Summary
Vi viser, at et udviklet biomedicinske indretning involverer kontinuerlig eller pulserende synlig laser baseret behandling, der er kombineret med antibiotisk behandling (gentamycin), resulterer i en statistisk signifikant synergistisk virkning fører til en reduktion i levedygtighed
Abstract
For nylig var der en række publikationer om baktericide effekt af synligt lys, de fleste af dem hævder, at blå del af spektret (400 nm-500 nm) er ansvarlig for at dræbe forskellige patogener 1-5. Den fototoksiske effekt af blåt lys blev foreslået at være et resultat af lys-inducerede reaktive oxygenarter (ROS) dannelse af endogene bakterielle fotosensibilisatorer som hovedsagelig absorberer lys i det blå område 4,6,7. Der er også rapporter om biocid virkning af røde og nærinfrarøde 8 såvel som grønt lys 9..
I den foreliggende undersøgelse har vi udviklet en metode, der tillod os at karakterisere virkningen af høj effekt grøn (bølgelængde på 532 nm) kontinuerlig (CW) og pulset Q-switched (QS) lys på Pseudomonas aeruginosa. Ved hjælp af denne metode, vi også studeret effekten af grønne lys kombineret med antibiotisk behandling (gentamycin) på bakterierne levedygtighed. P. aeruginosa er acFÆLLES noscomial opportunistisk patogen forårsager forskellige sygdomme. Stammen er forholdsvis modstandsdygtig over for forskellige antibiotika, og indeholder mange forudsagde AcrB / Mex-typen RND multistofudstrømningspumpen systemer 10..
Den anvendte metode fritlevende stationær fase Gram-negative bakterier (P. aeruginosa stamme PAO1), dyrket i Luria Broth (LB) medium udsættes for Q-switched og / eller CW-lasere med og uden tilsætning af antibiotikummet gentamycin. Cellelevedygtighed blev bestemt på forskellige tidspunkter. De opnåede resultater viser, at laserbehandling alene ikke reducerer cellelevedygtigheden sammenlignet med ubehandlet kontrol, og at gentamycin behandling alene kun resulterede i en 0,5 log reduktion i kimtal for P. aeruginosa. Den kombinerede laser og gentamycin behandling dog resulterede i en synergistisk effekt og levedygtigheden af P. aeruginosa blev reduceret med 8 stammens.
Den foreslåede metode kan endvidere være gennemmenteret gennem udvikling af kateteret lignende anordning, der kan injicere et antibiotikum løsning i den inficerede orgel samtidig belyse området med lys.
Protocol
1.. Bakteriekultur
- Gramnegative P. aeruginosa stamme PAO1 blev dyrket i Luria Broth (LB) ved 37 ° C i 18 timer.
- Den kultur af celler blev derefter centrifugeret ved 7.500 rpm (omdrejninger per minut) i 5 minutter og supernatanten blev fjernet.
- Bakterierne blev resuspenderet i 10% LB og igen dyrket i yderligere 2 timer for at tillade kulturen at indtaste stationær fase.
- Bakterierne Suspensionen blev derefter opdelt i to grupper: i den første gruppe (2 rør) ingen antibiotika blev tilsat, i den anden gruppe vi tilføjet gentamycin antibiotikum (50 ug / ml).
2.. Bestemmelse af kolonidannende enheder (CFU)
- For at bestemme cellernes levedygtighed 20 pi prøver blev taget fra eksperimentet cirka hver 2 hr inden for den tidsramme på 24 timer. Seriel fortynding af prøverne blev fremstillet og udpladet på LB-agarplader og inkuberet natten over ved 37 ° C.
