Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Peptid: MHC-Tetrameren und magnetische Mikrobeads zur niederfrequenten Populationen von Epitop-spezifischen T-Zellen zu isolieren und zu analysieren durch Durchflusszytometrie. Dieses Verfahren ermöglicht die direkte Untersuchung von endogenen T-Zell-Populationen von Interesse
Abstract
Eine Grundvoraussetzung für die Forscher studieren adaptiven Immunität in vivo experimentellen Modellen ist die Fähigkeit, T-Zellen auf ihren T-Zell-Antigenrezeptor (TCR)-Spezifität zu identifizieren. Viele indirekte Methoden zur Verfügung, in denen ein Schüttgut Population von T-Zellen in vitro mit einem Antigen und Epitop-spezifischer T-Zellen werden durch die Messung einer funktionalen Antwort wie Proliferation, Zytokinproduktion, oder Expression der Aktivierungsmarker 1 identifiziert wird angeregt. Jedoch sind diese Methoden nur identifizieren Epitop-spezifischen T-Zellen, die eine von vielen möglichen Funktionen, und sie sind nicht empfindlich genug, um Epitop-spezifischer T-Zellen bei naiven Vorstufe Frequenzen zu detektieren. Eine beliebte Alternative ist die TCR-transgene adoptiven Transfer Modell, in dem monoklonalen T-Zellen aus einem transgenen Maus TCR in histokompatiblen Hosts ausgesät, um eine große Population von Vorläufer-Epitop-spezifische T-Zellen, die easi sein könnenly mit der Verwendung eines kongenen Markerantikörper 2,3 nachverfolgt. Wenn leistungsfähig leidet dieses Verfahren aus experimentellen Artefakte mit der unphysiologischen Häufigkeit von T-Zellen mit einer Spezifität für ein einzelnes Epitop 4,5 zugeordnet. Darüber hinaus kann dieses System nicht verwendet, um die funktionelle Heterogenität der Epitop-spezifische T-Zell-Klone in einer polyklonalen Population untersuchen.
Der ideale Weg zur adaptiven Immunität studieren sollte den direkten Nachweis Epitop-spezifischer T-Zellen aus dem endogenen T-Zell-Repertoire mit einer Methode, TCR Aspekt unterscheidet ausschließlich durch dessen Bindung an cognate Peptid: MHC (pMHC)-Komplexe. Die Verwendung von Tetrameren pMHC und Durchflusszytometrie erreicht dieses 6, jedoch wird auf die Erfassung von hochfrequenten Populationen von Epitop-spezifischer T-Zellen nur gefunden folgenden antigeninduzierte klonale Expansion begrenzt. In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode, die die Verwendung von pMHC Tetramere koordiniert und magnetic Zellanreicherung Technologie, um Erkennung von extrem niederfrequenten Epitop-spezifischer T-Zellen aus der Maus Lymphgewebe 3,7. Mit dieser Technik kann ein umfassender verfolgen gesamte epitopspezifischen Populationen von endogenen T-Zellen in Mäusen in allen Stadien der Immunantwort.
Protocol
Ein. Zellisolation von Lymphgewebe
- 1 ml eiskaltem cEHAA (EHAA + 10% FBS, Pen / Strep, Gentamycin, 2 mM L-Glutamin, 55 mM 2-Mercaptoethanol) oder andere gleichwertige T-Zell-Medium auf eine 60 mm Kulturschale, die ein kleines Quadrat aus 100 mu m Nylon-Mesh und auf Eis stellen.
- Einschläfern Maus.
- Entfernen Sie die Milz und so viele leicht zugängliche Lymphknoten wie möglich. Diese sollten mindestens die Leistengegend, Achsel, brachial, Gebärmutterhals-und mesenterialen Lymphknoten. Legen Sie sie auf der Oberseite des Nylon-Mesh in der Kulturschale.
