Summary
에피토프 특정 T 세포의 낮은 주파수 인구를 분리하고 유동 세포 계측법을 기준으로 결과를 분석 MHC tetramers 및 자기 microbeads :이 프로토콜은 펩타이드의 사용을 설명합니다. 이 방법은에서 관심 내생 T 세포 인구의 직접적인 연구를 수
Abstract
생체 실험 모델과 적응 면역을 공부 연구자에 대한 기본적인 필요는 T 세포 항원 수용체 (TCR) 특이성에 따라 T 세포를 식별 할 수 있다는 것입니다. 많은 간접 방법은 T 세포의 대량 인구가 특정 항원과 에피토프 특정 T 세포 등 확산, 시토 킨 생산, 또는 활성 마커 하나의 표현과 같은 기능 응답의 측정을 통해 확인할 수 있습니다와 체외에서 자극되는 이용하실 수 있습니다. 그러나, 이러한 방법은 여러 가지 기능 중 하나를 전시 에피토프 특정 T 세포를 식별, 그들은 순진한 전구체 주파수에서 에피토프 특정 T 세포를 감지 할 수있을만큼 문자를 구분하지 않습니다. 인기있는 대안은, TCR 유전자 변형 입양 이전 모델 인에서 TCR 유전자 변형 마우스의 단클론 T 세포는 easi 수 있습니다 에피토프 특정 T 세포의 큰 전구체 인구를 만들 histocompatible 호스트에 놓는 아르통증은 congenic 마커 항체 2,3의 사용을 추적. 강력한 있지만,이 방법은 4,5 하나의 에피토프에 대한 특이성과 T 세포의 unphysiological 주파수와 관련된 실험 유물을 앓고. 또한,이 시스템은 polyclonal 인구에서 에피토프 특정 T 세포 클론의 기능 이질성을 조사하는 데 사용할 수 없습니다.
MHC (pMHC) 단지 : 적응 면역을 연구 할 수있는 이상적인 방법은 전적으로 해당 펩타이드 기원에 바인딩하여 TCR의 특이성을 구별하는 방법을 사용하여 내생 T 세포 레퍼토리의 에피토프 특정 T 세포의 직접 검출을 포함해야합니다. pMHC tetramers 및 유동 세포 계측법의 사용이 6 달성 있지만 다음과 같은 항원 유발 clonal 확장을 발견 에피토프 특정 T 세포의 높은 주파수 인구의 감지로 제한됩니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 pMHC의 tetramers의 사용을 조정 방법 및 magne을 설명틱 세포 농축 기술은 마우스 림프 조직 3,7에서 매우 낮은 주파수 에피토프 특정 T 세포의 탐색 기능을 사용하도록 설정합니다. 이 기술로, 하나는 종합적으로 면역 반응의 모든 단계에서 쥐 내생 T 세포의 전체 에피토프 별 인구를 추적 할 수 있습니다.
Protocol
1. 림프 조직에서 세포 절연
- 의 작은 사각형이 포함 된 60mm 문화 요리에, 얼음 차가운 cEHAA (EHAA + 10% FBS, 펜 / 패 혈성, gentamycin, 2 MM L-글루타민, 55 MM 2 메르 캅토 에탄올) 또는 기타 이에 상응하는 T 세포 매체 1 ML을 추가 얼음에 100 μm 나일론 메쉬 및 장소.
- 마우스를 안락사시켜야.
- 비장 가능한 많은 쉽게 접근 할 수 림프절을 제거합니다. 이러한 적어도 사타구니, 겨드랑이, 상완, 자궁 경부, 그리고 장간막 림프절을 포함해야합니다. 배양 접시에있는 나일론 메쉬의 상단에 올려 놓으십시오.
- 부드럽게 덧는 림프구를 해방하기 위해 나일론 메쉬 동안 폐쇄 1.5 ML의 microfuge 튜브의 평면 상단을 림프 조직 사용합니다. 정지에 셀을 작업 할 cEHAA와 pipet 위아래로 다른 한 ML을 추가합니다. 15 ML의 폴리 프로필렌 원심 분리기 튜브의 맨 위에 위치 나일론 메쉬의 또 다른 작품을 통해 셀을 전송합니다. 얼음 차가운 cEHAA, PO의 또 다른 한 ML 함께 그릇과 메쉬를 씻어같은 관에 볼륨을 oling. 4 ML의 최종 세포 현탁액 볼륨을 달성하기 위해 반복합니다.