- For hver behandling, de CFU'er pr plate blev bestemt, og blev foretaget en sammenligning mellem de perioder og forskellige behandlinger. Log reduktion i CFU blev beregnet som beskrevet i Eq. (1):
Log reduktion = Logu-logC [CFU / ml]
Hvor U er den kolonidannende enheder værdi på hvert tidspunkt, CFU er den kolonidannende enhed, mens enhederne i CFU / ml svarende til:
CFU / ml = (antal kolonier x fortyndingsfaktor) / (mængde podet)
Og C er CFU fundet i kontrolprøven på starttidspunktet. Bemærk, at U betegner kolonidannende faktor ved måling øjeblik. - Fortyndingsfaktoren er antallet af fortyndinger, mens i hver af dem koncentrationen af bakterier blev reduceret med en faktor 10. Den inokulerede volumen var altid 200 mikroliter og det er relateret til størrelsen af vores reagensglas.
Derfor at opsummere koncentrationen synspunkt, den gentamycin antibiotikum var ved en koncentration på 50 ug / ml. Vedrørende bakterier, indtil udgangen afden proces, vi har haft det overordnede 8 fortyndinger. Hver fortynding var med en faktor 10 og det blev gjort i rør med 200 pi. Udgangspunktet var 20 ul prøver tilsat til 200 pi rør (og dermed den initiale koncentration var 20/200C 0 = 0.1C0 med C 0 er den initiale koncentration i 20 ul prøver) og den endelige koncentration blev reduceret med 8 størrelsesordener på grund af de 8 fortyndinger.
3.. Belysning
- CW Nd: YAG laser (bølgelængde på 532 nm og gennemsnitlig optisk effekt på 200 mW) blev opdelt i to optiske veje bruger optisk 50% / 50% beam splitter. Strålediameteren var omkring 10 mm. Eksponeringen varede 24 timer.
- Q-switched pulserende Nd: YAG laser (bølgelængde på 532 nm, gennemsnitlig effekt på 300 mW og optiske spidseffekt på 2,5 MW) blev også opdelt i to veje bruger optisk 50% / 50% beam splitter. Stedet diameter var 6 mm. Pulsbredden af Q-switched laser var 6 nsec og gentagelsen sats var 15Hz. Dengennemsnitlig effekttæthed var 106 mW / cm 2 og peak effekttæthed var 8,83 kW / mm 2. Eksponeringen varede 24 timer.
Bemærk at den bakterielle suspension blev omrørt under bestråling og den blev holdt under passende dyrkningsbetingelser for bakteriel vækst (i alle rør der var Luria Broth medium for at tillade bakterierne at vokse).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den laserbaseret opsætning er skematisk vist i figur 1.. Den første eksperimentelle betingelse udnyttede en CW Nd: YAG laser med bølgelængde på 532 nm (den anden harmoniske af Nd: YAG) og gennemsnitlig optisk effekt på 200 mW. Denne stråle blev opdelt i to optiske veje bruger optisk 50% / 50% beam splitter sådan, at hver split stråle havde effekt på 100 mW. Strålediameteren var omkring 10 mm, og dermed effekttæthed var omkring 100 mW / cm 2. Eksponeringen varede 24 timer. Selvom belysning magt er relativt høje, er det ikke høj nok til at bevirke en opvarmning af prøven.
Den anden forsøgsbetingelse udnyttet en Q-switched pulserende Nd: YAG laser med bølgelængde på 532 nm (anden harmoniske) og spot diameter på 6 mm. Den gennemsnitlige effekt var 300 mW og optisk spidseffekt på 2,5 MW. Pulsbredden af Q-switched laser var 6 nsec og gentagelsen sats var 15Hz. Denne stråle blev også opdelt i to veje ved hjælp af optisk50% / 50% stråledeler. Den gennemsnitlige effekttæthed var omkring 100 mW / cm 2 og den maksimale effekt tæthed var 8,83 kW / mm 2. Denne spidseffekt tæthed svarer til energi fluency 88,3 μJ / mm 2 impuls, som hver puls var 10 ns længe i tidsdomænet. Eksponeringen varede 24 timer. Begge eksperimenter blev udført under lignende vækstbetingelser med no-lys eksponering (dvs. med og uden gentamycin), der tjente som en kontrol.