- Mit der flachen Oberseite eines geschlossenen 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, das Lymphgewebe sanft Maische über die Nylon-Mesh-Lymphozyten zu befreien. Hinzufügen 1 ml cEHAA angesetzt und nach oben und unten, um Zellen in einer Suspension zu arbeiten. Übertragen der Zellen durch ein anderes Stück Nylon Netzgewebe über der Oberseite einer 15 ml Polypropylen-Zentrifugenröhrchen gegeben. Spülen Sie das Geschirr und Mesh mit einem anderen 1 ml eiskaltem cEHAA, poOling die Volumina in das gleiche Rohr. Wiederholen, um einen endgültigen Zellsuspension Volumen von 4 ml zu erreichen.
- Hinzufügen kalten Sortierer (PBS + 2% FBS, 0,05% Azid) auf ein Endvolumen von 15 ml und zentrifugieren das Röhrchen 5 min bei 300 × g, 4 ° C
- Sorgfältig Überstand absaugen und sicherstellen, keine Flüssigkeitströpfchen auf den Seiten des Rohres verbleiben. Zellpellet in Fc-Block (Sorter Puffer + 2.4G2 Antikörper) auf ein Endvolumen gleich ungefähr das Doppelte des Pellets selber. Zum Beispiel können die Milz und Lymphknoten eines naiven Maus erzeugt gewöhnlich eine Zellpellet von etwa 100 ul. In diesem Fall fügen Sie 100 ul Fc-Block, um die Lautstärke zu 200 ul zu bringen. Wenn ein hohes Maß an Zelle Verklumpung aufgetreten ist, entfernen Sie vorsichtig die Zellklumpen an dieser Stelle mit einer Pipettenspitze.
2. Tetramerfärbung
- Hinzufügen PE-oder APC-markierten Tetramer pMHC zu einer Endkonzentration von 10 nM (oder empirisch optimiert Konzentration).
- Mix und Gründerzentrente für 1 Stunde bei Raumtemperatur (oder empirisch optimiert Zeit und Temperatur).
- Hinzufügen kalten Sortierer Puffer auf ein Volumen von 15 ml und zentrifugieren das Röhrchen 5 min bei 300 × g, 4 ° C Die Proben auf Eis oder bei 4 ° C von nun an.
- Sorgfältig Überstand absaugen und sicherstellen, keine Flüssigkeitströpfchen auf den Seiten des Rohres verbleiben. Zellpellet im Sortierer-Puffer auf ein Endvolumen von 200 ul. Für Doppel-Tetramer Bereicherung, resuspendieren auf ein Endvolumen von 150 ul.
3. Magnetische Anreicherung
- Fügen Sie 50 ul Miltenyi anti-PE-oder Anti-APC Mikrokügelchen. Für Doppel-Tetramer Bereicherung, werden 50 ul von beidem.
- Mischen und inkubieren für 20 min bei 4 ° C.
- Hinzufügen kalten Sortierer Puffer auf ein Volumen von 15 ml und zentrifugieren das Röhrchen 5 min bei 300 × g, 4 ° C
- Während der Wartezeit, die Einrichtung eines Miltenyi LS magnetischen Säule auf einem MidiMACS oder QuadroMACS Magnet. Positionieren Sie eine offene 15 ml Polypropylen-Zentrifugenröhrchen auf einemRack direkt unterhalb der Säule.
- 3 ml der Sortierer Puffer zu dem oberen Ende der Säule, so dass sie in den 15 ml-Röhrchen abzulassen.
- Legen Sie eine 100 mu m Nylon-Mesh Quadrat auf der Säule.
- Wenn die Zellen fertig sind Spinnen, sorgfältig absaugen Überstand und das Pellet in 3 ml Sortierer Puffer.
- Übertragen der Zellsuspension durch die Nylonnetz auf den Kopf der Kolonne.
- Wenn der Zellsuspension vollständig in der Säule abgelassen, spült das Originalbild mit einem anderen Rohr 3 ml Puffer Sortierer und übertragen die Puffer durch das Nylonnetz in die Kolonne, Spülen, die Maschen des Prozesses. Entsorgen Sie die Nylon Mesh.
