血管疾患の研究のためのマウスにおける同所性大動脈移植

Summary

我々は、マウスからの腹部大動脈の部分がちょうど同種もしくは同系レシピエントにおける腎動脈下に同所移植する技術が記載されている。この手法は、均一な大きさの大きな動脈の移植が有利と認められる研究に役立つことがあります。

Abstract

マウスで吻合を伴う血管の手順は、一般的に困難であり、個々の外科医の技量に大きく依存すると考えられている。これは主に真であるが、これらの手続きの難しさを軽減し、再現性を高めることができる重要な原則がいくつかあります。同所性大動脈移植は、それが唯一の2つのエンド·ツー·エンドの吻合を伴うため、これらの原則を学ぶためにいる優秀な手順ですが、一貫性のある成功のための良好な縫合技術や船舶の取り扱いを必要とします。この手順では、レシピエントにおけるネイティブ大動脈の分裂が続くドナー動物から腹部大動脈の長さの調達から始まります。調達大動脈は、その後、受信者の大動脈の分割端部の間に配置され、エンドツーエンドの吻合を用いて、所定の位置に縫合する。この目的を達成するために首尾よく集中度の高い、優れたツール、着実に手、そしてどのように簡単に感謝の意を必要とするマウスの血管系は、血栓症で、その結果、破損することがあります。これらの重要な原則を学ぶことは、小型げっ歯類ではマイクロサージェリーを学習する際に最も初心者向けの時間を占めているものです。このプロトコルでは、私たちはこれらの重要なポイントを参照してください。このモデルは^{、1から8まで}の異なる実験系の様々な血管疾患を研究するために使用することができます。ここに示されている文脈では、それはほとんどの場合、移植後血管疾患、内膜肥厚は、同種移植片内で発生する固形臓器移植の共通の長期合併症の研究のために使用されます。モデルの主な利点は、それが定量的な形態学的解析を容易にし、移植された容器は、追加の制御⁹として役立つことができる内因性容器に隣接する位置していることです。ここに示されている技術は、ほとんどの場合18〜25グラムの重量を量るマウスに使用されます。我々は、C57BL/6J、BALB / CJ、とのC3H/HeJ株を用いて、我々の経験のほとんどを蓄積してきました。

Protocol

1。術前準備

1. 外科的処置は、慎重に行う方法に関係なく、大きなストレスになりません。このようなストレスの影響を最小限に抑えるため、埋蔵量を最大化するために、動物を使用^10,11前に少なくとも72時間ビバリウムで維持されるべきです。
2. 手術器具、ガーゼ、綿棒とは、無菌でなければならない。これは、楽器のタッチ縫合または術野の唯一のヒントを提供滅菌手袋を使用する必要はありません。
3. 止血のためには、クランプ圧力は必要最小限であることが不可欠です。過度の圧力や乱暴な取り扱いに起因する血管への損傷は後肢の麻痺、腸管虚血、および24時間以内の死亡で、その結果、血栓症の原因になります。我々はこれ以上より2グラム/ cm ²の圧力でクランプを使用することで問題を解消することを見出した。これらのクランプは、 表1に記載されています。クランプ圧は高品質外科instrumen製クランプの仕様に示されているトンメーカー。我々は安価なクランプや使い捨てのクランプが普遍的にあまりにも多くの圧力をかけることを見出した。
4. 側副血行路と同様に腹部大動脈の相対的な位置と下大静脈（IVC）の場所は、ひずみに依存しています。また、特に側副血行路の場所に、個々のマウスの間に小さな変化を見つけるでしょう。