I figur 2 (a) og 2 (b) opnåede virkning grundet belysning af prøverne med CW laserlys og med Q-switched laser henholdsvis med og uden antibiotika på P. aeruginosa præsenteres.
I de prøver, der ikke var eksponeret for lys (dvs. kontrol) var der ingen reduktion i cellelevedygtighed med eller uden gentamicin behandling. Dette resultat antyder, at bakterierne er resistente over for gentamycin behandling, efterlignesituationen ofte stødt på klinikken.
Laserlys alene heller ikke inducerer nogen aflivning enten. Men kombinationen af laserlys og gentamycin reducerede bakterier levedygtighed ved flere størrelsesordener. Den mest fremtrædende virkning blev målt efter 24 timer, hvor kombinationen af enten højre eller Q-switched laser reducerede levedygtigheden med 8 størrelsesordener i forhold til målinger opnået i kontrolgruppen (antibiotikum alene eller lys alene).
Dette er et vigtigt resultat, der kan foreslå en løsning for behandling for denne type af antibiotikaresistente bakterier. Den kendsgerning, at flere timer er påkrævet for at opnå effektiv aflivning af bakterierne ikke reducerer den kliniske potentiale af denne fremgangsmåde, da den foreslåede behandling kan inkorporeres i katetre og andre anordninger, der anvendes på hospitalet. For eksempel i figur 3 præsenterer vi et eksempel på en konstrueret kateter i hvilket yderligerening til den flydende injektion kanal der flerhed af huller gør det muligt at samtidigt diffundere ordentlig belysning i det inficerede organ.
Antallet af prøver, der anvendes til statistikkerne var 6 (der var én eller to tilfælde af nogle af de rør, der var et uheld forurenet, og så blev de taget ud af statistikken). Den p-værdi var under 0,05.
Bemærk, at vi ikke gentage vores eksperimenter for forskellige koncentrationsniveauer af antibiotika. I alle vores eksperimenter fusionen var meget høj. Grunden til det var at bedre vise styrken i vores tilgang, som hvis i den højeste koncentration af bakterierne var stadig ikke påvirket af de antibiotika, uden belysning og blev ødelagt med belysning, vil det naturligvis ske for lavere koncentrationer.
En af de begrundelser for valg af belysningsbølgelængde var at vælge en bølgelængde, for hvilken bakterieen og antibiotika er gennemsigtig. Dette demonstreres i fig. 4. Yderligere motivation for at bruge 532 nm bølgelængde laser skyldtes dets tilgængelighed i vores laboratorium og på grund af det faktum, at det tillod os også at opnå højere belysning effekt (sammenlignet med almindelig hvid lyskilde med spektrale filtre) samt tuning kapacitet til strøm og den tidsmæssige opførsel af belysningen.
Figur 1. . Bakterier belysning setup Laseren var enten CW Nd: YAG laser eller Q-switched pulserende Nd: YAG laser. Til venstre kan man se billedet af forsøgsopstillingen hvor laseren er delt mellem to rør, det ene med antibiotika og en uden det, med henblik på at belyse dem begge i identiske betingelser. Begge rør er position ed på en omrører. Skematisk skitse af forsøgsopstillingen ses i den højre del af figuren.
Figur 2. (A). Virkning af CW-laser og gentamycin på P. aeruginosa. Prøver blev belyst med en CW laserlys (effekt på 100 mW) med og uden gentamicin (50 ug / ml). Gennemsnittet af 3 eksperimenter præsenteres. (B). Effekt af Q-switched laser og gentamycin på P. aeruginosa. Prøver blev belyst med Q-switched laserlys (1,65 MW) med og uden gentamicin (50 ug / ml) på P. aeruginosa levedygtighed. Gennemsnittet af 3 eksperimenter er præsenteret.
4370/4370fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/4370/4370fig3.jpg "/>
Figur 3. Den foreslåede kateter baseret enhed for den biomedicinske behandling mod P. aeruginosa. Prikkerne i figuren repræsenterer lysspredning point forårsager lyset at være diffust i det behandlede væv.