- Wenn der Puffer in die Säule vollständig entleert, einen weiteren 3 ml Sortierer Puffer auf die Säule.
- Wiederholen Schritt 10 für insgesamt 3 x 3 ml Wäschen.
- Entfernen Sie die Säule vom Magneten und sich über einen neuen 15 ml Polypropylen-Zentrifugenröhrchen.
- 5 ml Sortierer Puffer ter Spalte.
- Sofort übernehmen den Kolben in den Kopf der Kolonne und in einer kontinuierlichen Bewegung, drücken den Kolben ganz nach unten, wodurch der Puffer aus der Kolonne in die Röhre.
- Die Röhrchen enthaltend das eluierte gebundenen Fraktion und die Durchströmung ungebundenen Fraktion für 5 min bei 300 × g, 4 ° C
- Sorgfältig Aspiration des Überstands von der gebundenen Fraktion, wodurch sicher, dass keine Flüssigkeitströpfchen auf den Seiten des Rohres verbleiben. Zellpellet in Sortierer Puffer auf ein Endvolumen von genau 95 ul. Ansaugen und resuspendieren ungebundene Fraktion auf ein Endvolumen von 2 ml.
4. Durchflusszytometrie
- Für jede Fraktion, entfernen 5 ul und in 200 ul Zählen Wülste (eingestellt auf eine Konzentration von 200.000 / ml in Sortierer Puffer) in einem 5 ml FACS-Röhrchen. Beiseite bei 4 ° C für eine spätere Analyse. Um Zeit zu sparen, können Perlen beschrifteten Röhrchen werden vor dem Beginn des Experiments vor-aliquotiert.
- Bereiten Uhraster Mischung von Antikörpern zu färben Oberflächenmarker auf den Zellen (Tabelle 1). Um Zeit zu sparen, kann diese vor dem Beginn des Experiments durchgeführt werden.
- Für die gebundene Fraktion, einen Dosis von Antikörper-Cocktail direkt mit dem ~ 90 ul Zellen in der Röhre. Wenn eine Analyse der ungebundenen Fraktion gewünscht wird, können 90 ul Zellen zu einem 5 ml FACS-Röhrchen und fügen Sie eine Dosis von Antikörper-Cocktail.
- Einsetzung eines Panels von einfarbigen Entschädigung Kontrollen für das Durchflusszytometer. Für jedes Fluorochrom verwendet werden, mischen 50 ul übriggebliebene ungebundenen Fraktion Zellen in einem 5 ml FACS-Röhrchen mit 1 ul des anti-CD4-Antikörper, konjugiert mit dem entsprechenden Fluorochrom ist. Denken Sie daran, Einrichten eines ungefärbten Kontrolle.
- Wirbel und inkubieren alle Proben für 30 min bei 4 ° C.
- 5 ml Sortierer Puffer zu jedem Röhrchen und Zentrifuge 5 min bei 300 × g, 4 ° C
- Für die gebundene Fraktion, sorgfältig absaugen Überstand und Zellen in 200 ul Sortierer buffer. Übertragen der Zellen in einem 1,2 ml Microtube FACS. Spülen Sie das Rohr mit einem anderen 200 ul Sorter-Puffer und Pool in der gleichen Mikroröhrchen. Wenn Zellklumpen offensichtlich sind, passieren die Zellen durch ein 50 um-Filter.
- Für die ungebundene Fraktion und Entschädigung Kontrollen, dekantieren oder absaugen Überstand und resuspendieren in 2 ml Sortierer Puffer.
- Einrichten des Durchflusszytometer unter Verwendung der Single-Farbkompensation Kontrollen. Wählen Seitenstreuung-Breite (SSC-W) als ein zusätzlicher Parameter aufgezeichnet werden.
