Summary
Si introduce un nuovo metodo per il mantenimento della mucosa intestinale umana in coltura e monitoraggio della risposta a vari tipi di stimoli per almeno 24 ore. Con il nostro metodo, la polarità del tessuto sia conservato, consentendo una stimolazione fisiologica per via apicale.
Abstract
Pochi modelli attualmente esistenti per simulare realisticamente micro-ambiente del complesso di intestino umano, dove una varietà di interazioni hanno luogo. Omeostasi corretta dipende direttamente queste interazioni, come egli si forma un intero risposta immunologica indurre tolleranza contro antigeni alimentari, mentre allo stesso tempo di montaggio risposte immunitarie efficaci contro microbi patogeni ingeriti accidentalmente con il cibo.
Omeostasi intestinale è preservata anche attraverso varie complesse interazioni tra il microbiota (compreso cibo-associati ceppi batterici utili) e l'host, che regolano il fissaggio / degradazione del muco, la produzione di peptidi antimicrobici attraverso la barriera epiteliale, e la "istruzione" di cellule epiteliali 'che controlla il fenotipo tollerogenica o immunogenica di, unico budello residenti cellule linfoidi' popolazioni. Queste interazioni sono state finora molto difficile da riprodurre con saggi in vitroutilizzando sia linee cellulari coltivate o cellule mononucleari del sangue periferico. Inoltre, modelli murini differiscono sostanzialmente per componenti della mucosa intestinale (organizzazione strato di muco, batteri commensali comunità) rispetto nell'intestino umano. Così, gli studi di una varietà di trattamenti per essere portati nelle cliniche per le condizioni legate allo stress o patologiche importanti come la sindrome dell'intestino irritabile, malattie infiammatorie intestinali o il cancro del colon-retto sono stati difficili da realizzare.
Per affrontare questi problemi, abbiamo sviluppato un nuovo sistema che ci permette di stimolare espianti di mucosa intestinale umana che conservano la loro in situ condizionata dal microbiota dell'ospite e la risposta immunitaria, in modo polarizzato. Stimolazione apicale polarizzata è di grande importanza per l'esito della suscitato risposta immunitaria. E 'stato ripetutamente dimostrato che gli stessi stimoli possono produrre risposte completamente diverse quando bypassare la faccia apicale della epi intestinalethelium, stimolando le cellule epiteliali basolaterally o di contatto diretto con componenti lamina propria, passando il fenotipo da tollerogenico a immunogenica e causando infiammazione inutile ed eccessivo delle superfici.
Abbiamo ottenuto stimolazione polarizzata incollando un cilindro grotta che delimita la zona di stimolazione sulla faccia apicale della mucosa, come sarà descritto nel protocollo. Abbiamo utilizzato questo modello per esaminare, tra l'altro, gli effetti differenziali di tre diversi ceppi di lattobacilli. Mostriamo che questo modello di sistema è molto potente per valutare le proprietà immunomodulanti di probiotici in condizioni di buona salute e di malattia.
Protocol
1. Raccogliere ed elaborare i Tissue
- Tissutale (sano o IBD mucosa) è ottenuto durante la chirurgia. Una volta che il campione è escisse trasferimento al laboratorio non appena possibile, mantenendolo in Ca + + / Mg + + tampone HBSS privo integrato con Pen / Strep a 4 ° C o su ghiaccio.
* La dimensione del campione dipende dalla disponibilità del tessuto: la parte del tessuto ottenuto, è rigorosamente quello che non serve per la diagnosi e può variare notevolmente tra soggetti sani e IBD. Tessuto sano è asportato da pazienti sottoposti a intervento chirurgico per tumore del colon.
- Lavare il tessuto con delicatezza e pulirlo di tutto il materiale mesenterica. Separare lo strato di mucosa dalla sottomucosa usando forbici e pinze sterili mantenendo il tessuto in tampone HBSS in una capsula Petri (non necessariamente immerged). Toccare la superficie della mucosa con le pinze il meno possibile.
- Tagliare mucosa in strisce di almeno 1 cm di larghezza e più a lungo possibile. Utilizzare due bisturi sterili, tanto come se si stesse tagliando il cibo.