Figur 4 Absorptionsspektrummet (i au) omkring bølgelængden 532 nm for:. (A). De bakterier, (b). Den gentamycin. Klik her for at se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lysbehandling har været et felt af avanceret tværfaglig forskning i de seneste år fremstår som en lovende metode til behandling en lang række sygdomme. I denne forbindelse anvendelsen af lys i det synlige område er blevet grundigt undersøgt. For eksempel har det vist sig, inficerede sår kan blive helbredt mere effektivt ved at udsætte dem for intens synligt lys for sterilisering. Virkningsmekanismen for denne fremgangsmåde viste sig at være gennem induktionen af lys-inducerede oxygenradikaler (ROS), som dræber bakterierne 11..
Tidligere undersøgelser 6 har vist langt større mængder af ROS i bakterier belyst med blåt lys end dem fremkaldt af røde og nærinfrarøde lys. Dette forklarer, hvorfor de fleste beviser i litteraturen koncentrerer sig om den baktericide effekt af blåt lys.
Et andet nyere eksempel på anvendelse af laserlys til at bekæmpe resistente bakterier blev påvist ved KrespJeg et al. 12.. I denne undersøgelse laser genereret Shockwave teknologi blev udnyttet til at udrydde biofilm. Ved hjælp af en miniature Q-switched Nd: YAG-laser og tynde fibre, særlige prober genereret plasma formation, som producerede Shockwave effekt. Forfatterne viste, at denne metode var i stand til effektivt at forstyrre P. aeruginosa biofilm in vitro.
Den tilgang, vi har præsenteret i denne undersøgelse var noget anderledes 13 som vi forsøgt at øge effektiviteten af ikke-fotosensibilisator antimikrobielt middel ved hjælp af laserlys. Vores resultater tyder på, at ved at kombinere antibiotisk behandling med belysning, kan den antimikrobielle aktivitet øges dramatisk.
Faktisk bakterierne fra en helt resistent fænotype observeret i antibiotikum alene blev følsom i nærvær af antibiotika og lysbehandling. Virkningsmekanismen for denne effekt er ikke klart, og vil kræve yderligere investigation. Men i elektron paramagnetisk resonans (EPR) målinger, som vi har udført for at undersøge hvorvidt ROS genereret under behandlingen, blev ingen signifikant forskel mellem de forskellige behandlinger opnåede 13. Disse resultater antyder, at virkningen af den kombinerede behandling ikke involverer produktionen af ROS og forskellige mekanismer skal overvejes. Det kan antages, at lyset behandling ændrer membranpermeabilitet og i sidste ende gør det muligt for antibiotika for at trænge ind i bakteriecellen gav sin aflivning.
Selvom mekanismen operation ikke er fuldt udforsket, vores tilgang fremhæve potentialet i kombinationsbehandling af lys med kommerciel antibiotikum, der kan have været kasseret på grund af antimikrobiel resistens, mens ved at anvende denne kombination nu kan genbruges effektivt i klinikker.
Naturligvis som bemærket i manuskriptet, er belysningen af flere timer er nødvendige for at en Hance effektiviteten af de antibiotika. Dette er faktisk en ulempe ved den foreslåede fremgangsmåde. Realiseringen af en sådan belysning kan opnås f.eks ved at installere belysningskilden inde katetre (som foreslået af figur 3). Hertil kommer, at, særlig banding som gips med belysningskilde hvis såret er ekstern kan sættes oven på såret og belyse det i flere timer, f.eks mens patienten sover om natten. Hvis infektionen er intern og patienten er indlagt, og han / hun er tilsluttet infusionsposen i flere timer, for nogle organer en belysning kanal såsom et endoskop eller en særlig fiber kan gribes an på organet og konstant belyse det (med anvendt antibiotisk behandling), mens patienten er indlagt (nøjagtigt som infusionsposen er forbundet til patienten i mange timer). Vi er helt enige i, at den tilgang, ikke er godt for behandling af almindeligt inficerede organer.