- Analysieren der gefärbten Proben unter Verwendung einer Sequenz von aufeinanderfolgenden Aufnahme Gates an CD4 identifizieren + oder CD8 + T-Zellen wie in den 1 und 2 dargestellt. Bei gebundenen Fraktionen, sammeln Sie so viele Zellen wie möglich bis zu einem Maximum von 2.000.000 insgesamt Veranstaltungen. Für ungebundenen Fraktionen sammeln 1.000.000 insgesamt Veranstaltungen. Halten Sie die Akquisition bei oder unterhalb von 3.000 Ereignisse pro Sekunde.
- Mit den gleichen Geräteeinstellungen, analysieren die Zählung bead Proben. Sammle 10.000 insgesamt Veranstaltungen. </ Li>
- Speichern Sie alle Daten, wie FCS-Dateien.
5. Data Analysis
- Analysieren FCS Datendateien für die Zählung bead Proben mit FlowJo Software. Plot Vorwärtsstreuung von FITC und setzen ein Tor aroung die Zählergebnisse Perlen (siehe Abbildungen 1 und 2). Ermitteln der Gesamtanzahl der Zählung Wülste in jeder Probe detektiert. Subtrahieren von der Gesamtanzahl der erfassten Ereignisse, die Anzahl der gesammelten Ereignisse Zelle zu bestimmen.
- Berechne die Anzahl aller Zellen in jeder Probe unter Verwendung der Gleichungen, die in Kasten 1 dargelegt.
- Analysieren FCS-Dateien für den gefärbten gebundenen und ungebundenen Fraktion Proben. Einrichten einer Abfolge von aufeinanderfolgenden Aufnahme Tore zu lymphoiden +, Side-Scatter-Breiten-lo, dump-, CD3 +, CD4 + oder CD8 +, Tetramer +-T-Zellen in jeder Probe wie in den 1 und 2 dargestellt. Identifizieren
- Multiplizieren die Gesamtzahl der Zellen in der Probe durch die Frequenzen jedes der Aufnahme-Gatter verwendet werden, um CD4 + definieren Tetramer+ Oder CD8 +-Tetramer +-Zellen, um die Gesamtzahl von Epitop-spezifischen T-Zellen (Kasten 1) zu berechnen.
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Representative Results
1 zeigt repräsentativ Durchflusszytometrie Parzellen pMHCII Tetramer angereicherten Milz und Lymphknoten-Proben von naiven Mäusen, während 2 zeigt repräsentative Daten für Mäuse zuvor mit dem jeweiligen Peptid + CFA immunisiert. Serielle Gating entfernt Autofluoreszenzlichtbild und andere unerwünschte Ereignisse aus der Analyse der CD4 + T-Zellpopulationen. Die CD8 + T-Zell-Population dient als nützliche interne negative Kontrolle für pMHCII Tetramerfärbung von CD4 + T-Zellen. Beachten Sie, dass gebundene Fraktionen aus der Anreicherung enthalten in der Regel einen deutlich höheren Anteil an autofluoreszierenden Zellen als die ungebundenen Fraktionen, was Gating schwieriger.
Absolute Zahlen von Epitop-spezifischer T-Zellen in einer Probe durch Multiplizieren der Gesamtzahl von allen Zellen in der gebundenen Fraktion der angereicherten Probe, wie von dem Wulst Zählung Analyse bestimmt berechnet, wobei der Anteil dieser Zellen, die Tetramer + sind, als Bestimmungned aus der Zelle Färbung Analyse (Kasten 1).
Für den naiven Maus in 1 ist die Konzentration aller Zellen in der gebundenen Fraktion der Probe (4411/5589) (200.000) (0.200/0.005) = 6,31 x 10 6 / ml. Die Gesamtzahl aller Zellen in der Probe ist (6,31 x 10 6 / ml) (0,095) = 6,00 x 10 5. Schließlich ist die Gesamtzahl der Epitop-spezifische CD4 + T-Zellen (6,00 x 10 5) (41,5%) (96,6%) (10,2%) (62,3%) (0,64%) = 98.
