Summary
La procedura è descritta per manipolare l'attività dei neuroni cerebrali corticali piramidali optogenetically mentre l'elettroencefalogramma, elettromiogramma, e cerebrale concentrazione di lattato sono monitorati. Registrazioni sperimentali vengono eseguite su cavo-frenati topi, mentre subiscono spontanee sonno / veglia cicli. Optogenetic apparecchiatura è assemblata nel nostro laboratorio, apparecchi registrazione è commercialmente disponibile.
Abstract
Sebbene il cervello rappresenta meno del 5% della massa del corpo, utilizza circa un quarto del glucosio utilizzato dal corpo a riposo 1. La funzione del sonno non REM (NREMS), la più grande porzione di sonno da tempo, è incerto. Tuttavia, una caratteristica saliente di NREMS è una riduzione significativa nel tasso di utilizzazione del glucosio cerebrale rispetto alla veglia 2-4. Questo ed altri risultati hanno portato alla convinzione diffusa che il sonno ha una funzione relativa al metabolismo cerebrale. Tuttavia, i meccanismi alla base della riduzione del metabolismo del glucosio cerebrale durante NREMS restano da chiarire.
Un fenomeno associato NREMS che potrebbero avere un impatto tasso metabolico cerebrale è la presenza di onde lente, oscillazioni a frequenze inferiori a 4 Hz, nel elettroencefalogramma 5,6. Queste onde lente rilevate a livello del cranio o cerebrali riflettono la superficie corticaleoscillazioni dei neuroni sottostanti tra uno stato depolarizzata / e uno stato iperpolarizzato / giù 7. Durante lo stato verso il basso, le cellule non subiscono potenziali di azione per gli intervalli fino a 100 diversi millisecondi. Restauro di gradienti di concentrazione ionici successivi potenziali d'azione rappresenta un carico significativo sul metabolismo della cellula 8; assenza di potenziali d'azione verso il basso durante stati associati NREMS può contribuire ad un metabolismo ridotto rispetto a svegliarsi.
Due sfide tecniche dovevano essere affrontate per questo rapporto ipotetico da testare. Prima, è stato necessario misurare cerebrale metabolismo glicolitico con una risoluzione temporale riflettente della dinamica del EEG cerebrale (cioè, più di secondi piuttosto che minuti). Per fare ciò, abbiamo misurato la concentrazione di lattato, il prodotto della glicolisi aerobica, e quindi una lettura della velocità del metabolismo del glucosio nel cervello di topi. Lattato eramisurata con un sensore basato lattato ossidasi tempo reale incorporato nella corteccia frontale. Il meccanismo di rilevamento costituito da un elettrodo di platino-iridio circondato da uno strato di molecole di lattato ossidasi. Metabolismo del lattato dal lattato ossidasi produce perossido di idrogeno, che produce una corrente in platino-iridio elettrodo. Così un dilagare della glicolisi cerebrale fornisce un aumento della concentrazione di substrato per lattato ossidasi, che poi si riflette in un aumento di corrente all'elettrodo di rilevamento. Era inoltre necessario misurare queste variabili mentre manipolando l'eccitabilità della corteccia cerebrale, in modo da isolare la variabile da altre sfaccettature NREMS.
Abbiamo messo a punto un sistema sperimentale per la misura simultanea di attività neuronale attraverso il elecetroencephalogram, misura del flusso glicolitico tramite un biosensore lattato, e la manipolazione di attività cerebrale corticale neuronale attraverso l'attivazione optogenetic di piramideneuroni Midal. Abbiamo utilizzato questo sistema per documentare la relazione tra sonno-correlati e le forme d'onda elettroencefalografica momento per momento dinamiche di concentrazione di lattato nella corteccia cerebrale. Il protocollo può essere utile per qualsiasi individuo interessato a studiare, a comportarsi liberamente roditori, il rapporto tra attività neuronale misurata a livello elettroencefalografico ed energetica cellulari all'interno del cervello.