- 15 ML의 최종 볼륨 (PBS + 2% FBS, 0.05 % Azide) 차가운 정렬 버퍼를 추가, 4, 300 XG에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리기 ° C.
- 조심스럽게 액체의 어떤 물방울이 튜브의 측면에 남아되지 않습니다 확실하게, 표면에 뜨는을 대기음. 약 두 번 펠렛 자체의와 동일한 최종 볼륨으로 FC 블록 (정렬 버퍼 + 2.4G2 항체)의 세포 펠렛을 Resuspend. 예를 들어, 순진한 마우스 비장과 림프 노드는 일반적으로 약 100 μl의 세포 펠렛을 생산하고 있습니다. 이 경우, 200 μl의 볼륨을 가져 FC 블록 100 μl를 추가합니다. 셀 거리며 걷게의 큰 학위가 발생했습니다 경우, 조심스럽게 pipet 팁을이 시점에서 세포 덩어리를 제거합니다.
2. Tetramer의 착색
- 10 나노 미터 (또는 경험적으로 최적화 된 농도)의 최종 농도에 PE 또는 APC-라벨 pMHC tetramer를 추가합니다.
- 믹스와 incuba실내 온도 (또는 경험적으로 최적화 시간 및 온도)에서 1 시간에 테.
- 15 ML의 볼륨에 감기 정렬 버퍼를 추가하고 300 XG, 4 ° C.에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리기 얼음 또는 ° C 지금부터 4에 샘플을 보관.
- 조심스럽게 액체의 어떤 물방울이 튜브의 측면에 남아되지 않습니다 확실하게, 표면에 뜨는을 대기음. 200 μl의 최종 볼륨으로 정렬 버퍼에있는 셀 펠렛을 Resuspend. 더블 tetramer 농축를 들어, 150 μl의 최종 볼륨 resuspend.
3. 자기 강화
- Miltenyi 방지 PE 또는 안티 APC microbeads의 50 μl를 추가합니다. 더블 tetramer 농축를 들어, 50 μl를 추가합니다.
- 4에 섞어서 20 분에 품다 ° C.
- 15 ML의 볼륨에 감기 정렬 버퍼를 추가하고 300 XG, 4 ° C.에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리기
- 기다리는 동안 MidiMACS 또는 QuadroMACS 자석에 Miltenyi LS 자기 열을 설정합니다. 에 문이 열려있는 15 ML의 폴리 프로필렌 원심 분리기 튜브의 위치를열 아래에 직접 올릴 수.
- 가 15 ML 튜브로 배수 할 수 있도록, 컬럼의 상단에 정렬 버퍼 3 ML을 추가합니다.
- 칼럼의 상단에 100 μm 나일론 메쉬 광장을 배치합니다.
- 세포가 회전이 완료되면, 조심스럽게 표면에 뜨는을 기음과 정렬 버퍼 3 ML에서 펠렛을 resuspend.
- 열 상단 위에 나일론 메쉬를 통해 세포 현탁액을 전송합니다.
- 세포 현탁액이 완전히 열을 배출되면, 정렬 버퍼의 다른 3 ML로 원래 튜브를 씻어 열로 나일론 메쉬를 통해 버퍼를 전송 과정에서 메쉬를 린스. 나일론 메쉬를 폐기하십시오.
- 버퍼가 완전히 열을 배출되면 열을 정렬 버퍼의 또 다른 3 ML를 추가합니다.
- 3 × 3 ML 세차 총 10 단계를 반복합니다.
- 새로운 15 ML의 폴리 프로필렌 원심 분리기 튜브를 통해 자석과 장소에서 열을 제거합니다.
- t로 정렬 버퍼의 5 ML을 추가그는 열.
- 즉시 열 상단에 플런저를 삽입하고 하나의 연속 동작으로, 튜브에 열을 밖으로 버퍼를 강제, 플런저 모든 방법을 아래로 밀어.