2。ドナー操作

1. マウスは、イソフルランで麻酔（1.5から2.5パーセント誘導、空気中の1.0％メンテナンス）または（55から65 mg / kg）をペントバルビタールとすることができます。ペントバルビタールは、制限時間を設定します（1.5時間）が課されますが、必要であれば、より良いアクセスのために動物を回転させるというオプションを外科医に提供しています。麻酔時間が手術中に腸や肝臓に必要なときに麻酔薬を2,3滴を配置することにより、最大2時間まで延長することができる。ケタミン/キシラジン（ケタミンおよびキシラジン、ipの7 mg / kg投与では100 mg / kg体重）もよく訓練された外科医CAで使用することができますnは1から1.5時間以内に手続きを完了するが、それは狭い安全な用量範囲を持っています。米国では、ペントバルビタールの使用が短いため物資の近年では、より問題となっています。それは、麻酔の深さは、それが十分であることを確信しているように監視することが不可欠です。つま先のピンチ反射は十分な深さの最良の指標ですが、1つはまた、同様に呼吸速度と他の動きに注意する必要があります。
2. 麻酔導入後、腹側腹部の毛を除去するために、脱毛ゲルやシェーバーを使用しています。
3. スプレッドeagled位置に保持するために実験室のテープを使用してオペレーティング·ボード上の動物をマウントします。金属製のオペレーティング·ボードには、手術中に温度のサポートを提供するために、その下に加熱パッドの使用を可能にします。我々は、手動で家庭用消費者グレード単位で加熱パッドの温度を制御します。温度は35から38℃の間に維持される。金属製のオペレーティング·ボードには、プロシージャ間で滅菌することは容易である。
4. クロルヘキシジンのような消毒剤を使用して、領域を消毒、エタノール洗浄が続く。適切な消毒を確実にするために、この手順を3回繰り返します。存在しているなら、これはまた、髪の残留切断片を除去します。
5. 使用したはさみは腹部内臓を露出させるために体壁を通して切開を行います。
6. 腹部の大血管を露出する側に内臓をオフにプッシュ、綿棒を使用しています。内臓は、それが湿った保つために温かい生理食塩水で湿らせたガーゼの上に置いています。
7. 鈍的切開を使用して、非常に慎重に離れて周囲の組織から腹部大動脈を解剖。下大静脈から血管を解剖では、十分に注意してください。など慎重に持ち上げて、焼灼されている必要があり腰動脈のような1つ以上のブランチが存在するであろう。解離した大動脈のセクションでは、腎血管の下と大腿動脈に大動脈分岐以上にしてください。このセクションでは、できるだけ多くのためのドナー材料として機能することができる分岐血管が存在しており、ドナー動物の大きさに応じてどのように多くの2人の受信者、。
8. ちょうど分岐上記の腎動脈と別の下に縫合糸を結ぶ。使用してハサミが大動脈を分断、完全に200 U / mlのヘパリンを含有する生理食塩水で移植をすすいでください。非常に慎重に容器の一方の端を保持し、それが重力によって血管を通って実行されるように生理食塩水を滴らせる。気泡が血管を介して実行させてはいけない。後で血栓が生じる内膜が損傷することがありますそうでなければはできるだけ容器の端を処理します。フィールドからそれを削除し、直ちに氷冷した生理食塩水の容器に入れてください。ドナー動物の血を抜くすることができます。

