Summary
Vi viser at et utviklet biomedisinsk anordning ved kontinuerlig eller pulserende synlig laser-basert behandling som er kombinert med behandling med antibiotika (gentamycin), resulterer i en signifikant synergistisk effekt som fører til en reduksjon i levedyktigheten
Abstract
Nylig var det flere publikasjoner om bakteriedrepende effekt av synlig lys, de fleste av dem hevder at blå delen av spekteret (400 nm-500 nm) er ansvarlig for å drepe ulike patogener 1-5. Den fototoksisk effekten av blått lys ble foreslått å være et resultat av lys-indusert reaktive oksygen arter (ROS) dannelse av endogene bakterielle lyssensitisere som hovedsakelig absorberer lys i det blå området 4,6,7. Det er også rapporter om biocidvirkning av rødt og nær infrarødt 8 samt grønt lys 9.
I denne studien har vi utviklet en metode som tillot oss å karakterisere effekten av høy effekt grønn (bølgelengde på 532 nm) kontinuerlig (CW) og pulset Q-switched (QS) lys på Pseudomonas aeruginosa. Ved hjelp av denne metoden kan vi også studert effekten av grønt lys kombinert med antibiotikabehandling (gentamicin) på bakterier levedyktighet. P. aeruginosa er acommon noscomial opportunistisk patogen forårsaker ulike sykdommer. Den belastningen er ganske motstandsdyktig mot ulike antibiotika, og inneholder mange spådde AcrB / Mex-type RND multimedikament effluks systemer 10.
Fremgangsmåten benytter seg av frittlevende stasjonære fase Gram-negative bakterier (P. aeruginosa stamme PAO1), dyrket i Luria-buljong (LB) medium utsettes for Q-byttet og / eller CW lasere med og uten tilsetting av antibiotikumet gentamycin. Celleviabilitet ble bestemt ved ulike tidspunkt. De oppnådde resultater viste at laser behandling alene ikke reduserte celleviabilitet sammenlignet med ubehandlet kontroll, og at gentamycin behandling alene kun resulterte i en 0,5 log reduksjon i levedyktige telling for P. aeruginosa. Den kombinerte laser og gentamycin behandling, men resulterte i en synergistisk effekt, og levedyktigheten av P. aeruginosa ble redusert med 8 stokkens.
Den foreslåtte metoden kan videre være gjennomførtmentert gjennom utvikling av kateteret lignende enhet i stand til å injisere en antibiotisk løsning inn i den infiserte organ samtidig belysning av området med lys.
Protocol
En. Bakteriell Kultur
- Gram-negative P. aeruginosa stamme PAO1 ble dyrket i Luria-buljong (LB) ved 37 ° C i 18 timer.
- Kulturen av cellene ble deretter sentrifugert ved 7500 rpm (runder pr minutt) i 5 min, og supernatanten ble fjernet.
- Bakteriene ble resuspendert i 10% LB og re-dyrket i ytterligere 2 timer for å tillate kulturen å oppgi stasjonær fase.
- Den bakterie suspensjon ble deretter delt i to grupper: i den første gruppen (2 rør) ingen antibiotika ble tilsatt, i den andre gruppen til den vi gentamycin antibiotikum (50 ug / ml).
2. Bestemmelse av kolonidannende enheter (CFU)
- For å bestemme celleviabilitet 20 ul prøver ble tatt fra forsøket omtrent hver 2 hr innenfor tidsrammen på 24 timer. Seriell fortynning av prøvene ble laget og platet på LB-agarplater og inkubert over natten ved 37 ° C.