- 300 XG에서 5 분의 용출 바인딩 된 분수와 흐름을 통해 언 바운드 분수, 4 ° C.를 포함하는 튜브를 원심 분리기
- 액체의 더 작은 물방울이 튜브의 측면에 남아되지 않습니다 확실하게, 바인딩 분수에서 표면에 뜨는을 자세히 대기음. 정확히 95 μl의 최종 볼륨으로 정렬 버퍼에있는 셀 펠렛을 Resuspend. 기음과 2 ML의 최종 볼륨에 언 바운드 일부를 resuspend.
4. 유동 세포 계측법
- 각 분수를 들어, 5 μl를 제거하고 5 ML의 FACS 관 계수 구슬 200 μl (정렬 버퍼에 200,000 / ML의 농도로 조정)에 추가 할 수 있습니다. 4에 정해 ° C를 분석하기. 시간을 절약하기 위해 구슬은 실험 시작 전에 레이블 튜브에 미리 aliquoted 할 수 있습니다.
- 오전 준비항체의 애 스터 믹스는 세포의 표면 마커 (표 1) 얼룩합니다. 시간을 절약하기 위해, 이것은 실험의 시작하기 전에 수행 할 수 있습니다.
- 바인딩 된 분수를 들어, 관 세포 ~ 90 μl에 직접 항체 칵테일의 복용을 추가합니다. 언 바운드 분수의 분석이 필요하다면, 5 ML의 FACS 튜브에 세포의 90 μl를 전송하고 항체 칵테일의 복용을 추가합니다.
- 흐름 cytometer위한 단일 색상 보정 컨트롤 패널을 설정합니다. 사용 할 각각의 fluorochrome를 들어, 해당 fluorochrome에 복합 항 CD4 항체 1 μl로 5 ML의 FACS 관에 남은 언 바운드 분획 세포의 50 μl를 섞는다. 뿐만 아니라 흠없는 제어를 설정해야합니다.
- 소용돌이와 4에서 30 분의 모든 샘플을 품다 ° C.
- 300 XG에서 5 분, 4 ° C. 각 튜브와 원심 분리기로 정렬 버퍼의 5 ML을 추가
- 바인딩 된 분수를 들어, 신중하게 정렬 buf 200 μl의 세포 표면에 뜨는 기음 및 resuspend남았다. 1.2 ML의 FACS의 microtube에 세포를 전송합니다. 같은 microtube에 정렬 버퍼와 수영장의 또 다른 200 μl로 관을 씻어. 셀 clumps이 명백 경우, 50 μm 필터를 통해 세포를 전달합니다.
- 언 바운드 분율 및 보상 제어, 가만히 따르다 또는의 표면에 뜨는 및 resuspend 두 ML의 정렬 버퍼를 대기음하십시오.
- 단일 색 보정 컨트롤을 사용하여 흐름 cytometer를 설정합니다. 기록 할 추가 매개 변수로 측 분산 폭 (SSC-W)를 선택합니다.
- 도 1 및도 2에 도시 된 바와 같이 + 나 CD8 + T 세포 CD4을 식별 할 연속 포함 된 문의 순서를 사용하여 스테인드 샘플을 분석합니다. 바인딩 분수를 들어, 최대 2,000,000 총 이벤트의 최대 가능한 한 많은 세포를 수집합니다. 언 바운드 분수를 들어, 1,000,000 총 이벤트를 수집합니다. 수집 속도 초당 이벤트이나 3000 아래하세요.
- 같은 시스템 설정을 사용하여 계산 비드 샘플을 분석 할 수 있습니다. 10,000 총 이벤트를 수집합니다. </ 리>
- FCS 파일로 모든 데이터를 저장합니다.
5. 데이터 분석
- FlowJo 소프트웨어를 사용하여 계산 비드 샘플에 대한 FCS 데이터 파일을 분석합니다. 플롯 앞으로 FITC의 분산 및 (그림 1과 2 참조) 계산 구슬을 aroung 게이트를 설정합니다. 각 샘플에서 발견 비즈를 계산의 총 수를 결정합니다. 수집 셀 이벤트의 수를 결정하기 위해 수집 이벤트의 총 수에서 뺍니다.
