Transplante ortotópico de aorta em camundongos para o Estudo da Doença Vascular

Summary

Descrevemos uma técnica em que uma secção da aorta abdominal de um rato é transplantado ortotopicamente para um pouco abaixo das artérias renais de um receptor alogénico ou singeneicos. Esta técnica pode ser útil em estudos em que o transplante de grandes artérias de tamanho uniforme é considerada vantajosa.

Abstract

Procedimentos vasculares que envolvem anastomoses no ratinho são geralmente pensado para ser difícil e muito dependente da habilidade do cirurgião. Isto é principalmente verdadeiro, mas há um certo número de princípios importantes que podem reduzir a dificuldade de esses procedimentos e melhorar a reprodutibilidade. Transplante ortotópico aórtica é um procedimento excelente para aprender esses princípios, porque envolve apenas dois end-to-end anastomoses, mas requer boa técnica de sutura e movimentação dos navios para o sucesso consistente. Este procedimento começa com a obtenção de um comprimento de aorta abdominal de um animal dador, seguido pela divisão da aorta nativa do receptor. A aorta obtido é então colocado entre as extremidades divididas da aorta destinatário e suturados no lugar usando end-to-end anastomoses. Para atingir esse objetivo com sucesso requer um alto grau de concentração, boas ferramentas, uma mão firme, e uma apreciação de quão facilmente avasculatura de um rato pode ser danificado, resultando em trombose. Aprender esses princípios importantes é o que ocupa a maior parte do tempo o iniciante no aprendizado de microcirurgia em pequenos roedores. Ao longo deste protocolo, que se referem a esses pontos importantes. Este modelo pode ser utilizado para estudar a doença vascular numa variedade de diferentes sistemas experimentais ^1-8. No contexto mostrado aqui, que é mais frequentemente usado para o estudo de pós-transplante, doença vascular, uma complicação a longo prazo comum de transplantação de órgãos sólidos nos quais a hiperplasia da íntima ocorre dentro do aloenxerto. A principal vantagem do modelo é que ele facilita a análise morfométrica quantitativa e o vaso transplantado fica contíguo ao vaso endógeno, que pode servir como um controle adicional ^9. A técnica mostrada aqui é mais frequentemente usado para ratos pesando 18-25 gramas. Temos acumulado mais de nossa experiência usando o C57BL/6J, BALB / cJ e linhagens C3H/HeJ.

Protocol

1. Preparação pré-cirúrgica

1. Procedimentos cirúrgicos, não importa quão cuidadosamente feito, resultam em estresse significativo. Para minimizar os efeitos do stress, tais e de maximizar as reservas, os animais devem ser mantidos no biotério durante pelo menos 72 horas antes do uso ^10,11.
2. Instrumentos cirúrgicos, gaze, e compressas devem ser estéreis. Não é necessário o uso de luvas estéreis fornecem apenas as pontas do fio de sutura toque instrumentos ou do campo operatório.
3. Para hemostasia, é imperativo que as pressões de aperto são o mínimo necessário. Danos ao navio, devido à pressão excessiva ou manuseio irá causar trombose, resultando em perna traseira paralisia, isquemia do intestino e morte dentro de 24 horas. Nós descobrimos que a utilização de grampos, com uma pressão de não mais do que 2 gm / cm ² elimina o problema. Estes grampos são anotados na Tabela 1. As pressões de aperto estão indicados nas especificações para grampos feitos por instrumentação de alta qualidade cirúrgicosfabricantes de t. Nós descobrimos que as pinças ou grampos baratos descartáveis ​​universalmente exercer demasiada pressão.
4. A localização dos vasos colaterais, bem como as localizações relativas da aorta abdominal e a veia cava inferior (IVC) são estirpe dependente. Você também vai encontrar pequenas variações entre ratos individuais, especialmente no local de vasos colaterais.

