Summary
Sürekli veya atımlı görebilir lazer esaslı muamele içeren gelişmiş bir biyomedikal cihaz antibiyotik tedavisi (kadaverin), canlılığı bir azalmaya yol açan bir istatistiksel olarak belirgin bir sinerjistik etki sonuçları ile birlikte olduğunu göstermektedir
Abstract
Son zamanlarda görünür ışık, çoğu çeşitli patojenler 1-5 öldürmekten sorumlu olan spektrumun bu mavi kısmı (400 nm-500 nm) iddia bakterisidal etkisi çeşitli yayınlar vardı. Mavi ışık fototoksik etkisi ışık kaynaklı reaktif oksijen türlerinin (ROS) çoğunlukla mavi bölgede 4,6,7 ışık absorbe endojen bakteriyel ışığa tarafından oluşumunun bir sonucu olduğu ileri sürülmüştür. Kırmızı ve yakın kızılötesi 8 yanı sıra yeşil ışık 9 biyosidal etkisi raporları da vardır.
Bu çalışmada, bize Pseudomonas aeruginosa üzerinde yüksek güç yeşil (532 nm dalga boyu) sürekli (CW) ve darbeli Q-anahtarlı (QS) ışık etkisini karakterize etmek için izin verilen bir yöntem geliştirdi. Bu yöntemi kullanarak biz de bakteri canlılığı üzerindeki antibiyotik tedavisi (gentamisin) ile birlikte yeşil ışık etkisini inceledi. P. aeruginosa acommon noscomial fırsatçı patojen çeşitli hastalıklara neden olur. Gerginlik çeşitli antibiyotiklere oldukça dirençli ve birçok tahmin AcrB / Mex tipi RND akış sistemleri 10 ilaca içerir.
Serbest yaşayan durağan faz, Gram-negatif bakteriler (Pseudomonas aeruginosa PAO1 suşu), Luria Broth (LB) ve antibiyotik gentamisin ilavesi olmadan Q-anahtarlı ve / veya CW lazerler maruz kalan bir ortamda yetiştirilen kullanılan yöntem. Hücre canlılığı, farklı zaman noktalarında belirlenmiştir. Elde edilen sonuçlar, tek başına lazer tedavisi sadece P. için uygun sayısında 0.5 günlük azalma sonuçlandı tedavi edilmemiş kontrolü ve tek başına gentamisin tedavisine göre hücre canlılığı azaltmak olmadığını gösterdi aeruginosa. Birleştirilen lazer ve gentamisin tedavi Ancak, S. bir sinerjistik etkisi olduğunu ve canlılığı sonuçlandı aeruginosa 8 günlük en azalmıştır.
Önerilen yöntem, bundan başka uygu olabiliraynı anda ışık alanı aydınlatan ise enfekte organı içine bir antibiyotik çözüm enjekte yeteneğine sahip cihaz gibi kateter geliştirilmesi ile tamamlanır.
Protocol
1. Bakteriyel Kültür
- Gram-negatif S. aeruginosa PAO1 suşu, 18 saat boyunca 37 ° C'de Luria Broth (LB) içinde büyütülmüştür.
- Hücrelerin kültür daha sonra 5 dakika boyunca 7500 rpm (dakika başına tur) santrifüjlenmiş ve süpernatan uzaklaştırılmıştır.
- Bakteriler, 10% LB yeniden süspanse edildi ve kültür durağan faz yeniden girmek için izin vermek için başka bir 2 saat boyunca yeniden büyütülmüştür.
- Bakteri süspansiyonu daha sonra iki gruba bölünmüştür: birinci grup (2 tüpler) herhangi bir antibiyotik, ikinci grupta biz antibiyotik gentamisin (50 ug / ml) ilave edilir, ilave edildi.