- For hver behandling, de CFUs per plate ble bestemt og en sammenligning ble gjort mellom tidsperioder og ulike behandlinger. Den log reduksjon i CFU ble beregnet som beskrevet i Eq. (1):
Logreduksjon = Logu-LogC [CFU / ml]
Hvor U er kolonidannende enheter verdi ved hvert tidspunkt; CFU er koloni-dannende enhet, mens enhetene i CFU / ml er lik:
CFU / ml = (antall kolonier x fortynningsfaktor) / (volum inokulert)
Og C er den CFU funnet i kontrollprøven ved starttidspunktet. Merk at U betegner kolonibærende faktor på målingen øyeblikkelig. - Fortynningsfaktoren antall fortynninger, mens i hvert enkelt av dem konsentrasjonen av bakteriene ble redusert med en faktor på 10. Den inokulerte volum alltid var 200 mikro liter, og det er relatert til størrelsen på vår reagensrør.
Derfor å oppsummere konsentrasjonen synspunkt, var gentamycin antibiotika ved konsentrasjon på 50 mikrogram / ml. Når det gjelder bakterier, til slutten avprosessen vi hadde samlet åtte fortynninger. Hver fortynning ble med en faktor på 10, og det ble gjort i rørene på 200 ul. Utgangspunktet var 20 pl av prøvene lagt inn i 200 pl rør (og således den opprinnelige konsentrasjon var 20/200C 0 = 0.1C0 med C-0 er den opprinnelige konsentrasjon i det 20 pl av prøvene) og den endelige konsentrasjonen var redusert med 8 størrelsesordener på grunn av de 8 fortynninger.
3. Belysning
- CW Nd: YAG laser (bølgelengde på 532 nm og gjennomsnittlig optisk effekt på 200 mW) ble delt i to optiske stier ved hjelp av optisk 50% / 50% strålesplitter. Strålediameteren var omtrent 10 mm. Eksponeringen varte i 24 timer.
- Q-switched pulset Nd: YAG laser (bølgelengde på 532 nm, gjennomsnittlig effekt på 300 mW og optisk toppeffekt på 2,5 MW) ble også delt inn i to baner ved hjelp av optisk 50% / 50% strålesplitter. Stedet diameter var 6 mm. Pulsen bredden på Q-switched laser var seks EFF og repetisjon rate var 15Hz. Dengjennomsnittlig tetthet var 106 mW / cm 2 og toppeffekt tettheten var 8,83 kW / mm 2. Eksponeringen varte i 24 timer.
Legg merke til at den bakterielle suspensjon omrørt under bestrålingen, og den ble holdt under passende dyrkningsbetingelser for bakteriell vekst (i alle rør var Luria Broth medium for å la bakteriene til å vokse).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Laseren baserte oppsettet er skjematisk vist i figur 1. Den første eksperimentelle tilstand benyttes en CW Nd: YAG laser som har bølgelengde på 532 nm (den andre harmoniske av Nd: YAG) og gjennomsnittlig optisk effekt på 200 mW. Denne strålen ble delt i to optiske stier ved hjelp av optisk 50% / 50% strålesplitter slik at hver split beam hadde effekt på 100 mW. Strålediameteren var omtrent 10 mm, og dermed strømtettheten var omtrent 100 mW / cm 2. Eksponeringen varte i 24 timer. Selv om den opplysning kraft er forholdsvis høy er det ikke er høy nok til å forårsake oppvarming av prøven.
Den andre eksperimentelle betingelse benyttes en Q-byttet pulsede Nd: YAG laser som har bølgelengde på 532 nm (andre harmoniske) og flekk diameter på 6 mm. Gjennomsnittlig effekt var 300 mW og optisk toppeffekt på 2,5 MW. Pulsen bredden på Q-switched laser var seks EFF og repetisjon rate var 15Hz. Denne strålen ble også delt inn i to baner ved hjelp av optiske50% / 50% stråledeleren. Gjennomsnittlig tetthet var ca 100 mW / cm 2 og toppeffekt tetthet var 8,83 kW / mm 2. Dette toppeffekt tetthet tilsvarer energi flyt på 88,3 μJ / mm 2 per puls som hver puls var 10 nsec lenge i tid domene. Eksponeringen varte i 24 timer. Begge forsøk ble utført under lignende vekstbetingelser med no-lyseksponering (dvs. med og uten gentamycin) som tjente som en kontroll.