2. Operação doador

1. Os ratos podem ser anestesiados com (1,5-2,5% de indução, manutenção de 1,0% em ar) isoflurano ou com pentobarbital (55-65 mg / kg). Pentobarbital impõe um limite de tempo (até 1,5 horas), mas fornece ao cirurgião a opção de girar o animal para um melhor acesso, se desejar. O tempo de anestesia pode ser alargado até 2 horas, colocando 2-3 gotas de anestésico, quando necessário para o intestino ou o fígado durante a cirurgia. De cetamina / xilazina (100 mg de peso corporal / kg de cetamina e 7 mg / kg de xilazina, ip) também pode ser utilizado por cirurgiões bem treinados que can concluir o procedimento dentro de 1 a 1,5 horas, mas tem um alcance mais estreito dose segura. Em os EUA, o uso de pentobarbital tornou-se mais problemático nos últimos anos por causa de abastecimento curtos. É imperativo que a profundidade da anestesia ser monitorada para ter a certeza de que é suficiente. O reflexo dedo pinch-é o melhor indicador de profundidade adequada, mas deve-se também observar a taxa de respiração e movimentos de outros também.
2. Após a indução da anestesia, use um gel depilatório ou uma máquina para remover pêlos no abdômen ventral.
3. Montar o animal na placa operacional usando fita laboratório para prendê-lo em uma posição de braços abertos. Uma placa metálica de funcionamento, permite o uso de uma almofada de aquecimento por baixo, para proporcionar o suporte da temperatura durante a cirurgia. Nós controlar manualmente a temperatura do bloco de aquecimento, que é uma unidade de consumo de grau para uso doméstico. A temperatura é mantida entre 35-38 °. A placa metálica operacional também é fácil de esterilizar entre os procedimentos.
4. Desinfectar a área com um desinfectante como clorexidina, seguida por uma lavagem com etanol. Repetir este procedimento três vezes, para assegurar a desinfecção adequada. Isso também irá remover quaisquer peças cortadas residuais de cabelo, se estiver presente.
5. Utilizando tesouras fazer uma incisão através da parede do corpo para expor as vísceras abdominais.
6. Use um cotonete, empurre as vísceras para o lado para expor os grandes vasos do abdômen. As vísceras são colocados sobre um pedaço de gaze, que é humedecido com solução salina quente a mantê-lo húmido.
7. Usando a dissecção romba, muito cuidadosamente dissecar a aorta abdominal para longe do tecido circundante. Tenha muito cuidado ao dissecar o navio longe da veia cava inferior. Haverá um ou mais ramos, tais como a artéria lombar, que tem de ser cuidadosamente levantados e cauterizados. A secção de aorta dissecada deve estar abaixo dos vasos renais e acima da bifurcação da aorta para as artérias femorais. Esta seção pode servir como material de doadores para o maior número des dois receptores, dependendo do número de vasos ramificando existir e o tamanho do animal dador.
8. Atar um fio de sutura, logo abaixo das artérias renais e outro um pouco acima da bifurcação. Tesoura utilizando dividir a aorta, enxaguar totalmente o enxerto com uma solução salina contendo 200 U / ml de heparina. Muito cuidadosamente segurar uma extremidade do recipiente e gotejamento a solução salina, de modo que ele é executado através do recipiente por gravidade. Não deixe que as bolhas de ar correr através do vaso. Lidar com as extremidades do recipiente tão pouco quanto possível de outro modo a íntima pode ser danificada, resultando em trombose posterior. Removê-la a partir do campo e imediatamente colocá-lo num recipiente de solução salina gelada. Permitir que o animal doador desangrar.