2. Koloni oluşturucu birim belirlenmesi (CFU)
- Hücre canlılığı belirlemek için 20 ul örnek 24 saat en süre içinde yaklaşık her 2 saat deney alınmıştır. Numunelerin seri dilüsyon yapılmış ve daha sonra kaplama LB agar plakaları üzerinde ve 37 ° C'de gece boyunca kuluçkalanmıştır
- Her tedavi için, plat başına CFUE belirlendi ve bir karşılaştırma süreler ve çeşitli tedaviler arasında yapıldı. Eşitlik açıklandığı gibi CFU yılında günlük azalma hesaplanmıştır. (1):
Log azalma = Logu-LogC [CFU / ml]
Nerede U her noktasında birim değeri oluşturan koloni olduğunu, CFU koloni oluşturan birim ise CFU / ml eşit birimleri:
CFU / ml = (koloniler x seyreltme faktörü sayısı) / (hacim aşılanmış)
Ve C başlama zamanında kontrol örneği bulunan CFU olduğunu. U Ölçüm anda faktörü oluşturan koloni atar unutmayın. - Bunların her biri içinde bakteri konsantrasyonu, 10 kat azaltılmıştır ise seyreltme faktörü dilüsyonları sayısıdır. Aşılanmış hacmi her zaman 200 mikro litre idi ve test tüpünün büyüklüğü ile ilgilidir.
Bu nedenle bakış konsantrasyon noktasına özetlemek, gentamisin antibiyotik 50 mg / ml konsantrasyonda oldu. Sonuna kadar, bakteri ile ilgilisüreci biz genel olarak 8 seyreltme vardı. Her bir seyreltme 10 arasında bir faktör tarafından yapıldı ve 200 ul tüplerde gerçekleştirilmiştir. Başlangıç noktası, 200 ul tüp içine ilave örnekleri, 20 ul (ve dolayısıyla başlangıç konsantrasyonu 20/200C, 0 C = 0 ile 0.1C0 numunelerin 20 ul başlangıç konsantrasyonu olmak üzere) ve nihai konsantrasyon 8 azaltılmıştır 8 dilüsyonları nedeniyle büyüklükte emir.
3. Aydınlatma
- CW Nd: YAG lazer (532 nm ve 200 mW ortalama optik güç dalga boyu) optik% 50 /% 50 ışın ayırıcı kullanarak iki optik yolları ayrıldı. Işın çapı 10 mm ilgiliydi. Maruz kalma süresi 24 saat oldu.
- Q-anahtarlı darbeli Nd: YAG lazer (532 nm dalga boyu, 300 mW ve 2.5 MW optik tepe gücü ortalama güç) da optik% 50 /% 50 ışın ayırıcı kullanarak iki yol bölündü. Nokta çapı 6 mm oldu. Q-anahtarlı lazer darbe genişliği 6 ns ve tekrarlama oranı 15Hz oldu.ortalama güç yoğunluğu 106 mW / cm 2 ve pik güç yoğunluğu 8.83 kW / mm 2 oldu. Maruz kalma süresi 24 saat oldu.
Bakteriyel süspansiyon ışınlama sırasında karıştırıldı ve bakteriyel büyümeyi (bütün tüpler Luria Broth orta bakterilerin büyümesine izin vermek için orada) için uygun kültür koşulları altında tutuldu unutmayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lazer tabanlı kurulum şematik olarak Şekil 1'de sunulmuştur. İlk deneysel durumu bir CW Nd kullanılan: ve 200 mW ortalama optik güç: YAG lazer 532 nm dalga boyu (YAG Nd ikinci harmonik) sahip. Bu ışın her bölünmüş ışın gücü 100 mW olduğu gibi optik% 50 /% 50 ışın ayırıcı kullanarak iki optik yolları ayrıldı. Işın çapı yaklaşık 10 mm idi ve bu nedenle güç yoğunluğu yaklaşık 100 mW / cm 2 idi. Maruz kalma süresi 24 saat oldu. Aydınlatma gücü nispeten yüksek olmasına rağmen örnek ısıtma neden olacak kadar yüksek değildir.
Bir Q-anahtarlı darbeli Nd kullanılan ikinci deney durumu: YAG lazer 532 nm (harmonik ikinci) ve 6 mm nokta çapı dalga boyuna sahip. Ortalama güç 300 mW ve 2.5 MW optik pik güç oldu. Q-anahtarlı lazer darbe genişliği 6 ns ve tekrarlama oranı 15Hz oldu. Bu ışın ayrıca optik kullanarak iki yol bölündü50% / 50% ışın ayırıcı. Ortalama güç yoğunluğu yaklaşık 100 mW / cm 2 ve pik güç yoğunluğu 8.83 kW / mm 2 idi. Bu pik güç yoğunluğu 88.3 her darbe zaman etki alanında uzun 10 ns olduğu gibi darbe başına μJ / mm 2 akıcılık enerji eşdeğerdir. Maruz kalma süresi 24 saat oldu. Her iki deneyde de, bir kontrol olarak hizmet etmiştir no-ışığa maruz kalma (örneğin ve gentamisin olmadan) ile benzer büyüme koşulları altında gerçekleştirilmiştir.