På figurene 2 (a) og 2 (b) den virkning som oppnås på grunn av belysning av prøven med CW laser-lys og med Q-svitsjet laser henholdsvis med og uten antibiotika på P. aeruginosa er presentert.
I de prøver som ikke var eksponert for lys (dvs. kontroll) var det ingen reduksjon i cellelevedyktighet med eller uten gentamycin behandling. Dette resultatet tyder på at bakteriene er resistente mot behandling gentamycin, hermetsituasjonen ofte oppstått i klinikken.
Laserlyset alene også induserte ikke noen drepe heller. Imidlertid reduserte kombinasjonen av laserlys og gentamycin bakterier levedyktighet ved flere størrelsesordener. Den mest fremtredende virkning ble målt etter 24 timer i hvilken kombinasjonen av enten medurs eller Q-svitsjet laser redusert levedyktighet ved 8 størrelsesordener i forhold til målinger oppnådd i kontrollgruppen (antibiotikum alene eller lys alene).
Dette er et viktig resultat som kan tyde på en løsning for behandling for denne typen av antibiotika-resistente bakterier. Det faktum at flere timer er nødvendig for å oppnå effektiv dreping av bakteriene reduserer ikke den kliniske potensialet av denne tilnærmingen siden den foreslåtte behandlingen kan bli innarbeidet i katetre og andre innretninger som benyttes på sykehus. For eksempel i figur 3 presenterer vi et eksempel på et kateter laget, hvori i tilleggling fra flytende injeksjon kanal er det antall hull som tillater samtidig å diffundere riktig belysning inn i den infiserte organ.
Antallet prøver som brukes for statistikken var 6 (det var ett eller to tilfeller av noen av de rør som var forurenset ved et uhell, og deretter ble de tatt ut av statistikken). Den p-verdi var under 0,05.
Merk at vi ikke gjenta våre eksperimenter for ulike konsentrasjoner av antibiotika. I alle våre eksperimenter konsentrasjonen var meget høy. Grunnen til det var å bedre vist seg sterkt med vår metode som i den høyeste konsentrasjonen av bakterier var fremdeles ikke påvirket av den antibiotika uten belysning og ble ødelagt med belysningen, vil det selvsagt skje for lavere konsentrasjoner.
En av forklaringene for valg av belysning bølgelengde var å velge en bølgelengde for hvilken den bacterien og antibiotikaene er gjennomsiktige. Dette er demonstrert i figur 4.. Ytterligere motivasjon for bruk av 532 nm bølgelengde laser var på grunn av dens tilgjengelighet i vårt laboratorium og på grunn av det faktum at det også mulig for oss å oppnå høyere belysning kraft (i forhold til vanlig hvit lyskilde med spektral-filtre), så vel som innstiller evne for det kraft og for den tidsmessige oppførsel av belysning.
Figur 1. . Bakterier belysning oppsett Laseren var enten CW Nd: YAG laser eller Q-switched pulserende Nd: YAG laser. På venstre side kan man se bildet av det eksperimentelle oppsettet, der laseren er delt mellom to rør, en med og en uten antibiotika det, for å belyse dem begge i like forhold. Begge rørene er posisjon ed på en pumpe. Skjematisk skisse av det eksperimentelle oppsettet er sett i høyre del av figuren.
Figur 2. (A). Effekt av CW-laser og gentamicin på P. aeruginosa. Prøver ble belyst med en CW laserlys (effekt på 100 mW) med og uten gentamycin (50 pg / ml). Gjennomsnittet av tre eksperimenter er vist. (B). Effekt av Q-switched laser og gentamicin på P. aeruginosa. Prøver ble belyst med Q-byttet laserlys (1,65 MW) med og uten gentamycin (50 pg / ml), på P. aeruginosa levedyktighet. Gjennomsnittet av tre eksperimenter er vist.