3. Operação destinatário

1. Anestesiar os animais como descrito acima e aplicar um gel depilatório ou usar uma máquina de barbear para remover os pêlos do abdómen. Pouco antes da incisão se administrar uma dose de buprenorfina por via subcutânea 0,1 mg / kg para estabelecer a analgesia.
2. Mount o animal no campo operacional usando fita laboratório. O animal deve ser montado em uma fase operacional quente que vai ajudar a manter a temperatura do corpo durante o funcionamento.
3. Aplicar pomada oftálmica de gentamicina para os olhos, para evitar que sequem.
4. Desinfectar o abdómen, seguido por uma lavagem com etanol. Repetir este procedimento três vezes, para assegurar a desinfecção adequada.
5. Verificar a adequação da anestesia, uma vez mais, antes de prosseguir para o passo seguinte.
6. Fazer uma incisão na linha média através da pele e da parede do corpo em duas fases, tendo o cuidado para não colidir com os tecidos subjacentes.
7. Insira um espalhador de realizar a incisão abdominal aberta. Apontar o parafuso de montagem para a extremidade traseira para manter a maior parte do grampo para fora do caminho.
8. Molhe um quadrado de gaze estéril com solução salina e coloque-o sobre os intestinos. Com o dedo suavemente sobre a gaze, inserir um cotonete sob os intestinos e gentilmente refletir os intestinos para o side que eles estão sentados em cima da gaze. Pegue outro pedaço de gaze, coloque-o sobre os intestinos e molhá-lo com soro fisiológico.
9. Remova qualquer tecido adiposo que cobre a aorta ea veia cava inferior (VCI). Seja gentil. A CIV é muito frágil.
10. Gentilmente utilize uma pinça para dissecar a aorta infra-renal da VCI. Limpar uma área suficientemente grande para fornecer espaço para as duas braçadeiras com vaso suficiente entre eles de tal modo que, quando dividido, haverá vaso suficiente para que o enxerto pode ser suturado. Ao dissecar, procure ramos dos vasos. Se necessário cauterizar os com um cauterizer temperatura baixa.
11. Insira uma pinça vascular logo abaixo da artéria renal e outro um pouco acima da bifurcação.
12. Corte a aorta. As extremidades da aorta normalmente irá retrair-se, deixando um espaço de cerca de 5 mm. Verifique para hemostasia. Se os grampos estão funcionando corretamente, apenas uma pequena quantidade de sangue deve escapar após o corte. Se o sangramento persistir, verifique os grampos ser nada certeza é interferênciação com eles. Note-se que nenhum dos aorta é removido. É meramente dividido.
13. Enxaguar as extremidades cortadas com solução salina heparinizada (200 U / ml) e, em seguida, remover a solução extra com um cotonete.
14. Tack o enxerto no lugar com três pontos descontínuos em cada extremidade. Apenas suturar um lado da anastomose em cada extremidade, e depois preencher o restante com uma sutura contínua execução ou mais suturas descontínuas. Sete a oito suturas descontínuas é suficiente. Se você usar uma sutura, certifique-se de que as paredes dos vasos permanecer relaxado e que você não causar estenose da anastomose.
15. Remova cuidadosamente o grampo no final do crânio e procurar vazamentos nas linhas de sutura. A pequena quantidade de infiltração é OK desde que pára dentro de cerca de um minuto. Se houver mais do que isso, é possível a utilização de um único ponto de parar a hemorragia.
16. Pressione suavemente sobre a aorta acima do local da anastomose com um aplicador de algodão molhado, e depois remover o grampo segundo. Pressione suavemente elançar um par de vezes e verifique se a aorta parece patente. O enxerto será imediatamente perfundidos e um impulso deve ser visível.
17. Remover a gaze que cobre os intestinos e movê-los de volta no lugar. Evite torção do intestino e manter a orientação anatômica normal.
18. Feche a camada muscular com Vicryl 5-0.
19. Feche a pele com 5-0 ou 6-0 prolene.
20. Tratar o rato por via subcutânea com carprophen a 5 mg / kg para aumentar a analgesia antes de terminar a anestesia.
21. Dar o mouse salina ml 0,5-0,8 por via subcutânea.
22. Posicione o mouse em uma gaiola aquecida para se recuperar. Monitorá-lo com cuidado durante a recuperação para ter certeza que ele está se recuperando normalmente. 2-3 horas após a cirurgia, o mouse deve estar se comportando relativamente normal. Às 12 horas pós-operatório, tratamento do animal com a buprenorfina por via subcutânea 2 mg / kg para a analgesia. Se, a qualquer tempo, o animal é curvado, fazendo barulho ou exibindo uma gama limitada de movimento, investigar o problema. Seuma causa definitiva não pode ser estabelecida e fixa, o animal deve ser sacrificado por protocolos institucionais. Às 24 horas o animal deve receber outra dose de carprophen subcutaneamente a 5 mg / kg. Paralisia das patas traseiras indica uma anastomose falhou ou trombo. Nesta situação, o animal deve ser sacrificado.

Representative Results

A Figura 1 mostra um enxerto aórtico. As setas brancas indicam as linhas de sutura. Um enxerto patente irá mostrar um impulso visível. Figura 2 indica uma experiência típica em que a sobrevivência foi seguida destinatário durante um período de 56 dias. Um grupo consistia de ratos receptores do tipo selvagem (C57BL / 6 x FVB) transplantados com ratinhos BALB / c da aorta. O outro grupo, designado "KO" consiste de receptores (C57BL / 6 x FVB) deficientes em expressão de heme oxigenase-1, o que resulta em trombose do enxerto dentro de 24 horas. Notavelmente, o que resulta na morte de todos os destinatários, como mostrado na figura. Figura 3 mostra as medições de eco da VCI e aorta abdominal de um animal normal e num receptor de transplante. Note-se que o enxerto é de patente e de aparência semelhante à da aorta não transplantado.

