Summary
Un metodo per isolare vescicole submitocondriali arricchiti in F1FO ATP sintasi complessi da cervello di ratto è descritto. Queste vescicole permettono lo studio dell'attività del complesso F1FO ATPasi e la sua modulazione utilizzando la tecnica di patch clamp di.
Abstract
I mitocondri sono coinvolti in molte importanti funzioni cellulari tra cui il metabolismo, la sopravvivenza a 1, di sviluppo e, di segnalazione di calcio 2. Due delle più importanti funzioni mitocondriali sono legati alla produzione efficiente di ATP, la moneta energetica della cellula, dalla fosforilazione ossidativa e la mediazione di segnali per morte cellulare programmata 3.
L'enzima principale responsabile della produzione di ATP sintasi è il F1FO-ATP, chiamato anche ATP sintasi 4-5. Negli ultimi anni, il ruolo dei mitocondri nella morte cellulare per apoptosi e necrotiche ha ricevuto notevole attenzione. In morte cellulare per apoptosi, Bcl-2 proteine della famiglia come Bax entrare la membrana mitocondriale esterna, oligomerize e permeabile la membrana esterna, rilasciando fattori pro-apoptotici nel citosol 6. In classico necrosi cellulare, come quello prodotto da ischemia o eccitotossicità nei neuroni, un large, aumento insufficiente regolazione in matrice calcio contribuisce all'apertura di un poro membrana interna, la permeabilità mitocondriale poro di transizione o mPTP. Questo depolarizza la membrana interna e provoca cambiamenti osmotici, contribuendo alla rottura della membrana esterna, rilascio di fattori pro-apoptotici, e disfunzione metabolica. Molte proteine tra cui Bcl-xL 7 interagiscono con F1FO ATP sintasi, modulando la sua funzione. Bcl-xL interagisce direttamente con la subunità beta della F1FO ATP sintasi, e questa interazione decresce una conduttanza di perdita entro il F1FOATPasecomplex, aumentando il trasporto netto di H + da F1FO durante F1FO ATPasi 8 e aumentando quindi l'efficienza mitocondriale. Per studiare l'attività e la modulazione della ATP sintasi, abbiamo isolato dal cervello di roditori submitocondriali vescicole (SMVs) contenenti F1FO ATPasi. Le SMVs mantengono l'integrità strutturale e funzionale del F1FO ATPasi come mostrato in Alavian et al. Qui, descriviamo un metodoche abbiamo usato con successo per l'isolamento di SMVs da cervello di ratto e noi delineare la tecnica patch clamp per analizzare l'attività del canale (conduttanza perdita ion) delle SMVs.
Protocol
1. Cervello mitocondriale Isolamento (Adattato da Brown MR et al. 9)
- Sacrifica il topo utilizzando metodi approvati dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa (IACUC).
- Tagliare la testa dell'animale per decapitazione, tagliare la pelle ed esporre il cranio.
- Aprire delicatamente il cranio, tagliando con una forbice o rongeur. Rimuovere il cervello.
- Tritate finemente il cervello senza cervelletto in isolamento Buffer (vedi tabella 1) e trasferirlo in un ml di vetro / teflon omogeneizzatore 5 (vedi elenco attrezzature).
- Omogeneizzare tessuti delicatamente 10 volte (senza bollicine), circa 5 min.
- Centrifugare campione a 1500 xg per 10 min a 4 ° C in una centrifuga da banco.
- Salvare il surnatante (mitocondriale e sinaptosomi) e scartare il pellet (materiale nucleare e detriti cellulari). Centrifugare a 16.000 xg per 10 min a 4 ° C in una centrifuga da banco.
- Scartaresurnatante e risospendere pellet in 500 ml di tampone di isolamento. Disrupt sinaptosomi con una nave distruzione cellulare (vedere inventario). Applicare una pressione di 1200 psi per 10 minuti, seguita da una rapida decompressione.
- Strato il composto su Ficoll gradienti (vedi Tabella 2), posto in SW-50.1 rotore e centrifugare a 126.500 g per 20 minuti a 4 ° C in un ultracentrifuga (vedi elenco attrezzature). Il pellet è mitocondri purificato, lo strato tra le diverse densità Ficoll è sinaptosomi undisrupted.
- Lavare pellet mediante centrifugazione in isolamento Tampone a 16.000 xg per 10 min a 4 ° C in una centrifuga da banco.