3。受信者動作

1. 上記のように動物を麻酔し、脱毛ゲルを適用したり、腹部の毛を除去するためにシェーバーを使用しています。切開直前に我々は、鎮痛効果を確立するために0.1 mg / kgで皮下ブプレノルフィンの用量を投与する。
2. Mount実験用テープを使用してオペレーティング·フィールド上の動物。動物は、動作中に体温を維持するのに役立ちます温かいオペレーティングステージにマウントする必要があります。
3. 乾燥からそれらを防ぐために目にゲンタマイシン眼軟膏を適用します。
4. エタノール洗浄が続く腹部を消毒してください。適切な消毒を確実にするために、この手順を3回繰り返します。
5. 次のステップに進む前に、もう一度麻酔の妥当性をチェックします。
6. 下組織に衝突しないように注意して、2段階で肌や身体の壁を通って正中切開を行います。
7. 腹部切開が開いて保持するためにスプレッダを挿入します。道のクランプのバルクが入らないように後肢終わりに向かってスクリューアセンブリを指すようにします。
8. 生理食塩水を滅菌ガーゼの正方形を濡らし、腸の上に置きます。ガーゼでそっと指で、腸の下に綿棒を差し込んで、静かにsに腸を上に反映IDEには、そう、彼らはガーゼの上に座っている。ガーゼの別の部分を取り、腸の上に置きますと、生理食塩水でそれを濡らす。
9. 大動脈と下大静脈（IVC）を覆っている脂肪組織を削除します。穏やかなこと。 IVCは非常に壊れやすいです。
10. 優しくIVCから大動脈大動脈を切開する鉗子を使用しています。それらの間に十分な血管ように2つのクランプのための部屋を提供するのに十分な大きさの領域をクリアするには、分割されたときに、移植片を縫合することができるために十分な血管があるでしょう。解剖すると、血管枝を探します。必要であれば、低温cauterizerでそれらを焼灼する。
11. ちょうど分岐上記の腎動脈と別の1以下に血管クランプを挿入します。
12. 大動脈を切った。大動脈の末端は、通常、約5mmのスペースを残して、後退します。止血を確認してください。クランプが正しく動作している場合は、血液の量が少なく、カットした後にエスケープする必要があります。出血が続く場合は、何も干渉されていないことを確認するために、クランプをチェック彼らとING。大動脈のどれが削除されていないことに注意してください。それは単に分割されています。
13. ヘパリン加生理食塩水で切断端部（200 U / ml）を洗い流してから綿棒で余分な液を除去する。
14. 各端で3不連続縫合糸を用いて所定の位置にタックを移植。ちょうど各端に吻合部の片側を縫合した後、連続運転縫合以上の不連続縫合糸で残りを埋める。 7〜8不連続縫合糸で十分です。あなたが実行している縫合糸を使用した場合、血管壁は、リラックスしたままで、あなたは吻合で狭窄を起こさないことを確認してください。
15. 慎重に頭蓋端にクランプを取り外し、縫合線に漏れがないかを探します。湧水の少量はOK、それが約分以内に停止し提供しています。それ以上があるとすれば、それは出血を止めるためにシングルステッチを使用することが可能です。
16. そっと濡れた綿棒で吻合部大動脈上に押し、次に2番目のクランプを外します。そっと押して、時代のカップルを解放し、大動脈が特許されることを確認します。移植片は、直ちに灌流され、パルスが見えるはずです。
17. 腸を覆っているガーゼを外し、代わりにそれらを戻します。腸のねじれを回避し、正常な解剖学的配向を維持する。
18. 5から0 VICRYLを使用して筋層を閉じます。
19. 5から0または6から0プロレンを用いて皮膚を閉じます。
20. 麻酔を終了する前に鎮痛効果を増強するために5 mg / kgでcarprophenを皮下マウスを扱う。
21. マウスの皮下に生理食塩水0.5〜0.8ミリリットルを与える。
22. 回復するために加熱されたケージにマウスを置きます。それが正常に回復していることを確認するためにリカバリ時にそれを注意深く監視する。手術後2〜3時間は、マウスは、比較的正常に動作しなければなりません。 12時間後のオペアンプでは、鎮痛のために2 mg / kgで皮下ブプレノルフィンで動物を扱う。いつでも、動物が猫背された場合は、ノイズを作ったり、動きの制限された範囲を示す、問題を調査してください。場合決定的な原因が確立して固定することができず、動物は、制度のプロトコルごとに安楽死させなければならない。 24時間後に動物は、5 mg / kgで皮下carprophenの別の線量を受けるべきである。後肢麻痺が失敗した吻合または血栓を示します。この状況では、動物を安楽死させなければならない。

Representative Results

図1は、大動脈移植片を示しています。白い矢印は、縫合線を示す。特許グラフトは、可視パルスが表示されます。 図2は、受信者の生存率は56日間にわたって続いている、典型的な実験であることを示します。一つのグループは、BALB / c大動脈を移植した野生型（C57BL / 6×FVB）レシピエントマウスから成っていた。 "KO"と称する他のグループは、24時間内グラフトの血栓症を生じるヘムオキシゲナーゼ-1の発現が欠損レシピエント（C57BL / 6×FVB）で構成されています。特筆すべきは、図に示すように、すべての受取人の死でこの結果。 図3が示すように正常な動物と移植レシピエントにおけるIVCと腹部大動脈の測定値をエコーします。移植片は、特許と非移植大動脈に外観が似ていることに注意してください。

