2) non-diyabetik fareler ve adacık ifadesi için bir pozitif kontrol olarak hizmet (3) non-diyabetik pankreas Belirli hormonlar ve transkripsiyon faktörleri.
- Tedavi sonrası 3. ve 6. haftalarda Hasat karaciğer ve pankreas. 2 adet, immünhistokimya analizi için bir gecede% 10 formalin ile düzeltmek için RNA ve protein ekstraksiyonu için C ° -80 sıvı azot saklama ve ek dondurma için ilk ve ikinci bölün.
- Doğrulayıcı bir standart protokol ile RNA ayıklayın ve adacık belirli hormonlar ve transkripsiyonel faktörlerin ekspresyonu analiz, Ngn3 birlikte ve BTCözgü primerler, 9, 10 kullanılarak qRT-PCR ile karaciğerde m ifade vektörü.
- Asit-etanol ekstraksiyon yöntemi ile karaciğer insülin ve c-peptid ayıklayın ve bir ticari ELISA kiti (ultra hassas İnsülin assay Mercodia, C-peptid ELISA kiti, Wako) tarafından ölçmek.
- Madde 9, 10 parafin adacık spesifik transkripsiyon faktörleri ile birlikte adacık belirli hormonların (insülin, glukagon, PP, SST) için immünboyama gerçekleştirin. Ngn3 BTC ifade da immun ile teyit edilebilir.
4. Temsilcisi Sonuçlar
Biz Ngn3 ve her yerde organizatörü eIF2a (BOS) tarafından yönlendirilen ve HDAd-Ngn3 ve HDAd-BTC oluşturulan pΔ28 vektörlere cDNA BTC klonlanmış. Şekil 2 de gösterildiği gibi, göreceli HV kirlenme pasaj 3'de (daha fazla vektör amplifikasyon ve daha az yardımcı amplifikasyon ima) önemli ölçüde azalmıştır. Bu nedenle, daha sonraki vektör üretimi için P3 kullanılır. Birinci sonra,CsCl süreksiz degrade ve santrifüj, biz en düşük vektör bant toplanan ve daha sonra ikinci Ultrasantrifügasyon içinde HDAd vektörü (Şekil 3) karşılık yanardöner grup toplandı. Saflaştırılmış HDAd vektör qPCR tarafından HV kontaminasyon (Şekil 4A)% 1'den az vardı ve güney farelere vektör infüzyon için yeterli kalitede gösteren (Şekil 4B) blotting görünür hiçbir yardımcısı kirlenme vardı. Ayrıntılı analizde 116 hücre enfeksiyon transgen ifadesi yer aldı. Ngn3 ve BTC mRNA düzeyleri olmayan enfekte hücreleri (Şekil 5) ile karşılaştırıldı 10.000 kat üzerinde tarafından vektör enfekte hücrelerde yüksek bulunmuştur.
HDAd-Ngn3 ve-BTC sonra boş bir vektör enjekte ve negatif kontrol olarak hizmet HDAd-BTC enjekte diyabetik farelerde kuyruk damarından enjeksiyon yoluyla STZ ile indüklenen diyabetik farelerde uygulanmıştır. Hiperglisemi ters ve glukoz-uyarılmış insülin sekresyonu edilditek gen vektör veya denetim boş vektör (Şekil 6) ile tedavi edilen farelerde HDAd-Ngn3 ve HDAd-BTC ama ikisi ile tedavi edilen farelerde yılında restore edilmiştir. HDAd-Ngn3-BTC tedaviye bağlı adacık neogenesis ve bu kontroller olarak hizmet veren non-diyabetik, diyabetik boş vektör tedavi edilen farelerde ile toplam insülin ve c-peptid içeriği (Şekil 6E) assaying nicelendirildi. , Eş mol oranlarında C-peptid, insülin varlığında karaciğerde tespit edilmesini ensülin gerçekten Karaciğerde sentez edildiğini teyit etmektedir. RT-qPCR HDAd-Ngn3-BTC tedavi edilen farelerin karaciğer tüm adacık özgü hormonlar ve transkripsiyon faktörleri 9 ifade ettiğini doğruladı. İmmünohistokimya HDAd-Ngn3 ve HDAd-BTC ile tedavi edilen farelerin karaciğer insülin pozitif hücreler gösterdi, ama hiçbir insülin pozitif hücreler kontrol vektörü (Şekil 7) ile tedavi edilen farelerde gözlenmiştir. Biz de Ngn3-BTC treate ve pankreas hiçbir kalıntı adacıklar olduğunu doğruladıd fareler gibi non-diyabetik pankreas sayıda adacık kıyasla. Adacık spesifik soy transkripsiyon faktörü (Pdx-1 ve Nkx6.1) ile birlikte ifade vektörü (Ngn3 ve BTC) ayrıca karaciğer (Şekil 7) immünboyama ile değerlendirildi.