Für den immunisierten Maus in 2 gezeigt, ist die Konzentration von allen Zellen in der gebundenen Fraktion der Probe (6410/3590) (200.000) (0.200/0.005) = 1,43 x 10 7 / ml. Die Gesamtzahl aller Zellen in der Probe ist (1,43 x 10 7 / ml) (0,095) = 1,36 x 10 6 beträgt. Schließlich ist die Gesamtzahl der Epitop-spezifische CD4 + T-Zellen (1.36 x 10 6) (40.9%) (93.9%) (9,54%) (72,0%) (42,7%) = 1.53 x 10 4 </ Strong>.
Der Wirkungsgrad sinkt Anreicherung wie die Anzahl der Epitop-spezifische T-Zellen erhöht 8, so Tetramer +-Zellen können in der ungebundenen Fraktion von Proben mit sehr hohen Frequenzen von Epitop-spezifische T-Zellen zu erkennen. In solchen Fällen stellen die Zahl der Epitop-spezifischer T-Zellen in der ungebundenen Fraktion kann separat berechnet werden und zu der Zahl in der gebundenen Fraktion gefunden. Daher ist in Abbildung 2 ist die Konzentration aller Zellen in der ungebundenen Fraktion der Probe (9031/969) (200.000) (0.200/0.005) = 7,46 x 10 7 / ml, ist die Gesamtzahl aller Zellen (7,46 x 10 7 / ml) (2,0) = 1,49 x 10 8 und die Gesamtanzahl der Epitop-spezifische CD4 + T-Zellen ist (1,49 x 10 8) (62,7%) (96,4%) (44.5%) (54.7%) (0,0409 %) = 8,97 x 10 3. Addieren der Zahlen in den gebundenen und ungebundenen Fraktionen gibt 1,53 x 10 4 + 8,97 x 10 3 = 2,43 x10 4 insgesamt Epitop-spezifischen CD4 + T-Zellen in der gesamten Probe. In der Tat, wenn Epitop-spezifischen Zell-Expansion robust genug ist, kann die Anreicherung übersprungen werden.
| Fluorochrom | Antikörper |
| Pacific Blue | dump (B220, CD11b, CD11c, F4/80) |
| Pacific orange | CD8 |
| FITC | CD3 |
| PE | pMHC Tetramer oder phänotypische Marker |
| PerCP | CD4 |
| APC | pMHC Tetramer oder phänotypische Marker |
| AlexaFluor 700 | CD44 |
Tabelle 1. Empfohlene Antikörperfärbung Strategie
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Abbildung 1. Durchflusszytometrieanalyse von Epitop-spezifischen CD4 + T-Zellen in naiven Mäusen nach pMHCII Tetramer-basierten Anreicherung. Repräsentative Plots für die Schranke (A) und ungebundenen (B) Fraktionen dargestellt. Eine Reihe von Toren sind so eingestellt, lymphatischen-Streuung wählen Sie +, Side-Scatter-widthlo, dump-, CD3 + Veranstaltungen. Von diesen CD4 + oder CD8 + Ereignisse sind gated zur Analyse von Epitop-spezifische T-Zellen oder Hintergrundfärbung. Aliquots von ungefärbten Zellen aus dem gebundenen (C) und ungebundenen (D) Fraktion wurden mit fluoreszierenden Zählen Kügelchen vermischt und separat analysiert. Hier eine größere Zahl anzuzeigen .
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Abbildung 2. Durchflusszytometrieanalyse von Epitop-spezifischen CD4 + T-Zellen in der Peptid-immunisierten Mäusen nach pMHCII Tetramer-basierten Anreicherung. Repräsentative Plots für die Schranke (A) und ungebundenen (B) Fraktionen dargestellt. Eine Reihe von Toren sind so eingestellt, lymphatischen-Streuung wählen Sie +, Side-Scatter-widthlo, dump-, CD3 + Veranstaltungen. Von diesen CD4 + oder CD8 + Ereignisse sind gated zur Analyse von Epitop-spezifische T-Zellen oder Hintergrundfärbung. Aliquots von ungefärbten Zellen aus dem gebundenen (C) und ungebundenen (D) Fraktion wurden mit fluoreszierenden Zählen Kügelchen vermischt und separat analysiert. Hier eine größere Zahl anzuzeigen .