2. Submitocondriali vescicole (SMV) Isolamento (Adattato da Chan et al. 10)
- Risospendere mitocondri in 200 microlitri di buffer di isolamento combinato con un uguale volume di 1% digitonina e lasciar riposare in ghiaccio per 15 min.
- Aggiungere più Isolamento Buffer e centrifugare a 16.000 xg per 10 min a 4 ° C in una centrifuga da banco. Fate questo due volte.
- Risospendere pellet in 200 microlitri di buffer di isolamento e aggiungere 2 ml di 10% Lubrol PX (C12E9). Mescolare e lasciar riposare in ghiaccio per 15 min.
- Miscela strato sul buffer di isolamento, posto in SW-50.1 rotore e centrifugare a 182.000 xg a 4 ° C per 1 ora.
- Lavare pellet finale mediante centrifugazione in una centrifuga da tavolo in isolamento Tampone a 16.000 xg per 10 min a 4 ° C.
3. Registrazione elettrofisiologica
- Un tipico impianto di elettrofisiologia include un amplificatore, un computer PC dotato di un Digidata 1440A interfaccia convertitore analogico-digitale in combinazione con il software pClamp10.0, manipolatori, un microscopio, un tavolo isolamento dalle vibrazioni, gabbia di Faraday.
- Borosilicato capillari di vetro sono inserite in un Flaming / Brown Micropipetta Puller modello P-87. Un programma di pipetta-estrattore è ottimizzato pergenerare pipette con resistenze tra 80 a 100 MW.
- SMVs vengono poste in una soluzione fisiologica intracellulare (ATP viene aggiunto al momento opportuno durante la registrazione) (Tabella 3). Patch pipette clamp sono riempite con la stessa soluzione (senza ATP). Le registrazioni sono fatte da formare una guarnizione giga-ohm sul SMVs a temperatura ambiente. Le vescicole sono visualizzabili al microscopio a contrasto di fase con un microscopio invertito Nikon o Zeiss.
- Il potenziale di membrana è mantenuta una tensione da -100 mV a + 100 mV per periodi di 10 secondi. Registrazioni vengono filtrati a 5 kHz utilizzando il circuito dell'amplificatore. Livelli di rumore elettrico o non specifici stray inferiore a 1 pA sono desiderabili per la registrazione di successo.
- Dati vengono analizzati con il software Clampfit 10,0 per esempio per determinare la frequenza e l'ampiezza di eventi singolo canale. Dipendenza di tensione è determinato tracciando un rapporto di tensione di corrente.
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Representative Results
Il primo passo del nostro protocollo consente l'isolamento di mitocondri purificati come mostrato mediante Western blot in Figura 1. In figura 2 è mostrato un esempio di un derivato dal cervello submitocondriali registrazione cerotto vescicola. Utilizzando la configurazione di patch dentro-fuori dimostriamo attività del canale modulato da ATP. Il controllo (CTL) di registrazione (a sinistra) mostra l'attività del canale multi-conduttanza con una conducibilità massima di 600 pS in media. che è stato immediatamente diminuita dopo l'aggiunta di 1 mM ATP al bagno. L'effetto complessivo di ATP è quello di diminuire la conduttanza di patch SMVs in modo concentrazione-dipendente. Per misurare l'efficienza di F1FO ATPasi dopo l'isolamento, abbiamo misurato il movimento di ioni H + nelle SMVs in risposta ad idrolisi come mostrato in figura 3, misurando la diminuzione di intensità di fluorescenza della SMV-escluso H + indicatore ACMA. ATP-sensibili ione H + sequestro in SMVs è rafforzata dopo aggiungereition di ATP. Questo test può essere utilizzato per misurare l'efficienza di ione H + sequestro. SMVs meno efficienti si accumulano gli ioni H + più lentamente o ad un valore di picco più piccolo. Per esempio ione H + sequestro è attenuata mediante l'aggiunta di Bcl-xL e inibitori FCCP (Alavian et al., 2011).
| Concentrazione finale | |
| Saccarosio | 250 Mm |
| Hepes | 20 Mm |
| EDTA | 1 Mm |
| BSA | 0,5% |
Tabella 1. Isolamento Buffer.
| Ficoll | 22 ml 20%> |
| Saccarosio | 12 ml di 1 M |
| EDTA | 18.75 microlitri 0,1 M |
| Tris-HCl | 375 microlitri 1 M (pH 7,4) |
| Strato superiore di 7,5% di Ficoll | |
| Ficoll magazzino | 10 ml |
| Isolamento Buffer | 6 ml |
| Strato inferiore al 10% di Ficoll | |
| Ficoll magazzino | 15,5 ml |
| Isolamento Buffer | 2,5 ml |
Tabella 2. Ficoll Archivio.
| KCl | 120 mm |
| NaCl | 8 mm |
| EGTA | 0,5 mM |
| Hepes | 10 mM |
| pH | 7.3 |
Tabella 3. Interno Soluzione.