図1。移植された大動脈の眺め。白い矢印は、縫合線を示す。

図2：BALB / cマウスの大動脈を移植したマウスの二つのグループの大動脈移植後の生存期間のKaplan-Meier描写。 "KO"は24から48時間以内で大動脈グラフトの血栓症を生じるヘムオキシゲナーゼ-1の発現が欠損し、受信者を指定します。 "WT"は野生型​​同腹子を指定します。より転載：一酸化炭素は同種大動脈移植、陳B、郭、L、Cのファン、Bolisetty S、ジョセフ·R·ライトMM、Agarwalさん、A、ジョージJFにおける動脈血栓症からヘムオキシゲナーゼ-1欠損マウスを救助する。 J病理をしています。 2009年07月、エルゼビアの許可を受けて、175（1）:422-9。

FigurE 3。下大静脈（IVC）と通常のマウス（左パネル）と大動脈移植レシピエント（右パネル） における in vivoでの腹部大動脈のイメージングをエコー。画像はVisualsonics VEVO 660楽器を製造した。アスタリスクは、血管の内腔を示す。

Discussion

マウスは非常によくimmunogenetically ^9,12,13定義されており、必要に応じてそれらを簡単に、特定の遺伝子の発現を変化させるように操作することができるので、大動脈移植のマウスモデルは、多くの利点を提供します。冒頭で述べたように、マウスの血管手術が原因の血管のサイズのほとんどのモデルよりも困難である。このような大動脈としても偉大な動脈は、通常、内径100〜200ミクロンにすぎない、ので、これらの船を操作するスキルと器用^8,14かなりの量を必要とします。単にシステムを実装するために始めたもので、この手術で観察された最も一般的な合併症は、通常、乱暴に扱ったり、クランプすることで内膜の損傷に起因する血栓症によって引き起こされる、後肢の麻痺です。マイクロサージェリーが25グラム/ cm ²よりも通常高い圧力で、マウスを使用することには余りにも多くの圧力を作成するのに適したツールを販売している会社によって市販クランプのほとんど。 CLA我々が使用するMPSは2グラム/ cm ^2であり 、止血を達成すると血管を損傷しないだけで十分である圧力の圧力で、滑らかである。いくつかの外科医はむしろクランプより縫合糸を使用することを好む。それが正しい圧力を測ると、我々の見解では、低い成功率に貢献できる外科医の能力に大きく依存している方法であるため、この方法はお勧めしません。練習すれば、90％以上の生存率が期待されるべきである。

エンドツーエンドの吻合のためのテクニックを縫合すると経験で取得される重要なスキルです。外科技術と手先の器用さとの事前の経験に応じて、完全な習熟が50から100の手順の後に達成することができる。より最近の研究では、吻合のための代替技術が将来¹⁵に利用できるようになることを示唆している。

この手順の主な制約は、スキルの高いレベルであることを、マウスで最も顕微プロシージャと同様であり、優れた細かい運動スキルがなくても正常に実行され、個人のために必要では習熟度の高いレベルを達成しないことがあります。しかし、実際に、ほとんどの人は許容生存率を達成することができます。移植片のサイズが非常に小さいので、組織の規模が小さいことも追加の制約をもたらすので、その後の分析のための材料の量は制限されています。モデルの最大の利点は、 生体内分子メカニズムに対処するための非常に有用な実験を可能にする、マウスのよく特徴付けられた免疫遺伝学、多数の近交系、トランスジェニックマウスやノックアウトマウスの幅広い可用性です。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vascular Clamps	Fine Science Tools	00396-01 (Size B-1)
Dumont Forceps	Fine Science Tools	11293-00
10-0 Needled microsuture	AROSurgical	TK-107038
Straight scissors	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5620
Low temperature cauterizer	Beaver-Visitec International	8441000
Self retaining retractor	World Precision Instruments	14240