4370/4370fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/4370/4370fig3.jpg "/>
Figur 3. Den foreslåtte kateter basert enhet for biomedisinsk behandling mot P. aeruginosa. Prikkene i figuren representerer lysspredning poeng forårsaker lyset skal være diffust i det behandlede vev.
Figur 4 absorpsjonsspektrum (i AU) rundt bølgelengden 532 nm for:. (A). Bakteriene, (b). Den gentamycin. Klikk her for å se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lysbehandling har vært et felt av avansert tverrfaglig forskning de siste årene fremstår som en lovende tilnærming for behandling en rekke sykdommer. I denne sammenheng er bruken av lys i det synlige området er grundig studert. For eksempel har det blitt funnet at infiserte sår kan bli helbredet mer effektivt ved å utsette dem for intens synlig lys for sterilisering. Virkningsmekanismen for denne tilnærmingen ble påvist å være gjennom induksjon av lysinduserte oksygen radikaler (ROS) som dreper bakteriene 11.
Tidligere studier 6 har vist mye høyere mengder av ROS i bakterier belyst med blått lys enn de som fremkalles av rødt og nær infrarødt lys. Dette forklarer hvorfor de fleste bevis i litteraturen konsentrerer seg om bakteriedrepende effekt av blått lys.
Et annet nylig eksempel for bruk av laserlys for å bekjempe resistente bakterier ble demonstrert av Krespjeg et al. 12.. I den studien laser generert Shockwave teknologien ble brukt til å utrydde biofilm. Ved å bruke en miniatyr Q-switched Nd: YAG laser og tynne fibre, spesielle prober genererte plasma formasjon som produserte shockwave effekt. Forfatterne har vist at denne metoden var i stand til effektivt å forstyrre P. aeruginosa biofilmer in vitro.
Denne tilnærmingen har vi presentert i denne studien var noe forskjellig 13 som vi forsøkte å øke effekten av ikke-fotosensibiliserende antimikrobielt middel ved hjelp av laserlys. Våre resultater tyder på at ved å kombinere antibiotikabehandling med belysning, kan den antimikrobielle aktiviteten økes dramatisk.
Faktisk, fra en helt resistent fenotype, observert i antibiotikumet alene bakteriene ble følsom i nærvær av antibiotika og lysbehandling. Virkningsmekanismen av denne effekten er ikke klart, og vil kreve ytterligere studieområdetion. Men i de Electron-Paramagnetiske resonans (EPR) målinger som vi har utført for å undersøke om ROS genereres under behandlingen, var ingen signifikant forskjell mellom de ulike behandlingene fått 13. Disse resultatene tyder på at effekten av den kombinerte behandlingen ikke medfører ROS produksjon og ulike mekanismer må vurderes. Den kan hypotese at lyset behandling endrer membranpermeabilitet og til slutt gjør at antibiotika for å trenge inn i bakterier celle gir sin dreping.
Selv om mekanismen av operasjonen ikke er fullt utforsket, vår tilnærming markere potensialet av kombinasjonsbehandling av lys med kommersielle antibiotika som kan ha blitt forkastet på grunn av resistensutvikling mens ved å bruke denne kombinasjonen kan nå gjenbrukes effektivt i klinikker.
Tydeligvis som nevnt i manuskriptet, er belysning av flere timer som trengs for å no Hance heve effektiviteten av antibiotika. Dette er faktisk en ulempe av den foreslåtte tilnærming. Realiseringen av en slik belysning kan oppnås f. eks ved å installere belysningskilden innvendig katetere (som foreslått av figur 3). I tillegg til det, dersom såret er utvendig spesiell banding som gips med belysningskilden kan settes på toppen av såret og den lyser i flere timer, f.eks mens pasienten sover om natten. Hvis infeksjonen er intern og pasienten er innlagt på sykehus og han / hun er koblet til infusjonspose i flere timer, for enkelte organer en belysning kanal slik som et endoskop eller en spesiell fiber kan tilnærmes til organet og stadig lyser (med påføres antibiotika behandling), mens pasienten er innlagt på sykehus (nøyaktig som i infusjonsposen er koblet til pasienten i mange timer). Vi er helt enige om at tilnærmingen er ikke bra for behandling av generelt infiserte organer.