Helper-bağımlı virüs sistemi kullanan diyabetik farelerde gen tedavisi Şekil 1. Akış şeması. Birincisi, Ngn3 ve BTC, her yerde BOS organizatörü tarafından yönlendirilen bir kaset, HDAd servis (pΔ28) vektörler klonlanmıştır. HDAd transfeksiyon, amplifikasyon seri pasajlar, vektör ve arıtma takip büyük ölçekli bir enfeksiyon dahil olmak üzere çeşitli adımlar ile elde edilir. Kalite karakterize sonra, kuyruk veni yolu ile HDAds STZ ile indüklenen diyabetik farelere venöz içinden enjekte edilir. Tedavinin etkileri ölçüm glikoz, vücut ağırlığı, GTT tarafından ve gen ekspresyon analizleri ile değerlendirilirkaraciğer içinde.
Şekil 2. Belirlenmesi HDAd vektör amplifikasyon. DNA DNA ekstraksiyon kitleri (Qiagen) kullanılarak P4 geçişi P0 elde edilir. DNA 1,000 kat ve 5μl DNA gerçek zamanlı PCR (qPCR) için kullanılmaktadır seyreltilir. Yardımcı ve vektör spesifik primerler kullanılır. Standart eğrileri HDAd mekik vektörünün plazmid ve HV plazmid (üst panel) seri dilüsyonları (10 -5 ila 1 ng / ml) tarafından oluşturulur. Vektör ve yardımcı virüsü kopya sayısı için standart eğrileri ve Ct değerlerini kullanarak hesaplanır ve HDAd / HV oranı toplam virüsün bir yüzdesi (helper + HDAd) olarak çizilir. Bu nedenle, görece vektör amplifikasyon şekilde hesaplanır: [vektör kopya sayısı / (vektör + yardımcı virüs kopya sayısında var)]. Bağıl HDAd / HV P3 artarken, P4 azından kızağa HDAd vektör amplifikasyon (alt panel) gösterilen örnekte. Bu nedenle, P3 sonraki adım için seçilir.
Şekil 3. Örnek HDAd vektör bantları süreksiz CsCl yoğunluğu Ultrasantrifügasyon sonra. HDAd vektör ardışık CsCl yoğunluk gradient üzerinde 3L spinner kültürü arındırılır. (A) ilk olarak yoğunluk gradyan santrifüjü gibi sonra, bir tek vektör yanardöner bant opak hücre artıkları (CH) aşağıda (ok) görülebilir. Yanardöner bant (ok) ve ikinci yoğunluk gradyan santrifüj için toplanır. (B) ikinci bir yoğunluk gradyan santrifüjü gibi sonra, yanardöner bant (ok) diyaliz için toplanır.
Şekil 4. Helper virüs bulaşma analizi. DNA 50μl saflaştırılmış virüs çıkarılan ve yardımcısı kirlenme olduğu birŞekil 2 'de olduğu gibi ssessed. Şekil HDAd-Ngn3 ve HDAd-BTC yardımcınız kontaminasyon% 1'den daha az olduğunu göstermektedir.