Figura 1.Uma vista de uma aorta transplantado. As setas brancas indicam as linhas de sutura.

Figura 2. Kaplan-Meier representações de sobrevivência após o transplante de aorta em dois grupos de ratos transplantados com aorta a partir de um ratinho BALB / c. "KO" designa destinatários deficientes na expressão de heme oxigenase-1, o que resulta em trombose dos enxertos aórticos dentro de 24-48 horas. "WT" designa os ninhada de tipo selvagem. Reproduzido de: monóxido de carbono resgata heme oxigenase-1-camundongos deficientes de trombose arterial na aorta transplante alogênico, Chen B, Guo L, Fan C, Bolisetty S, Joseph R, Wright MM, Agarwal A, George JF. Am J Pathol. 2009 Jul; 175 (1) :422-9 com a permissão da Elsevier.

Figure 3. Eco imagiologia da veia cava inferior (IVC) e aorta abdominal in vivo em um rato normal (painel da esquerda) e de um receptor de transplante de aorta (painel da direita). As imagens foram produzidas com um instrumento Visualsonics 660 Vevo. Os asteriscos indicam o lúmen dos vasos.

Discussion

Modelos do rato do transplante de aorta fornecer um número de vantagens, porque os ratinhos são muito bem definida imunogeneticamente ^9,12,13, e eles podem ser facilmente manipuladas para alterar a sua expressão de genes específicos, se desejado. Conforme referido na introdução, a cirurgia vascular em ratos é muito mais difícil do que a maioria dos modelos por causa do tamanho dos recipientes. Até mesmo os grandes vasos, como a aorta são geralmente não mais de 100-200 um de diâmetro interior, de modo a manipulação desses vasos requer uma quantidade significativa de habilidade e destreza ^8,14. A complicação mais comum observado em esta cirurgia por aqueles que estão começando a implementar o sistema é perna traseira paralisia, geralmente causada por trombose resultante da lesão de íntima por manuseio ou de fixação. A maioria dos grampos comercializados por empresas que comercializam ferramentas adequadas para microcirurgia criar demasiada pressão a ser usada para os ratinhos, com pressões geralmente superiores a 25 gm / cm ^2. O CLAmps que usamos são lisas, com uma pressão de 2 g / cm ^2, a pressão que é apenas o suficiente para alcançar a hemostasia e não danificar os vasos. Alguns cirurgiões preferem usar sutura em vez de grampos. Não é recomendável esta prática, porque é um método que é altamente dependente da habilidade do cirurgião para medir a pressão correcta e, na nossa opinião, contribuir para uma menor taxa de sucesso. Com a prática, as taxas de sobrevivência de 90% ou mais deve ser esperado.

Sutura técnica para as anastomoses fim-a-fim é uma habilidade crítica que se adquire com a experiência. Dependendo da experiência prévia com técnicas cirúrgicas e de destreza manual, proficiência completo pode ser obtida após a 50-100 procedimentos. Estudos mais recentes sugerem tecnologias alternativas para anastomoses podem se tornar disponíveis no futuro ^15.

A principal limitação deste procedimento é que, como a maioria dos procedimentos microcirúrgicos em ratos, que um elevado nível de habilidade énecessário para a execução bem sucedida e indivíduos sem excelentes habilidades motoras finas nunca pode alcançar um alto nível de proficiência. No entanto, com a prática, a maioria das pessoas pode atingir uma taxa de sobrevivência aceitável. O tamanho reduzido dos tecidos também resulta em limitações adicionais, porque o tamanho do enxerto é muito pequena, então a quantidade de material para análise subsequente é limitante. A maior vantagem do modelo é a imunogenética bem caracterizadas de ratos, a ampla disponibilidade de numerosas linhagens puras, camundongos transgênicos e ratos knockout, permitindo experiências muito úteis para abordar os mecanismos moleculares in vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vascular Clamps	Fine Science Tools	00396-01 (Size B-1)
Dumont Forceps	Fine Science Tools	11293-00
10-0 Needled microsuture	AROSurgical	TK-107038
Straight scissors	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5620
Low temperature cauterizer	Beaver-Visitec International	8441000
Self retaining retractor	World Precision Instruments	14240