Protocol
1. Preparazione chirurgica degli animali
1. I soggetti sperimentali
Utilizzare i topi del B6.Cg-Tg (Thy1-COP4/eYFP) 18Gfng / J linea transgenica 9; deformazione JAX # 7612) o di altri topi che esprime il blu sensibile alla luce canale cationico, channelrhodopsin-2, in neuroni corticali cerebrali. Applicazione di luce blu alla corteccia cerebrale del B6.Cg-Tg (Thy1-COP4/eYFP) 18Gfng / J linea transgenica fa sì che i neuroni piramidali che esprimono channelrhodopsin-2 per depolarizzare e sottoposti a potenziali d'azione 9,10. Come conseguenza dell'attivazione delle cellule piramidali, interneuroni locali sono attivati, e la variazione di potenziale viene propagata neuroni oltre il sito di stimolazione 10. Eseguire un intervento chirurgico in condizioni sterili in aderenza alle vigenti linee guida legislative: autoclave strumenti chirurgici e softpacks (campo chirurgico, garze); caldo tallone sterilizzare tutti calore ad elevata dispositivi metallici impiantati (cannule, viti e fili)per 30 secondi; Disinfettare dispositivi impiantabili calore intolleranti (cavo in fibra ottica, connettore di plastica) con un tuffo di 10 secondi in etanolo; colpo etanolo-tuffato articoli secco mediante l'applicazione di aria compressa.
2. Anestesia, posizionamento stereotassico e Liquidazione del Teschio
Utilizzare il IMPAC 6 integrato Multi paziente (Vet Equip Inc) sistema per anestetizzare il mouse. Utilizzare 5% Isoflurane/95% Ossigeno per l'induzione e il 3% di ossigeno Isoflurane/97% per la manutenzione durante l'intervento chirurgico. Posizionare l'animale su un ricircolo di acqua coperta impostato a 37 C. Non è necessario controllare la temperatura corporea se la coperta è mantenuta a questa temperatura.
3. Preparazione del Teschio per l'impianto
Preparare il sito di incisione con la rasatura tutte le pellicce dalla parte superiore del cranio. L'area rasata dovrebbe estendersi lateralmente da orecchio a orecchio e antero-posteriore dagli occhi fino alla fine posteriore del cranio. Disinfettare la pelle esposta con tre CONSECUTIVItamponi elettronici di betadine seguito da etanolo. Praticare un'incisione mediale sulla parte superiore del cranio, dalle tra gli occhi al retro del cranio. Pulire il cranio con perossido di idrogeno e soluzione salina sterile (0,9% NaCl). Controllare il sanguinamento con uno strumento di cauterizzazione. Individuare e contrassegnare bregma e lambda per determinare le coordinate stereotassiche. Coordinate stereotassiche per elettrodi / optogenetic configurazioni stimolo che abbiamo utilizzato sono riportati in Tabella 1 e illustrato schematicamente nella Figura 1A.
4. Preparazione dei siti d'impianto sul cranio
Utilizzare un trapano ad alta velocità dentale con un po '0,5 millimetri palla bava di stabilire ogni sito impianto nel cranio. Smussare il margine esterno di ciascun foro utilizzando una punta 0,7 millimetri palla bave per facilitare l'inserimento delle viti.
5. Inserimento e fissaggio di cannule, EMG Cavi e cavi EEG
Inserire le viti EEG (0,8 mm di lunghezza, con 2 cm di naturale 30-calibro-rame stagnato bus fili pre-saldato a vite testa) nei fori e spingerli in con una mano cacciavite a taglio di circa 4-5 giri per ottenere la profondità desiderata. Tenere cannule guida in posizione con un supporto stereotassica cannula e poi applicarle al cranio e ancoraggi con cemento acrilico. Ogni cannula guida deve contenere un manichino cannula / mandrino (Materie plastiche Uno, parte # C312 DC \ 1) dal momento dell'intervento chirurgico al tempo della sperimentazione (10-14 giorni) per mantenere la pervietà.