- 박스 1에서 설명한 방정식을 사용하여 각 샘플에있는 모든 세포의 총 수를 계산합니다.
- 스테인드 바운드 및 언 바운드 일부 샘플에 대한 FCS 데이터 파일을 분석합니다. 림프 +, 측면 산란 - 너비 이오, 덤프 -, 3 번 CD +, CD4 + 또는 CD8 +, tetramer도 1 및도 2에 도시 된 바와 같이 각 예제에서 + T 세포.을 식별 할 연속 포함 된 문의 순서를 설정
- CD4을 정의하는 데 사용 포함 된 문이 각각의 주파수 + tetramer하여 샘플에서 세포의 총 수를 모두 곱하면+ 또는 CD8 + tetramer + 세포 에피토프 특정 T 세포 (박스 1)의 총 수를 계산합니다.
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Representative Results
그림 2는 이전에 관련 펩타이드 + CFA와 함께 예방 접종을 쥐 대표 데이터를 묘사하면서 그림 1은 순진 쥐에서 pMHCII tetramer 강화 비장과 림프절 샘플을 대표하는 유동 세포 계측법의 음모를 도시한다. 시리얼 게이트는 CD4의 분석 + T 세포 인구에서 autofluorescent 및 기타 원치 않는 이벤트를 제거합니다. CD8 + T 세포 인구는 CD4의 pMHCII tetramer의 착색 + T 세포에 유용한 내부 대조군 역할을합니다. 강화에서 바인딩 된 분수는 일반적으로 게이팅 더 도전하고, 언 바운드 분수보다 autofluorescent 세포의 상당히 높은 비율을 포함합니다.
샘플의 에피토프 특정 T 세포의 절대 수는 determi으로 tetramer의 + 아르 이러한 세포의 비율과 함께 구슬 개수 분석에서 결정, 농축 샘플의 바인딩 분율에있는 모든 세포의 총 수를 곱하여 계산세포 염색 분석 (상자 1)에서 네드.
그림 1에서 순진한 마우스의 경우, 샘플의 바인딩 분율에있는 모든 세포의 농도는 (5,589분의 4,411) (200,000) (0.200/0.005) = 6.31 × 10 6 / ML. 샘플에있는 모든 세포의 총 수는 (6.31 × 10 6 / ML) (0.095) = 6.00 × 10 5. 마지막으로, 에피토프 특정 CD4의 총 개수 + T 세포는 (6.00 × 10 5) (41.5 %) (96.6 %) (10.2 %) (62.3 %) (0.64 %) = 98.
그림 2에서 예방 접종을 마우스 들어, 샘플의 바인딩 분율에있는 모든 세포의 농도는 (3,590분의 6,410) (200,000) (0.200/0.005) = 1.43 × 10 7 / ML. 샘플에있는 모든 세포의 총 수는 (1.43 × 10 7 / ML)입니다 (0.095) = 1.36 × 10 6. 마지막으로, 에피토프 특정 CD4의 총 개수 + T 세포는 (1.36 × 10 6) (40.9 %) (93.9 %) (9.54 %) (72.0 %) (42.7 %) = 1.53 × 10 4 <> / STRONG.
에피토프 특정 T 세포의 수와 같은 농축 감소의 효율은 8 증가하므로 tetramer + 세포 에피토프 특정 T 세포의 매우 높은 주파수를 포함하는 샘플의 언 바운드 분율에서 볼 수 있습니다. 이러한 경우, 에피토프 특정 T 세포의 수는 언 바운드 분획에 존재는 별도로 계산 바인딩 된 분율에있는 번호를 추가 할 수 있습니다. 따라서, 그림 2에서, 표본의 언 바운드 분율의 모든 세포의 농도는 (969분의 9,031) (200,000) (0.200/0.005) = 7.46 × 10 7 / ML, 모든 셀의 총 개수는 (7.46 X 10 7 / ML) (2.0) = 1.49 × 10 8, 에피토프 특정 CD4의 총 개수 + T 세포는 (1.49 × 10 8) (62.7 %) (96.4 %) (44.5 %) (54.7 %) (0.0409 %) = 8.97 × 10 3. 바운드와 언 바운드 분수의 번호를 추가, 1.53 × 10 4 + 8.97 × 10 3 = 2.43 있습니다 X10 4 총 에피토프 특정 CD4 + 전체 예제에서 T 세포. 에피토프 특정 셀 확장 충분히 강력한 경우 실제로, 농축 과정은 생략 할 수 있습니다.