- Lavare pulire mucosa delicatamente in HBSS ed estenderla in una capsula di Petri con la parte apicale rivolta verso l'alto.
2. Montaggio del Tissue
- Preparare mezzo fresco (tisDMEM). Utilizzare DMEM integrato con glutammina (2 mM) e NaPyr (1 mm) e aggiungere il 15% FBS-Na (Fetal Bovine Serum - Nord America), 1% ITS-X e 200 ng / ml di EGF al momento dell'uso.
- Riempire un piatto di 10 cm di Petri con il resto della FBS-Na (utilizzare circa 30 ml modo che reti metalliche saranno completamente sommersi) ed immergere le griglie metalliche. Mantenere la piastra di aprire e sostenere i cilindri di plastica sul suo rubinetto.
* Le griglie metalliche sono in ferro. La maglia è di forma quadrata con un lato di 0,5 mm.
- Prendere 3 ml di colla chirurgica con un 10 o 20 microlitri pipetta. Applicare con attenzione ad uno dei confini di un cilindro di plastica tenendolo FIRM con le pinze.
- Posizionare delicatamente il cilindro sul lato apicale della mucosa, il più vicino ad uno dei bordi della striscia il più possibile.
- Per dare il tempo colla per attaccare saldamente il cilindro sul tessuto, preparare la piastra organo cultura centro-well: Pipettare 850 ml-1 ml di mezzo in centro ben e sostenere la griglia metallica sui bordi ben centrale della piastra.
- Tagliare il tessuto in eccesso dai bordi del cilindro con due bisturi sterili come prima.
- Sollevare delicatamente il cilindro con il tessuto allegato e posizionare il lato basolaterale in griglia metallica al centro della piastra.
3. Stimolazione
- Utilizzare gli stimoli della vostra scelta nella vostra concentrazione preferita.
- Applicare volume appropriato nel centro del cilindro di plastica senza disturbare il cilindro o la superficie mucosa con la punta della pipetta. Assicurarsi che il volume prescelto copre uniformemente la superficie interna del cilindro. InVolumi dicata:
Grande plastica cilindro: 200 pl
Mezzo cilindro di plastica: 100 ml
Piccolo cilindro di plastica: 50 ml - Incubare fino a 3 ore in un incubatore convenzionale.
* Se si desidera incubare per intervalli di tempo più lunghi, assicurarsi di utilizzare un volume molto più piccolo di stimoli (10-20 ml) e inserire direttamente il tessuto in una atmosfera di 100% O 2 nella pressione di 1 atm (vedi 3.5) .
- Prendete il medium con gli stimoli al largo della superficie apicale del tessuto e non sostituiscono con terreno fresco, perché il tessuto non riceve abbastanza O 2 se uno spesso strato di medio sulla faccia apicale impedisce lo scambio di gas. Coprire la piastra.
- Posizionare il tessuto in una atmosfera di 100% O 2 nella pressione di 1 atm.
4. Fare la raccolta
- Dopo 24 ore di tempo di cultura totale (± 2,5 ore), rimuovere con attenzione il cilindro da thtessuto e con l'aiuto di un bisturi colla raschiando delicatamente e conservarla in base all'analisi desiderata (fissa per immunoistochimica e / o test di immunofluorescenza, o congelare a scatto in N2 liquido per RNA purificazione e profilo di espressione genica o purificazione di proteine e saggi di Western Blot ).
- Raccogliere il medium basolaterale per secrezione di citochine profiling. Centrifugare a 8000 rpm per 7 minuti per far sedimentare i detriti, trasferire il surnatante in una provetta Eppendorf (in alternativa aliquota) e subito conservare a -20 ° C.
* Se si desidera mantenere surnatanti più a lungo, conservarli a -80 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Siamo riusciti a mantenere la mucosa intestinale umano sano e IBD in coltura per almeno 24 ore preservare il benessere del tessuto. In conformità con le precedenti osservazioni 1, questo era possibile solo se la maggior parte del tempo di coltura (almeno il 85% del totale) è avvenuta in O 2, come il tessuto non è sopravvissuto per 24 h in incubatori convenzionali (Figura 2). Abbiamo anche dimostrato che differenti risposte dei espianti possono essere osservati su questo modello a seconda della polarità della stimolazione (apicale vs basolaterale) e l'immunogenicità degli stimoli 2,3.