6. Chiusura del sito chirurgico
Una volta EEG e cannule guida sono posizionati nel cranio, collegare insieme con cemento acrilico dentale (Lang Dental - Ortho-Jet cemento). Dopo il set di cemento, posizionare il connettore di plastica (parte tecnologia Pinnacle # 8402) al di sopra del tumulo di cemento secco. Saldare le estremità dei fili provenienti dalla porta EEG ai contatti del connettore di plastica. Racchiudere i conduttori in cemento. Quindi disegnare i fili EMG attraverso il muscolo nucales facendoli scivolare nel cilindro di un ago 21ga trafitto muscolare. Cravatta nodo un chirurgo doppio di 5-0 sutura in nylon intorno a questi fili appena distalmente al cui esce il muscolo. Suturare insieme la pelle che è stata ritratta per accedere al tessuto muscolare con singoli nodi chirurgo interrotto, con una inversione di taglio P-3 e 5-0 aghi sutura in nylon.
7. Analgesia post-operatoria e ripristino
Somministrare buprenorfina come analgesico (0,1 mg / kg, per via sottocutanea) e flunixin meglumina (0,1 mg / kg, per via sottocutanea) come un anti-infiammatorio immediatamente dopo l'intervento chirurgico, e al giorno nei giorni 1-2 post-intervento chirurgico. Consentire agli animali di recuperare in condizioni standard abitative colonia per almeno sette giorni prima della sperimentazione. Senza cura supplementare al di là custodia colonie standard, cannule ci si può aspettare di rimanere brevetto per almeno due settimane con i mandrini interiori fissato in posizione. Sensori EEG e EMG può anche essere previsto per conservarefunzionalità per tutta la durata.
2. Generazione di impulsi temporizzato Luce
1. Programmazione dell'unità Stimolo MC
Collegare l'MC-stimolo unità (sistemi multi-canale) tramite un collegamento USB a un computer desktop. Utilizzare il foglio di calcolo simile a MC-stimolo interfaccia utente per programmare l'unità MC stimolo. Inserire il desiderato TTL (Transistor-Transistor Logic) di tensione per il periodo on, le durate di impulso e fuori periodi, il numero di cicli al secondo desiderati, e il numero totale di cicli ripetuti per l'intera sessione di stimolo. Per ulteriori dettagli, vedere MC-stimolo manuale tecnico:
3. Produzione / Assemblaggio di fibra ottica PrOBE per la consegna della luce alla corteccia cerebrale
- Forniture e le apparecchiature necessarie sono disponibili all'indirizzo: http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf
- Taglio e lucidatura di cavi in fibra ottica. http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf
4. Montaggio del sistema di stimolazione Optogenetic roditori
1. Interfaccia di MC-Stimolo e Laser
Una volta che la MC-stimolo unità è programmata, eseguirlo come uno stand-alone generatore di segnali di un 5-Volt binario segnale ON / OFF. Collegare l'MC-stimolo unità alla abilitato di potenza del laser TTL con connettori BNC.
2. La produzione di uscita laser con cavo in fibra ottica
Utilizzare il display digitale e variabile quadrante potenza dell'unità di potenza del laser manualely regolare la potenza del laser. Collegare l'unità di potenza del laser per il laser per mezzo di un cavo a nastro. Collegare la femmina FC (ghiera connettore) Adattatore fibra del laser al connettore maschio FC sul cavo in fibra ottica di patch (a 3 m di lunghezza, 200 micron di diametro di fibra di vetro rivestita di conduzione in luce riflessa acrilato rivestimento polimerico).
3. Trasporto il laser per l'animale: Commutatore rotante
Collegare il cavo a fibre ottiche di origine (3 m di lunghezza) e il cavo a fibre ottiche di consegna (45 cm di lunghezza) a estremità opposte del giunto rotante ottica che incassa due lenti collimanti (lenti doriche). La fibra ottica giunto rotante serve come commutatore: l'animale si muove sulla sua gabbia, il giunto rotante ruota per prevenire la rottura dei cavi in fibra ottica. Utilizzare fascette in plastica per fissare il commutatore ad un metallo stare collocato sopra la gabbia cilindrica in cui è alloggiato l'animale.