nt "> Merk at i dette manuskriptet viser vi fordelen av den foreslåtte teknikk for rask og praktisk anvendelse, men for å oppnå dette andre studier er nødvendig, for eksempel in vivo-forsøk. Toksisiteten studie på fibroblast eller epiteliale celler vil være nyttig i tillegg Da studiene som vil vise den mekanisme av den foreslåtte behandlingen i bakterielle celler er nødvendig. Videre i dette papir har vi hypotese at lysindusert forandringer med den bakterielle membran som gjorde det mer gjennomtrengelig for antibiotika. Tydeligvis ting vil være forskjellig i en . klinisk setting der bakterielle infeksjoner skyldes biofilm Så er det to store problemer:. Biofilm bakterier vil være mer motstandsdyktig i forhold til sine planktoniske kolleger og penetrasjonen av antimikrobielle midler i biofilm massen vil være begrenset Derfor utforske effekten av lys og gentamicin på en P. aeruginosa biofilm modellen er målet for vår fremtidige studier.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lauria Broth | Difco | 241420 | |
| Gentamycin | Sigma | G1914 | |
| Bacto Agar | Difco | 231710 |
References
- Feuerstein, O., Persman, N., Weiss, E. I. Phototoxic Effect of Visible Light on Porphyromonas gingivalis and Fusobacterium nucleatum: An In Vitro Study. Photochemistry and Photobiology. 80, 412-415 (2004).
- Enwemeka, C. S., Williams, D., Enwemeka, S. K., Hollosi, S., Yens, D. Blue 470-nm light kills methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in vitro. Photomed. Laser Surg. 27, 221-226 (2009).
- Guffey, J. S., Wilborn, J. In vitro bactericidal effects of 405-nm and 470-nm. Photomed. Laser Surg. 24, 684-688 (2006).
- Lipovsky, A., Nitzan, Y., Friedman, H., Lubart, R. Sensitivity of Staphylococcus aureus strains to broadband visible light. Photochem. Photobiol. 85, 255-260 (2008).
- Lipovsky, A., Nitzan, Y., Lubart, R. A possible Mechanism for visible light induced wound healing. Lasers in Surgery and Medicine. 40, 509-514 (2008).
- Lipovsky, A., Nitzan, Y., Gedanken, A., Lubart, R. Visible light-induced killing of bacteria as a function of wavelength: Implication for wound healing. Lasers in Surgery and Medicine. 42, 467-472 (2010).
- Feuerstein, O., Ginsburg, I., Dayan, E., Veler, D., Weiss, E. Mechanism of Visible Light Phototoxicity on Porphyromonas gingiwalis and Fusobacferium nucleaturn. Photochemistry and Photobiology. 81, 1186-1189 (2005).
- Nussbaum, E. L., Lilge, L., Mazzulli, T. Effects of 630-, 660-, 810-, and 905-nm laser irradiation delivering radiant exposure of 1-50 J/cm2 on three species of bacteria in vitro. J. Clin. Laser Med. Surg. 20, 325-333 (2002).
- Dadras, S., Mohajerani, E., Eftekhar, F., Hosseini, M. Different Photoresponses of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa to 514, 532, and 633 nm Low Level Lasers In Vitro. Current Microbiology. 53, 282-286 (2006).
- Stover, C. K., Pham, X. Q., Erwin, A. L. Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen. Nature. 406, 952-964 (2000).
- Hamblin, M. R., Demidova, T. N. Mechanisms of low level light therapy. Proc. SPIE. 6140, 1-12 (2006).
- Krespi, Y. P., Stoodley, P., Hall-Stoodley, L.
- Reznick, Y., Banin, E., Lipovsky, A., Lubart, R., Zalevsky, Z. Direct laser light enhancement of susceptibility of bacteria to gentamycin antibiotic. Opt. Commun. 284, 5501-5507 (2011).