Usando questo protocollo, dimostriamo che diversi ceppi di probiotici possono suscitare reazioni diverse da parte del tessuto. Lactobacillus plantarum NCIMB8826 dimostrato di essere sorprendentemente immunogenico sul tessuto sano. Contrariamente agli altri due ceppi di Lattobacilli, non solo ha indotto la migrazione di cellule linfoidi di reparti la superficie superiore della mucosa, ma anche upregulated significativamente una chemochina relative a questa migrazione, CCL4, così come IL-1b, una citochina tradizionalmente collegata attività pro-infiammatoria. Con nostra sorpresa, anche se avevamo già osservato una azione preventiva di L. paracasei in un modello murino di colite 4, ciò non si è tradotto in un effetto curativo quando i batteri vivi di questo ceppo sono stati applicati su tessuto infiammato IBD. Piuttosto, i tre ceppi dimostrato nocivo se usato su IBD mucosa nella fase acuta della malattia 2.
Inoltre, abbiamo dimostrato che il prodotto metabolico di un probiotico, chiamato postbiotic, è capace di schermatura epitelio sano contro un ceppo di Salmonella piuttosto invasiva (FB62), mentre allo stesso tempo migliora significativamente l'infiammazione quando applicato sulla mucosa IBD 2.
_upload/4368/4368fig1.jpg "fo: contenuti-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/4368/4368fig1hires.jpg "/>
Figura 1. Rappresentazione schematica del set-up e le foto. A. Rappresentazione schematica del set up visto lateralmente, b. Rappresentazione schematica del set up visto dall'alto, c. Fotografico della griglia metallica utilizzata come supporto per l'espianto. Quando posizionato correttamente, solo il lato basolaterale entra in contatto con la camera di media centrale, d. Foto di tutto l'insieme. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. L'tessuto sopravvive solo la cultura in O 2. Un. Tessuto incolto, fissato al momento dell'arrivo dalla sala operatoria,
Figura 3 L'effetto di uno stimolo pro-infiammatorio sui espianti C-: non stimolate tessuto coltivato per i punti di tempo indicati; Sal:.. Tissue sfidato con Salmonella e coltura per i punti di tempo indicati. La distruzione dello strato superiore del epitelio è già visibile alle 2 ore. L'espianto presenta vasta degenerazione dopo 24 ore. Ingrandimento originale: 10 volte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La necessità di modelli fisiologicamente rilevanti su cui i trattamenti per mucosa intestinale umana possono essere validamente testati è stato a lungo enfatizzato. Molti ricercatori hanno identificato potenziali artefatti e difetti in entrambe cella 5 e 6 modelli di topo finora utilizzato per tale scopo. Infatti, anche se i dati preclinici promettente è spesso ottenuti, questi raramente si traducono in un beneficio clinico significativo.
Il metodo descritto in questo lavoro, presenta un adattamento relativamente semplice, ma efficace e innovativo per protocolli esistenti 7, 8 per la cultura e la stimolazione delle umane espianti mucosa intestinale in modo polarizzato.
Questo modello potrebbe fornire un eccellente approccio complementare per la generazione di dati pre-clinici validi prima di prendere un potenziale trattamento di qualsiasi tipo per le cliniche. Pertanto, i risultati clinici sfortunati 9 potrebbero potenzialmente essere evitati e ricercatori potrebbero piùpromuovere sicuro trattamenti alle cliniche per la movimentazione di condizioni infiammatorie acute.
I principali vantaggi del modello sono la possibilità di confrontare la stimolazione polarizzato contro non e di seguire la risposta del tessuto in un arco di tempo di 24 ore. Un parametro molto importante è che in ogni esperimento, i diversi trattamenti vengono applicati su espianti provenienti dallo stesso paziente che permette che tenendo conto della variabilità tra pazienti. Il fatto che gli espianti sono di dimensioni relativamente grandi rispetto alle biopsie significa anche che una serie di analisi può essere eseguita sullo stesso espianto, confermando risultati in molti modi diversi (saggi ELISA, rtPCRs quantitative, analisi microarray, immunoistochimica e / o immunofluorescenza dati). Inoltre, altri tipi di analisi potrebbero essere ottimizzati in futuro, come la purificazione di popolazioni cellulari di interesse da espianti stimolati e valutazione della loro fenotipo di analisi citofluorimetricasis.