Şekiller 2 (a) ve 2 (b) etkisi P. antibiyotik olan ve olmayan, sırasıyla sağa lazer ışığı ve Q-anahtarlı lazerle örneklerin aydınlatma bağlı olarak elde aeruginosa sunulmuştur.
(Kontrol gibi) ışığa maruz değildi örneklerde veya gentamisin tedavi olmadan hücre canlılığı bir azalma yoktu. Bu sonuç, bakteri taklit eden, gentamisin tedaviye dirençli olduğunu göstermektedirdurum genellikle klinikte karşılaştı.
Tek başına lazer ışığı aynı zamanda ya da herhangi bir öldürme uyarmadı. Bununla birlikte, lazer ışını ve gentamisin kombinasyonu birkaç büyüklük bakterilerin canlılığı azaltılmış. En belirgin etki yönünde veya Q-anahtarlı lazer ya da kombinasyonu, kontrol grubuna (sadece antibiyotik veya hafif tek başına) 'de elde edilen değerlere göre büyüklük 8'di göre canlılığı azaltılmış olduğu, 24 saat sonra ölçülmüştür.
Bu, antibiyotik dirençli bakterilerin bu tip için tedavi eden bir çözelti önerebilir önemli bir sonucudur. Önerilen tedavi kateterler ve hastane kullanılan diğer cihazlar dahil edilebilir çünkü birkaç saat bakterilerin öldürülmesi etkili elde etmek için gerekli olduğu gerçeği, bu yaklaşımın potansiyel klinik azaltmaz. Şekil 3 'de, örneğin bir dizayn kateter örneği, mevcut olan ilavesi bölgesindekieş zamanlı olarak, enfekte organı içine uygun bir aydınlatma yayılmasına izin veren çok sayıda delik vardır, sıvı enjeksiyon kanalına tion.
İstatistikler için kullanılan örnek sayısı 6 oldu (orada kazara kontamine olan tüplerin bazı bir ya da iki olgu olduğunu ve daha sonra istatistik çıkarıldı). P altında 0.05 oldu.
Biz antibiyotik farklı konsantrasyon seviyeleri için bizim deneyler tekrar etmedi unutmayın. Bizim deneylerin hepsinde konsantrasyonu çok yüksek oldu. Nedeni daha iyi bakteriler hala aydınlatma olmadan antibiyotik etkilenmedi ve aydınlatma ile yıkılan yüksek konsantrasyon eğer, tabii ki düşük konsantrasyonlarda için ne gibi yaklaşımımız gücünü göstermekti.
Aydınlatma dalga boyu seçmek için gerekçeler biri dalga boyu seçmek olduğu için bakteribir ve antibiyotik şeffaf. Bu, Şekil 4 'de gösterilmiştir. 532 nm dalga boyunda lazer kullanımı için ek motivasyon laboratuarımızda onun durumu nedeniyle ve daha yüksek aydınlatma gücü (spektral filtreler düzenli beyaz ışık kaynağı ile karşılaştırıldığında) hem de için ayar yeteneği elde etmek için bize de izin gerçeği nedeniyle oldu güç ve aydınlatma zamansal davranışı için.
Şekil 1. . Bakteri aydınlatma kurulum lazer CW Nd ya oldu: YAG lazer veya Q-anahtarlı Nd darbeli: YAG lazer. Solda bir aynı koşullarda her ikisi de aydınlatmak amacıyla, lazer iki tüp, antibiyotik ile bir ve onsuz bir arasında bölünmüş olduğu deney düzeneği imajını görebilirsiniz. Her iki tüp pozisyonu vardır Bir karıştırıcı Ed. Deney düzeneği şematik kroki figürün sağ tarafında görülür.
Şekil 2,. (A). P. CW-lazer ve gentamisin etkisi aeruginosa. Örnekler bir CW lazer ışığı (100 mW) ile ve gentamisin (50 mg / ml) olmadan aydınlatılmış edildi. 3 deneyin ortalaması gösterilmiştir. (B). P. aeruginosa üzerinde Q-anahtarlı lazer ve gentamisin etkisi. Örnekler P. ve gentamisin (50 mg / ml) olmadan Q-anahtarlı lazer ışığı (1.65 MW) ile aydınlatıldı aeruginosa canlılığı. 3 deneyin ortalaması gösterilmiştir.