| Fluorochrome | 항독소 |
| 태평양 블루 | 덤프 (B220, CD11b, CD11c, F4/80) |
| 태평양 오렌지 | CD8 |
| FITC | 3 번 CD |
| PE | pMHC tetramer 또는 phenotypic 마커 |
| PerCP | CD4 |
| APC | pMHC tetramer 또는 phenotypic 마커 |
| AlexaFluor 700 | CD44 |
표 1. 항체 염색법 전략을 제안
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그림 1. 에피토프 특정 CD4의 흐름 cytometric 분석 + pMHCII tetramer 기반의 강화에 따라 순진 쥐 T 세포. 대표 줄거리는 바운드 (A)와 언 바운드 (B) 분수에 표시됩니다. 문의 연속은 +, 측면 산란 - widthlo, 덤프 -, 3 번 CD + 이벤트 림프 - 분산을 선택하도록 설정되어 있습니다. 이들 중, CD4 + CD8 + 또는 이벤트가 에피토프 특정 T 세포 또는 배경 착색의 분석을 위해 출입을 금지합니다. 바운드 (C)와 언 바운드 (D) 분수에서 흠없는 셀의 Aliquots는 형광 세기 구슬과 혼합하여 별도로 분석했다. 한 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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에피토프 특정 CD4 + pMHCII tetramer 기반의 강화에 따라 펩타이드 - 예방 접종을 쥐 T 세포의 그림 2. 흐름 cytometric 분석. 대표 줄거리는 바운드 (A)와 언 바운드 (B) 분수에 표시됩니다. 문의 연속은 +, 측면 산란 - widthlo, 덤프 -, 3 번 CD + 이벤트 림프 - 분산을 선택하도록 설정되어 있습니다. 이들 중, CD4 + CD8 + 또는 이벤트가 에피토프 특정 T 세포 또는 배경 착색의 분석을 위해 출입을 금지합니다. 바운드 (C)와 언 바운드 (D) 분수에서 흠없는 셀의 Aliquots는 형광 세기 구슬과 혼합하여 별도로 분석했다. 한 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
박스 1. 에피토프 특정 T 세포 숫자의 계산
에피토프 특정 T 세포의 절대 숫자가 가장 형광 계산 구슬의 도움으로 계산됩니다. 흠없는의 나누어지는각 샘플의 세포는 유동 세포 계측법에 의해 분석 알려진 농도로 설정 구슬을 계산 한 다음에 정의 된 볼륨과 혼합되어 있습니다. 샘플에서 세포의 농도는 형광 계산 비즈 알려진 농도와의 주파수의 비교에서 유추 할 수 있습니다.
샘플에서 세포의 총수는 다음 전체 샘플 볼륨으로 세포 농도를 곱하여 계산됩니다.
샘플의 에피토프 특정 T 세포의 총 수는 단순히 tetramer - 긍정적 인 세포의 비율을 곱한 샘플에있는 모든 세포의 총 수입니다.
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Discussion
이 프로토콜에서 제공 pMHC tetramer 기반의 세포 농축 방법은 내생 T 세포 repertoires에서 에피토프 특정 T 세포를 연구하기위한 강력한 도구입니다. pMHC의 tetramers의 사용은 직접적으로 기원 pMHC 리간드를 구속하기 위해 자신의 TCRs의 능력에 따라 에피토프 특정 T 세포의 확인을 할 수 있습니다. 강화는 항원에 특정한 T 세포의 매우 희귀 한 인구는 자신의 유전 메이크업이나 전구체 주파수의 조작없이 T 세포의 내생 repertoires에서 감지 할 수 있도록 감도 수준을 제공합니다. 결과적으로,이 기술은 탐정 직접 면역 반응의 모든 단계를 통해 순진한 수준에서 생체 실험 시스템에서의 내생 항원에 특정한 T 세포 인구를 추적 할 수 있습니다.