Şekil 5,. HDAd vektör yapısı analizi. Southern blot (Oka, K, ve ark.), Daha önce tarif edildiği gibi gerçekleştirilir. Lane 1: helper virüs DNA; Lane 2: P3 DNA; Lane 3: P4 DNA; Lane 4: Saflaştırılmış vectopr. Aç okları yardımcı virüsü türetilmiş bantları gösterir ve dolu oklar HDAd vektörü elde ITR gruplarını göstermektedir.
Şekil 6. HDAd-Ngn3 veya HDAd-BTC vektörü ile enfekte 116 hücrelerinde Ngn3 veya BTC İfade seviyesi. 12 kuyucuğu 116 Hücreleri 1000 2 gün vp / hücreden HDAd-Ngn3 veya HDAd-BTC veya boş vektör ile enfekte olmaktadır. Cells hasat edilir ve toplam RNA Trizol tepkin madde kullanılarak elde edilmektedir. qRT-PCR Ngn3-veya BTC-özgü primerler kullanılarak gerçekleştirilir. Nispi Ngn3 ya da BTC mRNA ekspresyonu HDAd-Ngn3 veya HDAd-BTC ile enfekte olmuş hücrelerin içinde 10,000 kat fazla artmıştır. Şekil Dev.Cell Mar 2009 yeniden basıldı edilir; 16 (3): 358-73; Yechoor et. ark., Elsevier izni ile.
Şekil 7. STZ ile diyabet farelere HDAd-Ngn3 ve HDAd-BTC Gen transferi karaciğerde diyabet ve adacık neogenesis indüksiyonu tersine yol açar. (A) Plazma glikoz ve HDAd-Ngn3 ve HDAd-BTC ile muamele STZ ile indüklenen diyabetik farelerde (B) vücut ağırlığıdır. Tedavi sonrası 6. haftada bir IP-GTT sırasında (C) Plazma glukoz ve insülin. 12 haftalık tedaviden sonra karaciğerde (D) Örnek ensülin boyama. * P <0.05 (vs boş vektör grubu). Şekil Dev itibaren yeniden yazdırılır. Cell: 2009 16 (3): 358-73; Yechoor ve diğerleri, Elsevier izni ile..
| isim | ileri astar | astar ters | |
| yardımcı | GACCATCAATCTTGACGACC | ATGTCGCTTTCCAGAACCC | |
| vektör | TTGGGCGTAACCGAGTAAG | ACTTCCTACCCATAAGCTCC | |
| Ngn3 | AAGAGCGAGTTGGCACTCAG | TCTGAGTCAGTGCCCAGATG | |
| BTC | GCACAGGTACCACCCCTAGA | TGAACACCACCATGACCACT | |
Tablo 1. Primer dizileri.
Discussion
HDAds erken nesil Reklamlar zayıflığı aşmak ve gen tedavisi uygulaması için koşum geliştirilmiştir. Ancak, teknik sorunlar devam etmektedir. Örneğin, HDAd HDAd paketleme ve vektör amplifikasyonu için HV erken nesil İlanlar kadar verimli değildir gerektirir. HV ilk jenerasyon İlan ve HV uzlaşma HDAd etkililiğini herhangi bir kirlenme olduğunu. Bu nedenle, yüksek verimli transfeksiyon ve her seri geçiş için en uygun koşulları önemlidir. Vektör üretimi için bir başka önemli parametre doğrudan doğruya süspansiyon hücreleri için aşı malzemesi olarak kullanılan 5 sonraki geçiş için kullanılması gereken pasaj (P1-P4) 'dir. Deneyim için, en iyi sonuçlar HDAd vektör oran önemli ölçüde aşağıdaki pasaj (Şekil 2'de P3) artmış edildiği geçit ile elde edilmiştir. HDAd vektörleri verim transgen kaseti bağlıdır. Her iki genin altında olduğu için vektör üretimi sırasında, hem transgenlerin ifade edilmiştirher yerde organizatörü. Ngn3 bir transkripsiyon faktörüdür ve BTC olduğunu ifade büyüme hormonu vektör çoğaltma ve paketleme yardımcı olur ise hücre soyu vektör amplifikasyonu inhibe etkileyebileceğini HDAd vektör ifade transkripsiyon faktörü anlaşılacağı bir büyüme faktörüdür.