4370/4370fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/4370/4370fig3.jpg "/>
Şekil 3,. P. karşı biyomedikal tedavi için önerilen kateter tabanlı aygıt aeruginosa. Şekilde nokta ışık tedavi edilen doku içine dağınık olmasına neden ışık saçılması noktalarını temsil eder.
Şekil 4, 532 nm dalga boylarında emilme tayfı (au). (A). Bakteriler, (B). Gentamisin. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fototerapi tedavisi çok hastalıklar için umut verici bir yaklaşım olarak ortaya son yıllarda gelişmiş çok disiplinli bir araştırma alanı olmuştur. Bu bağlamda görünür aralığında ışık kullanımı yaygın incelenmiştir. Örneğin, enfekte yaralar sterilizasyon amacıyla yoğun görünür ışığa maruz bırakılmasıyla, daha etkili bir şekilde iyileşmiş edilebilir olduğu tespit edilmiştir. Bu yaklaşım için eylem mekanizması bakteri 11 öldürmek ışık kaynaklı oksijen radikallerinin indüksiyon (ROS) aracılığıyla olduğu kanıtlanmış oldu.
6 Önceki çalışmalar kırmızı ve yakın kızılötesi ışık tarafından uyarılan daha mavi ışık ile aydınlatılmış bakterilerde ROS çok daha yüksek miktarda göstermiştir. Literatürde en kanıt mavi ışık bakterisidal etkisi üzerinde yoğunlaşmaktadır açıklıyor.
Dirençli bakteri mücadele için lazer ışık kullanımı için başka bir son örnek Kresp tarafından gösterildiI ve ark. 12. Bu çalışmada lazer oluşturulan şok dalgası teknolojisi biyofilm ortadan kaldırmak için kullanılmıştır. YAG lazer ve ince lifler, shockwave etkisi üretilen plazma oluşumu oluşturulan özel sondalar: minyatür bir Q-anahtarlı Nd kullanarak. Yazarlar bu yöntem etkili P. bozmak mümkün olduğunu gösterdi in vitro aeruginosa biyofilm.
Biz lazer ışığı kullanarak olmayan ışığa antimikrobiyal ajanın etkinliğini artırmak için girişimlerde bu çalışmada sunulmuştur yaklaşımı biraz farklı 13 oldu. Sonuçlarımız aydınlatma ile antibiyotik tedavisi birleştirerek, antimikrobiyal aktivite önemli ölçüde arttırılabilir göstermektedir.
Aslında, tek başına antibiyotik gözlenen tamamen dirençli fenotip, gelen bakterilerin, antibiyotik ve ışık tedavisi varlığında duyarlı hale geldiler. Bu etkinin etki mekanizması açık değildir ve daha fazla konuyu araştıran gerektirecektiriyon. Ancak, ROS, tedavi sırasında oluşturulan olup olmadığını incelemek için gerçekleştirilen gelmiş elektron paramanyetik rezonanstır (EPR) ölçümleri, farklı tedaviler arasında hiçbir anlamlı fark 13 elde edildi. Bu sonuçlar, kombine tedavinin etkisini ROS üretimini içermez ve farklı mekanizmalar olarak kabul edilmesi gerektiğini göstermektedir. Bu ışık tedavisi membran geçirgenliği değiştirir ve sonunda antibiyotik onun öldürme verimli bakteri hücre içine nüfuz sağlar varsaydık edilebilir.
Çalışma mekanizması tam olarak araştırılmış olmasa da, yaklaşımımız bu kombinasyon uygulayarak şimdi klinikte etkili yeniden kullanılabilir ise antimikrobiyal direnç nedeniyle iptal edildi olabilir ticari antibiyotik ile ışık kombine tedavisinin potansiyel vurgulayın.
Açıkçası olarak el yazması de belirtildiği gibi, bir kaç saatlik bir aydınlatma en amacıyla gereklidir antibiyotiklerin etkinliğini Hance. Bu gerçekten önerilen yaklaşımın bir sorun var. Bu tür bir aydınlatma bölgesinin gerçekleştirilmesi kateter içindeki ışık kaynağı (Şekil 3 tarafından önerilen) takılmasıyla elde edilebilir. Yara dış ise ek olarak, aydınlatma kaynağı ile sıva gibi bantlama özel yaranın üstüne konabilir ve hasta gece uyurken örneğin birkaç saat için yanar. Enfeksiyon iç ve bazı organlar için, birkaç saat için hastanın hastaneye ve o / o infüzyon çanta bağlıysa böyle bir endoskop veya özel bir lif olarak bir aydınlatma kanalı organa yaklaştı ve sürekli (ile aydınlatmak olabilir Hasta (infüzyon çanta saatlerce hastaya bağlı olduğu tam olarak) hastaneye iken) antibiyotik tedavisi uygulanır. Biz tam yaklaşım genellikle enfekte organların tedavisi için iyi olmadığını kabul ediyorsunuz.