이 프로토콜은 에피토프 특정 CD4 + 보조 림프 기관에서 T 세포를 풍부하게 pMHC 클래스 II (pMHCII) tetramers의 사용에 최적화되었습니다마우스 s입니다. 그러나, 기술은 pMHC 클래스 I (pMHCI) tetramers와 CD8 + T 세포 9 적용됩니다. CD4 달리, CD8의 coreceptor는 TCR-MHC 상호 작용을 안정화에 중요한 역할을 담당하고 있으며,이 pMHCI tetramer의 착색 10 실제 영향을 미칠 수 있습니다. 특히, CD8 항체의 사용은 CD8-tetramer 바인딩을 저해하지 않는 클론으로 제한해야합니다, 그들은 tetramer의 착색 후 셀에 추가해야합니다. 사실, 몇몇 pMHCI의 tetramers는 CD8 + T 세포에 특이 현상 바인딩 11,12을 완화 변이 MHCI-CD8 구속력이 사이트를 설계되었습니다.
Tetramer 농도, 배양 시간, 배양 온도는 크게 tetramer의 착색의 효율성에 영향을 미칠 수 있으며, 조건이 높은 tetramer 신호, 낮은 배경 신호, 낮은 tetramer의 국제화, 그리고 세포 생리학에 대한 최소한의 변경 최적의 조합을 달성하기 위해 최적화해야합니다. 이상적으로,이 조건은 B해야e는 경험적으로 고유 한 각 시약에 대한 결정. 우리 손에, 그러나, 10 nm의 최종 농도와 실내 온도에서 1 시간의 부화는 대부분의 pMHCI 또는 pMHCII tetramers에 좋은 일반적인 조건을 제공합니다. 일반적으로 pMHCI의 tetramers는 pMHCII의 tetramers보다 더 쉽게 얼룩 듯하고, 착색은 종종 최소 30 분 동안 4 ° C에서 수행 할 수 있습니다.
이 절차의 규모는 단일 샘플에 마우스 거의 모든 보조 림프 기관의 분석에 적합합니다. 따라서, 각 샘플은 마우스의 전체 순환 주변 T 세포 레퍼토리의 매우 포괄적 인 분석을 나타냅니다. 에피토프 특정 T 세포는 thymus 13,14 등의 기타 관련 조직에서 풍부하게 할 수 있습니다. 4-5주 기존 마우스의 thymii을 분석 할 때, 에피토프 별 하나의 긍정적 인 thymocytes는 주변 순진 T 세포의 비슷한 번호로 검색 할 수 있습니다. 에피토프 특정 더블 긍정적 thymocytes,그러나, 때문에 TCR 식의 자신의 낮은 수준으로 검출하기가 매우 어렵습니다.
이 프로토콜은 혈액이나 다른 조직 15-17에서 + 또는 CD8 + T 세포 에피토프 특정 인간 CD4을 감지하도록 구성 할 수 있습니다. 혈액의 100 ML 풀링 된 비장과 마우스 (18)의 림프절 등의 에피토프 특정 T 세포의 비교 숫자를 얻을거야 - 에피토프 특정 T 세포의 빈도는 약 마우스와 인간 17 사이의 동일 (50)의 분석 때문에.
tetramer 기반의 강화에 따라 셀의 흐름 cytometric 분석의 주요 과제는 배경에서 구별 진정한 휴대 이벤트입니다. 이것은 많은 autofluorescent 세포 과정에서 또한 비 특별히 풍부하게 있다는 사실에 크게 때문입니다. 조심스럽게 출입을 금지없는 경우 다음 autofluorescent 전지는 잘못된 tetramer 양성 세포로 표시 할 수 있으며, 특히 희귀 한 순진한 T 세포 P의 경우, 분석의 정확성을 던져opulations. 우리 프로토콜은 3 번 CD + 이벤트 거리 덤프 계보 (Lineage) + 이벤트, 그리고 CD4의 첫 번째 출입을 금지되는에 두 단계 게이팅 전략을 사용 + 이벤트 거리에 CD8 + 행사의 출입을 금지합니다. 이 과정에서 모든 FACS 음모의 대각선의 중심을 따라 거짓말을하는 경향이 autofluorescent 세포는 두 단계를 반복에 분석의 출입을 금지 부족합니다. autofluorescent 이벤트의 효과적인 제거는 많은 형광 색상의 비용이 부과됩니다, 그래서 우리는 높은 적어도 6 형광 매개 변수의 수 흐름 cytometers의 사용을 권장합니다.