nt "> Bemærk at i dette manuskript viser vi fordel af den foreslåede teknik til hurtig og praktisk anvendelse, men for at opnå dette andre undersøgelser er nødvendige, såsom in vivo forsøg. Den toksicitet i fibroblast-eller epitelceller vil være nyttig såvel som de undersøgelser, der vil vise den mekanisme af den foreslåede behandling i bakterieceller er påkrævet. Endvidere i dette papir, vi har en hypotese, at lys inducerede ændringer i den bakterielle membran, der gjorde det mere gennemtrængeligt for antibiotikummet. Naturligvis ting vil være anderledes i en . kliniske omgivelser, hvor bakterielle infektioner skyldes biofilm Så er der to store problemer:. Biofilm bakterier vil være mere modstandsdygtige end deres planktoniske modparter og penetration af antimikrobielle stoffer i biofilm masse vil være begrænset Derfor udforske virkningerne af lys og gentamycin på en P. aeruginosa biofilm model er målet for vores fremtidige studie.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lauria Broth | Difco | 241420 | |
| Gentamycin | Sigma | G1914 | |
| Bacto Agar | Difco | 231710 |
References
- Feuerstein, O., Persman, N., Weiss, E. I. Phototoxic Effect of Visible Light on Porphyromonas gingivalis and Fusobacterium nucleatum: An In Vitro Study. Photochemistry and Photobiology. 80, 412-415 (2004).
- Enwemeka, C. S., Williams, D., Enwemeka, S. K., Hollosi, S., Yens, D. Blue 470-nm light kills methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in vitro. Photomed. Laser Surg. 27, 221-226 (2009).
- Guffey, J. S., Wilborn, J. In vitro bactericidal effects of 405-nm and 470-nm. Photomed. Laser Surg. 24, 684-688 (2006).
- Lipovsky, A., Nitzan, Y., Friedman, H., Lubart, R. Sensitivity of Staphylococcus aureus strains to broadband visible light. Photochem. Photobiol. 85, 255-260 (2008).
- Lipovsky, A., Nitzan, Y., Lubart, R. A possible Mechanism for visible light induced wound healing. Lasers in Surgery and Medicine. 40, 509-514 (2008).
- Lipovsky, A., Nitzan, Y., Gedanken, A., Lubart, R. Visible light-induced killing of bacteria as a function of wavelength: Implication for wound healing. Lasers in Surgery and Medicine. 42, 467-472 (2010).
- Feuerstein, O., Ginsburg, I., Dayan, E., Veler, D., Weiss, E. Mechanism of Visible Light Phototoxicity on Porphyromonas gingiwalis and Fusobacferium nucleaturn. Photochemistry and Photobiology. 81, 1186-1189 (2005).
- Nussbaum, E. L., Lilge, L., Mazzulli, T. Effects of 630-, 660-, 810-, and 905-nm laser irradiation delivering radiant exposure of 1-50 J/cm2 on three species of bacteria in vitro. J. Clin. Laser Med. Surg. 20, 325-333 (2002).
- Dadras, S., Mohajerani, E., Eftekhar, F., Hosseini, M. Different Photoresponses of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa to 514, 532, and 633 nm Low Level Lasers In Vitro. Current Microbiology. 53, 282-286 (2006).
- Stover, C. K., Pham, X. Q., Erwin, A. L. Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen. Nature. 406, 952-964 (2000).
- Hamblin, M. R., Demidova, T. N. Mechanisms of low level light therapy. Proc. SPIE. 6140, 1-12 (2006).
- Krespi, Y. P., Stoodley, P., Hall-Stoodley, L.
- Reznick, Y., Banin, E., Lipovsky, A., Lubart, R., Zalevsky, Z. Direct laser light enhancement of susceptibility of bacteria to gentamycin antibiotic. Opt. Commun. 284, 5501-5507 (2011).