Diyabet salgın boyutlarına varsayarak ile, b-hücre kitlesinin geri yeni yaklaşımlara ihtiyaç vardır. Bu yazıda, adacık büyüme faktörü ile birlikte adacık soy tanımlayan transkripsiyon faktörü, Ngn3 gen transferi etkileyecek HDAd vektörlerin avantajlarından yararlanmak için yöntemler tarif betacellulin karaciğerin periportal bölgelerinde adacık neogenesis ikna etmek. Bu etkinliğini değerlendirmek için, stabil hiperglisemi ile fare seçilir ve uygun kontrollerin her zaman dahil olduğundan emin olmak için önemlidir. Bu gen transferi denemeleri için, boş bir vektör diyabetik farelerde daima kullanılmalıdır tedavi. Buna ek olarak, HDAd-Ngn3 ve HDAd-BTC kullanılarak ayrı ayrı diyabetik mi muamelece adacık neogenesis olarak bu iki genin tek katkı test etmek için kullanılır. Bizim veri yalnız Ngn3 adacık neogenesis ikna etmek için yeterlidir, ancak büyüme faktörü, BTC, ilavesi adacık neogenesis sağlam indüksiyon giden yanıtı artırmak için hizmet verdiğini gösterir gibi. Bu vektör ifade gerçekten hedef doku, karaciğer elde edilir ve aynı zamanda tedavi edilen farelerde plazma içinde test pankreatik insülin yokluğunda göstererek, pankreas adacıklarının kalıntı gelen olmadığını göstermek için test etmek için de önemlidir diyabetik farelerde adacık.
Özet olarak, gen aktarımı için HDAd-vektör sisteminin avantajı, ev sahibi içine minimum toksisite kronik hem de vektör olmayan genom entegrasyon doğası ile karaciğerde yüksek bir klonlama kapasitesine, verimli transdüksiyonu ile uzun süreli bir gen ekspresyonu yatmaktadır kromozom. Birincil sınırlamalar üretimini ve yer karmaşık adımlar vardır onunİn vivo uygulama, öncelikle en popüler Reklam serotip 5 ile karaciğer ile sınırlıdır. Islet neogenesis tam Adacık büyüme faktörü, betacellulin birlikte adacık soy belirleyici transkripsiyon faktörü, Ngn3 gen transferi yoluyla karaciğerde adacık neogenesis uyararak plazma insülin ve diyabetik farelerde glukoz toleransı geri indüklenen olabilir. Bu yazıda, yüksek kaliteli HDAd-Ngn3 ve HDAd-BTC oluşturmak için uygun protokol göstermek ve hiperglisemi ters diyabetik farelerin karaciğerinde adacık neogenesis teşvik ve değerlendirmek tekniklerini göstermektedir.
Dipnot: viral vektörler ve hücre hatları burada açıklanan Vector Üretim Çekirdek Laboratuvarı, Diyabet Araştırma Merkezi, Baylor College of Medicine (edinilebilir http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731 ). Bazı ticari kitleri HDAd virüsler (örn. Microbix biosyst üretmek için de kullanılabilirems Inc).