4. Collegamento in fibra ottica di consegnaCavo a Testa
Frena il mouse con una sola mano per bloccare il mouse sotto una palma a coppa. Orientare la testa tra centro dello sperimentatore e l'indice. Rimuovere la cannula fittizia dalla cannula guida posizionato per la cannula in fibra ottica. Deselezionare la cannula guida di detriti utilizzando un ago sterile 25ga. Inserire il cavo in fibra ottica a mano e fissarlo alla cannula guida ottica fibra con un tappo a vite filettato recuperato da una cannula manichino. Controllare la profondità di inserimento del cavo in fibra ottica nel cervello da un nodo sutura legato sul cavo a fibra ottica ad una distanza fissa dal piatto spaccati end. L'apparato sperimentale è mostrato in Figura 1B.
5. Misura di EEG definito sonno e concentrazione di lattato durante la stimolazione Optogenetic
1. Precalibration del sensore Lattato
Pre-calibrazione del sensore lattato viene eseguita con un in vitroKit (parte Tecnologia Pinnacle # 7000-K1-T). Il sensore è equilibrata in tampone fosfato (pH 7,4), quindi esposto a tre concentrazioni di L-lattato in modo graduale per i protocolli del produttore.
2. Inserimento del sensore di lattato e cavo EEG
Inserire il sensore pre-calibrato nel cranio montato cannula guida lattato in maniera identica alla procedura di cavo in fibra ottica di inserimento (paragrafo 4.4). Collegare il sensore del lattato al preamplificatore del biosensore 8400 Pinnacle bipolari con connettori a spina. Unire questo preamplificatore al connettore a 8 pin sul headmount chirurgicamente impiantati.
3. Stabilire intensità dello stimolo Optogenetic
Prima della raccolta dei dati, utilizzare l'intensità del laser manopola di controllo per regolare l'intensità dello stimolo optogenetic. L'ampiezza della risposta EEG varierà tra animali, a causa di fattori che non sono stati studiati sistematicamente, un d deve essere verificata mediante ispezione visiva al momento della comparsa della stimolazione. In pratica, una intensità di 80-120 μWatts genere produrre un aumento dell'ampiezza EEG di circa il 50% alla frequenza di stimolazione. Post-hoc analisi trasformata di Fourier veloce (vedere paragrafo 5.5) è necessario quantificare la grandezza assoluta della risposta.
4. Raccolta dei dati
Raccogliere i dati utilizzando il sistema di Pinnacle 8400: http://pinnaclet.com/pal-8400.html .
5. Elaborazione dati con Neuroscore
Classificare dormire stati mediante ispezione visiva dei dati EEG e EMG con l'interfaccia Neuroscore (DataSciences, internazionale: http://www.datasci.com/products/software/NeuroScore_CNS_Software.asp ) o l'interfaccia Sirenia (Pinnacle Tecnologia:f = target "http://www.pinnaclet.com/sirenia.html" = "_blank"> http://www.pinnaclet.com/sirenia.html). Dati di processo in dieci secondi epoche come scia, non rapidi movimenti degli occhi del sonno, o rapidi movimenti degli occhi del sonno sulla base di EEG e EMG. Salvare i dati come fogli di calcolo Microsoft Excel per ulteriori analisi e test statistici.
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Representative Results
Come mostrato in figura 2, un mouse per la stimolazione optogenetic e lattato / EEG / EMG la raccolta dei dati sono stati sottoposti spontanee sonno / veglia transizioni di stato, mentre EEG, EMG e la concentrazione di lattato cerebrale sono stati monitorati in continuo. Corrente del sensore di aumento della lattato durante i periodi di bassa ampiezza EEG e una diminuzione durante i periodi di alta ampiezza EEG. Come mostrato in figura 3, entrambi i canali del EEG sono sensibili agli stimoli optogenetic forniti nella corteccia frontale.
Figura 1. A) Rappresentazione schematica degli elettrodi impiantati chirurgicamente-EEG, sensore lattato e cannula per la stimolazione optogenetic. B) Rappresentazione schematica del sistema sperimentale. 1, piombo EEG 1. 2, piombo EEG 2. Gnd, vite di terra EEG. Ref, vite di riferimento EEG.tp :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/4328/4328fig1large.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per ingrandire la figura.