대부분의 pMHC tetramers는 PE와 APC 이러한 fluorochromes의 밝기로 인해 복합 있으며, 안티-PE 및 안티 APC 자기 microbeads은 쉽게 그들과 함께 농축을 활성화 할 수 있습니다. 해당 자기 microbeads을 사용할 수 있습니다 그러나, 다른 fluorochromes도 너무 오래 사용하실 수 있습니다. 사실, 다른 fluorochrome 라벨 여러 tetramers는 해당 항체 - 복합 마이크와 함께 사용할 수 있습니다동시에 같은 샘플에서 여러 에피토프 특정 T 세포 인구를 풍성하게하기 위해 robeads. 우리는 PE 및 APC-라벨 tetramers (표 1)의 사용에 최적화되어 아주 기본적인 항체 - fluorochrome 설정을 설명했지만, 많은 다른 효과적인 조합은 phenotypic 마커의 연구에 유연성을 증가 가능합니다.
그들은 pMHCII의 리간드 (및 에피토프 별 CD8 + T 세포 강화에 대한 반대의 경우도 마찬가지)에 바인딩하지 말아야부터 CD8 + T 세포의 인구는 내부 대조군으로 사용할 수 있습니다. pMHCII의 epitopes에 간 제한 특이성과 타고난 tetramer - 긍정적 인 CD8 + T 세포는 매우 작은 주파수 19 존재할 수 있지만 예제에서 tetramer + CD8 + 세포의 주파수는, 배경 tetramer의 착색 수준의 좋은 평가를 제공합니다. 경우에 따라 매우 강력한 면역 반응을하는 동안,이 세포는 확장 된 주파수에서 발생할 수 있습니다. 원하는 경우, TCR 유전자 변형 T 세포의 지혜H 또는 관련 에피토프의 특이성이없는 추가적인 긍정적이고 부정적인 컨트롤로 사용할 수 있습니다. 알 수없는 이유로 일부 TCR 유전자 변형 세포와 hybridomas가 관련 tetramers 잘 착색하지 않습니다.
우리 프로토콜은 전화 번호의 계산을 지원하기 위해 형광 계산 구슬의 사용을 포함한다. 셀 카운트도 hemacytometer를 수동으로 달성 할 수 있지만, 우리는 훨씬 더 실험의 정밀도에 비즈 결과를 계산의 사용은 여러 조사가 포함 된 특히 것을 알게됩니다. 이 프로토콜에서 처리되는 세포의 작은 숫자와 볼륨으로 인해, 실험 오류의 최소화는 우선 순위가 높은해야합니다.
Tetramer의 착색은 세포 고정과 permeabilization와 호환 여러 연구가 성공적으로 tetramer 기반 세포 농축 20,21 다음 셀의 세포 크린 시토 킨과 전사 인자의 발현을 분석하고 있습니다.그러나, 관련된 추가 단계가 샘플의 추가 셀 손실에 기여하고있다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
저자는이 프로토콜의 개발에 도움을 젠킨스 연구소의 앙드레 한과 로렌스의 엔 기술 지원 및 회원 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PE or APC conjugated pMHC tetramer (or multimer) | Made by investigator, obtained from the NIH tetramer core, or purchased from commercial sources | ||
| Anti-PE conjugated magnetic microbeads | Miltenyi | 130-048-801 | |
| Anti-APC conjugated magnetic microbeads | Miltenyi | 130-090-855 | |
| LS magnetic columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MidiMACS or QuadroMACS magnet | Miltenyi | 130-042-302 or 130-090-976 | |
| Cell counting beads | Life Technologies | PCB-100 |
References
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- Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance. Science. 312, 114-116 (2006).
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