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH hibe ile desteklenmiştir: R03 DK089061-01 (VKY); NIH: K08 DK068391 (VKY), Diyabet ve Endokrin Araştırma Merkezi-(DERC - P30DK079638) Baylor Tıp Koleji'nde, bir Pilot & Fizibilite hibe DERC (VKY); Juvenil Diyabet Araştırma Vakfı: JDRF Ödülü # 5-2006-134 (VKY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ProFectionR Mammalian Transfection kit | Promega | E1200 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit (50) | Qiagen | 69504 | |
| PerfeCTa SYBR Green SuperMix, ROX | Quanta Biosciences | 95055-500 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750-25G | |
| MEM powder | Invitrogen | 61100087 | |
| Penicillin Streptomycin | Sigma | 15140122 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Hygromycin B | Sigma | H0654-1G | |
| MEM EAGLE JOKLIK | Sigma | M0518-10L | |
| Rnase | Roche | 10109169001 | |
| DNase I, grade II | Roche | 10104159001 | |
| Streptozocin | Sigma | s0130 | |
| Glass spinner flasks | Corning | 4500-3L | |
| Glass spinner flasks | Corning | 4500-250 | |
| Slide A-lyzer casset | PIERCE CH | PI66380 | |
| Tube optiseal poly allomer, 11.2 ml | Beckman Coulter | 362181 | |
| Cesium chloride 1 kg | JT4042-2 | VWR | |
| Beckman LE-80K | Beckman Coulter | Optimal LE-80K ultracentrifuge | |
| Filter | VWR | 28143-338 | |
| centrifuge tube 500 ml | Corning | 431123 | |
| tailveiner restrainer | Braintree scientific , INC | tv-150 | |
| Insulin, Mouse ELISA | Mercodia | 10-1247-01 | |
| microvette CB300 | Sarstedt | 16.443.100 | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| Mouse C-peptide ELISA Kit | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | #631-07231 | |
| guinea pig anti-insulin antibody | Abcam | ab7842 | |
| goat anti-Pdx1 antibody | gift from Dr. Christopher Wright | ||
| mouse anti Ngn3 antibody | Beta Cell Biology Consortium, Univ. of Pennsylvania |
AB2013 | |
| mouse anti Nkx6.1 antibody | Beta Cell Biology Consortium, Univ. of Pennsylvania |
F64A6B4 | |
| anti- betacellulin antibody | Cell Sciences | PAAQ1 | |
| ALT (SGPT) Color Reagent SET. | Teco Diagnostics | A526 - 120 | |
| AST/(SGOT), Color Endpoint Reagent Set | Teco Diagnostics | A561-120 | |
Table 2. Specific Reagents and Equipment. |
|||
References
- Parks, R. J. A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 13565-13570 (1996).
- Kim, I. H., Jozkowicz, A., Piedra, P. A., Oka, K., Chan, L. Lifetime correction of genetic deficiency in mice with a single injection of helper-dependent adenoviral vector. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13282-13287 (2001).
- Belalcazar, L. M. Long-term stable expression of human apolipoprotein A-I mediated by helper-dependent adenovirus gene transfer inhibits atherosclerosis progression and remodels atherosclerotic plaques in a mouse model of familial hypercholesterolemia. Circulation. 107, 2726-2732 (2003).
- Oka, K. Long-term stable correction of low-density lipoprotein receptor-deficient mice with a helper-dependent adenoviral vector expressing the very low-density lipoprotein receptor. Circulation. 103, 1274-1281 (2001).
- Nomura, S. Low-density lipoprotein receptor gene therapy using helper-dependent adenovirus produces long-term protection against atherosclerosis in a mouse model of familial hypercholesterolemia. Gene Ther. 11, 1540-1548 (2004).
- Ng, P. A high-efficiency Cre/loxP-based system for construction of adenoviral vectors. Hum. Gene Ther. 10, 2667-2672 (1999).
- Palmer, D., Ng, P. Improved system for helper-dependent adenoviral vector production. Mol. Ther. 8, 846-852 (2003).
- Oka, K., Chan, L.
- Yechoor, V. Neurogenin3 is sufficient for transdetermination of hepatic progenitor cells into neo-islets in vivo but not transdifferentiation of hepatocytes. Dev. Cell. 16, 358-373 (2009).
- Yechoor, V. Gene Therapy with Neurogenin 3 and Betacellulin Reverses Major Metabolic Problems in Insulin-Deficient Diabetic Mice. Endocrinology. , (2009).