Figura 2. Esempio raccolta dati dimostrano che l'animale transizione in e fuori dal sonno mentre strumentato per registrazioni utilizzando il biosensore / optogenetic configurazione dello stimolo visto nella Figura 1A. Stimolazione Optogenetic non è stato applicato durante l'intervallo mostrato qui. Wake (W) e due sottotipi di sonno, sonno rapido movimento degli occhi (R) e non rapidi movimenti oculari sonno (N) sono definite in base dell'elettroencefalogramma (EEG) e l'elettromiografia (EMG). Alta ampiezza EMG accompagnata da bassa ampiezza EEG definisce scia. Bassa ampiezza EMG accompagnata da bassa ampiezza EEG definisce rapido movimento degli occhi del sonno. Bassa ampiezza EMG accompagnata da elevata ampiezza EEG definisce non rapidi movimenti degli occhi del sonno. Lattatobiosensore corrente aumenta in funzione di bassa ampiezza EEG (cioè., sia durante il sonno veglia e rapido movimento degli occhi) e cade in funzione della ampiezza elevata EEG (cioè., durante il sonno non rapidi movimenti degli occhi).
Figura 3. Dati indicativi di animali sottoposti a stimolazione optogenetic a 1 Hz (A) o 10 Hz (B) utilizzando il biosensore / optogenetic configurazione dello stimolo visto in Figura 1A. Tracce rappresentano il 60-sec registrazioni. I tempi di un intervallo di 30 secondi di stimolazione è indicata nella parte superiore di ogni pannello. Clicca qui per ingrandire la figura .
| Frontale stimolazione-Rel Bregma (mm) | |||
| Ant / Post | Lat | D / V | |
| EEG1 | 2,2 | 1,6 | - |
| EEG2 | 2,2 | -1,6 | - |
| Riferimento | -3,5 | -1,5 | - |
| Terra | -3,5 | 1,5 | - |
| Cannula lattato | 1,0 | 1,6 | -0,5 |
| Optogenetic Cannula | 1,0 | -1,6 | -0,5 |
Tabella 1. Stereotassica coordinate dei dispositivi impiantati chirurgicamente.
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Discussion
I metodi qui presentati permettono di misurare la relazione tra sonno e cambiamenti nella concentrazione cervello del lattato glicolitico intermedio su una scala di tempo non possibile in precedenza. Gli animali sottoposti spontaneamente delle transizioni tra veglia, NREMS e REMS. Inoltre, siamo in grado di applicare stimoli optogenetic mentre gli animali sottoposti a queste transizioni. I dati raccolti fino ad oggi dimostrano che l'impatto sia spontanea che indotta onde sulla lettura di un lattato ossidasi a base di biosensore.
Si potrebbe costruire sistemi sperimentali simili a quello descritto qui con attrezzature e software da altre fonti. Fonti alternative di sistemi polisonnografici adatti per i roditori sono dati Sciences International 11 e Embla 12. Software per la classificazione dello stato di sonno è disponibile da Somnologica 12, 13 e sonno Iscriviti Icelus 14. Biosensori amperometrici per la misura del lattatosono disponibili da Quanteon 15. A nostra conoscenza, Pinnacle Technology offre l'unico sistema in cui biosensori, EEG e EMG possono essere misurate simultaneamente con un'unica interfaccia software.
Abbiamo misurato variazioni sia la concentrazione di lattato e distale EEG al sito di stimolazione optogenetic. Effetti della stimolazione optogenetic a tali siti distali conferma che eventuali cambiamenti indotti optogenetically vengono propagate oltre il sito di stimolazione. Si potrebbe misurare questi parametri direttamente nella zona della corteccia esposta alla luce, ma misurare altrove assicura che le risposte sono dovuti a propagazione dell'onda, al contrario di una risposta artefatta del biosensore per esposizione alla luce (come documentato 16). Optogenetically indotte 1-Hz onde sono distinti da onde sonno lento in quanto non sono sincronizzati da sottocorticali neuroni sporgenti. Come tali, essi non si verificano nei rapporti stereotipati temporale con altri legati al sonnofenomeni, come mandrini e complessi K 17. Se la stimolazione optogenetic imita altri effetti naturali di onde lente (ad esempio cambiamenti nella forza sinaptica 18 o cambiamenti omeostatici in EEG attività ad onde lente 11) è incerto. I metodi qui descritti possono essere usati per affrontare la questione in studi futuri.