nt "Bu yazıda biz hızlı ve pratik uygulama için önerilen tekniğin avantajı gösteriyor ki ama bu diğer çalışmalar, in vivo deneylerde gerekli olan elde etmek için.> Not fibroblast veya epitel hücreleri üzerinde toksisite çalışması da yararlı olacaktır Bakteriyel hücrelerde önerilen tedavi mekanizması gösterecektir çalışmalar gerekli olduğu gibi. bu yazıda ek olarak, antibiyotiğe daha geçirgen hale bakteri membranının ışık kaynaklı değişimler. Açıkçası mutlaka bir farklı olacaktır zannedilmektedir . bakteriyel enfeksiyonlar biyofilm nedeniyle klinik Daha sonra iki önemli sorun vardır:. Biyofilm bakteriler sınırlı olacaktır biyofilm kitle antibiyotik kendi planktonik meslektaşları ve penetrasyon ile karşılaştırıldığında daha dayanıklı olacaktır Bu nedenle, ışık ve gentamisin etkilerini keşfetmek Bir P. aeruginosa biyofilm modeli gelecek çalışmanın amacı.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lauria Broth | Difco | 241420 | |
| Gentamycin | Sigma | G1914 | |
| Bacto Agar | Difco | 231710 |
References
- Feuerstein, O., Persman, N., Weiss, E. I. Phototoxic Effect of Visible Light on Porphyromonas gingivalis and Fusobacterium nucleatum: An In Vitro Study. Photochemistry and Photobiology. 80, 412-415 (2004).
- Enwemeka, C. S., Williams, D., Enwemeka, S. K., Hollosi, S., Yens, D. Blue 470-nm light kills methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in vitro. Photomed. Laser Surg. 27, 221-226 (2009).
- Guffey, J. S., Wilborn, J. In vitro bactericidal effects of 405-nm and 470-nm. Photomed. Laser Surg. 24, 684-688 (2006).
- Lipovsky, A., Nitzan, Y., Friedman, H., Lubart, R. Sensitivity of Staphylococcus aureus strains to broadband visible light. Photochem. Photobiol. 85, 255-260 (2008).
- Lipovsky, A., Nitzan, Y., Lubart, R. A possible Mechanism for visible light induced wound healing. Lasers in Surgery and Medicine. 40, 509-514 (2008).
- Lipovsky, A., Nitzan, Y., Gedanken, A., Lubart, R. Visible light-induced killing of bacteria as a function of wavelength: Implication for wound healing. Lasers in Surgery and Medicine. 42, 467-472 (2010).
- Feuerstein, O., Ginsburg, I., Dayan, E., Veler, D., Weiss, E. Mechanism of Visible Light Phototoxicity on Porphyromonas gingiwalis and Fusobacferium nucleaturn. Photochemistry and Photobiology. 81, 1186-1189 (2005).
- Nussbaum, E. L., Lilge, L., Mazzulli, T. Effects of 630-, 660-, 810-, and 905-nm laser irradiation delivering radiant exposure of 1-50 J/cm2 on three species of bacteria in vitro. J. Clin. Laser Med. Surg. 20, 325-333 (2002).
- Dadras, S., Mohajerani, E., Eftekhar, F., Hosseini, M. Different Photoresponses of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa to 514, 532, and 633 nm Low Level Lasers In Vitro. Current Microbiology. 53, 282-286 (2006).
- Stover, C. K., Pham, X. Q., Erwin, A. L. Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen. Nature. 406, 952-964 (2000).
- Hamblin, M. R., Demidova, T. N. Mechanisms of low level light therapy. Proc. SPIE. 6140, 1-12 (2006).
- Krespi, Y. P., Stoodley, P., Hall-Stoodley, L.
- Reznick, Y., Banin, E., Lipovsky, A., Lubart, R., Zalevsky, Z. Direct laser light enhancement of susceptibility of bacteria to gentamycin antibiotic. Opt. Commun. 284, 5501-5507 (2011).