Tuttavia, ci sono anche dei limiti importanti da prendere in considerazione. Nella forma attuale questo modello non è adatto per alta throughput screening di un gran numero di trattamenti, in quanto si basa sulla disponibilità del tessuto. Modelli di coltura cellulare sono probabilmente più adatti a questo scopo in quanto sono più facili da gestire ed eseguire un gran numero di stimoli, il 10 mentre il modello che descriviamo sarà utilizzato come test di fine dei trattamenti candidati prima di entrare nelle cliniche in modo più efficiente. Inoltre, il periodo di tempo durante il quale siamo riusciti a preservare la vitalità del tessuto non permette esperimenti che richiedono periodi di monitoraggio a lungo, come RNA interference. Infine, la stimolazione batterica viene condotta in un incubatore regolare e non consente di preservare o prova l'effetto di batteri anaerobici. E 'nostra intenzione di lavorare su questi problemi in futuro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Ringraziamo Erika Mileti per un eccellente supporto tecnico e il Dott. Antonio Di Sabatino per fornire alle camere di ossigeno.
Finanziamento: Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del 7 ° programma quadro dell'UE (IBDase, ERC: Dendroworld) e Fondazione Cariplo per MR e sostegno da parte di una rete internazionale Marie Curie di formazione alla mobilità (Cross-Talk, Grant Agreement n: 21.553-2) a KT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 10X HBSS | Eurocalne | ECM4006XL | |
| Peni/Strepto | Lonza | DE17602E | |
| Gentamycin | Gibco | 15750-037 | |
| DMEM | Lonza | BE12614 | |
| FBS-Na | Gibco | 16000-044 | |
| 100X ITS-X | Gibco | 51500-056 | |
| EGF | Tebu-bio | 100-15 | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17605E | |
| Non essential aminoacids 100X | Gibco | 11140-035 | |
| NaPyr | Gibco | 11360-039 | |
| Materials | |||
| Cloning cylinders 6x8 mm | BellCo | 2090-00608 | |
| Cloning cylinders 8x8 mm | BellCo | 2090-0080 | |
| Cloning cylinders 10x10 mm | BellCo | 2090-01010 | |
| Metal grids | Home made | ||
| Centre well organ culture plate | BD Falcon | 353037 | |
| Surgical glue (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Oxygen Jars | Home made | ||
| Oxygen tanks | Air Liquid Sanità | ||
References
- Schuller, S., Lucas, M., Kaper, J. B., Giron, J. A., Phillips, A. D. The ex vivo response of human intestinal mucosa to enteropathogenic Escherichia coli infection. Cell. Microbiol. 11, 521-530 (2009).
- Tsilingiri, K., et al. Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model. Gut. , (2012).
- Tsilingiri, K., Rescigno, M. Should probiotics be tested on ex vivo organ culture models? Gut Microbes. , Manuscript in preparation (2012).
- Mileti, E., Matteoli, G., Iliev, I. D., Rescigno, M. Comparison of the immunomodulatory properties of three probiotic strains of Lactobacilli using complex culture systems: prediction for in vivo efficacy. PLoS One. 4, e7056 (2009).
- Cencic, A., Langerholc, T. Functional cell models of the gut and their applications in food microbiology--a review. Int. J. Food Microbiol. 141, Suppl 1. S4-S14 (2010).
- te Velde, A. A., Verstege, M. A., Hommes, D. W. Critical appraisal of the current practice in murine TNBS-induced colitis. Inflamm. Bowel Dis. 12, 995-999 (2006).
- Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture. J. Anat. 134, 459-469 (1982).
- Browning, T. H., Trier, J. S. Organ culture of mucosal biopsies of human small intestine. J. Clin. Invest. 48, 1423-1432 (1969).
- Besselink, M. G., et al. Probiotic prophylaxis in predicted severe acute pancreatitis: a randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 371, 651-659 (2008).
- Lakhdari, O., et al. Identification of NF-kappaB modulation capabilities within human intestinal commensal bacteria. J. Biomed. Biotechnol. 2011, 282356 (2011).