Figura 1. Rappresentante immunoblot di lisato purificato da Cytosol e mitocondri. Il pannello superiore mostra un immunoblot utilizzando un anticorpo contro la proteina citosolica GAPDH. Il pannello inferiore mostra un immunoblot utilizzando un anticorpo contro la proteina di membrana mitocondriale innner CoxIV.
Figura 2. Due di patch clamp rappresentante registrazione prima e dopo l'aggiunta di 1 mM ATP. Partecipazione potenziale è +70 mV. La linea tratteggiata rappresenta 0 pA. Ogni traccia viene registrato per 10 secondi e non vi è 10 secondi tra le tracce.
Figura 3. Esempi di tracce di variazioni di intensità di fluorescenza dil'indicatore ACMA nel tempo in presenza di SMVs e in assenza (traccia nera) e presenza (traccia rossa) di ATP.
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Discussion
I metodi qui descritti permettono l'isolamento di puro mitocondri alla fine del passaggio 1 e vescicole submitocondriali (SMVs) dopo il passo 2 dal cervello intero senza distinzione di cella phenotypes.SMVspurified da questo metodo sono essenzialmente esente da contaminazione da altri organelli subcellulari come mostrato nella figura 1 e nostro precedente lavoro (Alavian KN et al. 8) e mantengono la loro integrità strutturale e funzionale prima del congelamento. Dopo il congelamento e lo scongelamento, mitocondri isolati o SMVs sono usati per le registrazioni e saggi biochimici, ma non per gli studi respiratori.
Questo metodo può inoltre essere utilizzata per isolare mitocondri di fegato utilizzando la stessa procedura. Poiché i mitocondri e SMVs tendono a formare ammassi quando placcato nella camera di registrazione elettrofisiologica, l'attenzione dovrebbe essere data al caricamento del campione, come una diluizione eccessiva aggregazione o eccessivo può ridurre la possity di formazione sigillo. Inoltre, l'attenzione deve essere somministrato a diversi dettagli tecnici prima di avviare l'isolamento. E 'fondamentale utilizzare attrezzi puliti e di tenerli in ghiaccio. Tutte le operazioni devono essere eseguite su ghiaccio e tutto centrifughe impostato a 4 ° C. Preparare il gradiente Ficoll correttamente è fondamentale per un esperimento riuscito. Creando una perfetta separazione tra le due concentrazioni di Ficoll esalta la purezza delle frazioni subcellulari.
Un limite di questa tecnica è imposto dalla quantità finale di proteina, che può essere piccola se campione da una regione specifica del cervello è desiderata per esempio mitocondri da substantia nigra pars compacta o striato. Pool campioni da vari animali può essere necessario aumentare la quantità totale di proteina raccolto.
Mitocondri o SMVs che un'aliquota a 1 mg / ml e conservato a -80 ° C e sono stabili per registrazioni per diversi mesi, tuttavia, è preferable non di ri-congelare il campione mitocondriale dopo lo scongelamento. Vescicole purificate da questo metodo sono utili per studiare la ATP sintasi, con approcci diversi, come la registrazione di patch clamp, tecniche biochimiche e di altri studi funzionali. Con questa preparazione si possono analizzare gli effetti di droghe o piccole molecole su F1FO attività e struttura ATPasi.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potter-Elvehjem Tissue Grinder withPTFEPestle | Krackeler Scientific, Inc. | 1-7725T-5 | |
| Eppendorf Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5424 000.410 | |
| 4639 Cell Disruption Vessel | Parr Instrument Company | 4639 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F5415 | |
| Polycarbonate centrifuge tubes | Beckman Coulter | P20314 | |
| SW-50.1 rotor | Beckman Coulter | ||
| L8-70M Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D5628 | |
| Lubrol PX (C12E9) | Calbiochem | 205534 | |
| Axopatch 200B | Axon Instruments | ||
| Digidata 1440A | Molecular Device | ||
| pClamp10.0 | Molecular Device | ||
| Manipulator | Sutter Instrument | ||
| Borosilicate glass capillary | World Precision Instruments | 1308325 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller Model P-87 | Sutter Instrument |
References
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