Gli animali sono legati da entrambi i fili di trasporto biopotenziali da animale al computer e il cavo in fibra ottica che trasmette la luce blu nella corteccia cerebrale. Entrambi i fili EEG / bioanalyte sistemi di registrazione (http://pinnaclet.com/biosensor-recording-sys/fixed-frequency.html) e dispositivi wireless stimolazione optogenetic 19 sono stati segnalati. Tuttavia, i due non sono stati integrati in un unico sistema di lavoro a nostra conoscenza. Nonostante il sistema di ritenuta associata con un cavo tethering, gli animali sono spesso visto muoversi loro gabbie, e la quantità di tempo trascorso dormendo è tipico di topi studiati in sanaloghe sui situazioni sperimentali. Sensori compatibili con questo sistema sono disponibili per la misurazione della bioanalytes altri, tra cui glucosio e glutammato. Il sistema è quindi probabile che sia utile in altre situazioni sperimentali in cui il comportamento, vengono analizzate le concentrazioni di EEG e bioanalyte.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
La ricerca finanziata dal Dipartimento della Difesa (Defense Advanced Research Projects Agency, Premio Facoltà giovane, il codice di autorizzazione N66001-09-1-2117) e NINDS (R15NS070734).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BASi Mouse Guide Cannula | Pinnacle Technology/BASi Inc | 7032 | |
| Lactate Biosensor | Pinnacle Technology | 7004 | |
| Head Mount | Pinnacle Technology | 8402 | |
| Sleep/Biosensor Recording system | Pinnacle Technology | 8400-K1-SL | 2 EEG channels, 1 EMG channel, & 1 biosensor |
| Tethered Mouse in-vitro Calibration kit | Pinnacle Technology | 7000-K1-T | |
| Fiber Optic Guide Cannula | Plastics One | C312G | 21 Gauge Guide Cannula |
| Dummy Cannula | Plastics One | C312DC | 21 Gauge Dummy |
| Diamond Fiber Scribe | Thorlabs | S90W | |
| Fiber Connector Crimp Tool | Thorlabs | CT042 | |
| Furcation Tubing | Thorlabs | FT030 | 03.0 mm |
| Thorlabs | T10S13 | Max Dia. 0.012 | |
| Furcation Tube Stripper | Thorlabs | FTS3 | |
| Bare Hard Cladding Multimode Fiber | Thorlabs | BFL37-200 | 200 μm Core, 0.37 NA |
| Wire Snips/Kevlar Shears | Thorlabs | T865 | |
| Fiber Optic Epoxy | Thorlabs | F112 | |
| Fiber Stripper Tool | Thorlabs | ||
| Glass Polishing Plate | Thorlabs | CTG913 | |
| Rubber Polishing Pad | Thorlabs | NRS913 | |
| Eye Loupe | Thorlabs | JEL10 | |
| Kim Wipes | Thorlabs | KW32 | |
| Compressed Air | Thorlabs | CA3 | |
| Polishing Puck | Thorlabs | D50-xx | |
| Fiber Inspection scope | Thorlabs | CL-200 | |
| Polishing Films | Thorlabs | LFG5P, LFG3P, LFG1P, LFG03P | |
| FC/PC connector end | Thorlabs | 30126G2-240 | 240 μm Bore, SS Ferrule |
| MC Stimulus Unit | Multi-Channel Systems | STG-4002 | |
| MC Stimulus Software | Multi-Channel Systems | MC-Stimulus V 2.1.5 | |
| Blue Laser | CrystaLaser | CL473-050-0 | |
| Laser Power supply | CrystaLaser | CL2005 | |
| Fiber Optic Rotary Joint | Doric Lenses | FRJ-v4 | |
| Table 2. Supplies and equipment. | |||
References
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