Box 1. Berechnung der Epitop-spezifische T-Zellzahlen
Absolute Zahlen Epitop-spezifischer T-Zellen werden am besten mit Hilfe von fluoreszierenden Kügelchen Zählen berechnet. Ein Aliquot von ungefärbtenZellen aus jeder Probe wird mit einem definierten Volumen des Zählens Sicken bei einer bekannten Konzentration eingestellt und dann mittels Durchflusszytometrie analysiert vermischt. Die Konzentration der Zellen in der Probe aus dem Vergleich ihrer Frequenz mit der bekannten Konzentration von fluoreszierenden Kügelchen Zählen entnehmen.
Die Gesamtzahl der Zellen in der Probe wird dann durch Multiplikation des Zellkonzentration mit der gesamten Probenvolumen berechnet.
Die Gesamtzahl der Epitop-spezifische T-Zellen in der Probe ist einfach die Anzahl aller Zellen in der Probe durch den Prozentsatz der Zellen, die Tetramer-positiven multipliziert.
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Discussion
Die pMHC Tetramer basierte Anreicherung von Zellen-Methode von diesem Protokoll vorgestellt ist ein leistungsfähiges Werkzeug für das Studium Epitop-spezifischer T-Zellen aus körpereigenen T-Zellen Repertoires. Die Verwendung von Tetrameren pMHC ermöglicht Nachweis Epitop-spezifischer T-Zellen direkt auf die Fähigkeit ihrer TCRs auf artverwandten pMHC Liganden binden. Die Anreicherung stellt einen Grad der Empfindlichkeit derart, dass extrem selten Populationen von Antigen-spezifischen T-Zellen aus endogenen Repertoires von T-Zellen können ohne Manipulation seine genetischen oder Vorläufer Frequenz erfaßt werden. Als Ergebnis ermöglicht diese Technik der Ermittler direkt verfolgen endogenen Antigen-spezifischen T-Zell-Populationen aus in vivo experimentellen Systemen aus ihren Ebenen naiven durch alle Stufen der Immunantwort.
Dieses Protokoll ist für den Einsatz von pMHC II (pMHCII) Tetramere wurden optimiert, um Epitop-spezifischen CD4 + T-Zellen von der sekundären lymphatischen Organ bereicherns von Mäusen. Jedoch ist das Verfahren auch anwendbar auf Klasse I pMHC (pMHCI) Tetramere und CD8 + T-Zellen 9. Im Gegensatz zu CD4, CD8 Korezeptor spielt die eine bedeutende Rolle bei der Stabilisierung TCR-MHC-Wechselwirkungen, und dies kann zur praktischen Implikationen pMHCI Tetramerfärbung 10 aufweisen. Vor allem sollte die Verwendung von Antikörpern gegen CD8 Klone, nicht beeinträchtigen CD8-Tetramer Bindung beschränken, und sie sollten zu Zellen nach Tetramerfärbung zugesetzt werden. Tatsächlich haben einige Tetramere pMHCI mit mutierten MHCI-CD8 Bindungsstellen ausgeführt worden, um eine unspezifische Bindung an CD8 + T-Zellen 11,12 mildern.
Tetramer Konzentration, Inkubationszeit und Inkubationstemperatur stark beeinflussen können die Effizienz Tetramerfärbung, und Bedingungen zu optimieren, um die beste Kombination von hoher Tetramer Signal niedrigen Hintergrundsignal, niedrige Tetramer Internalisierung und minimalen Änderungen an Zellphysiologie zu erzielen. Idealerweise sollten diese Bedingungen be empirisch für jeden eindeutigen Reagenz bestimmt. In unseren Händen sieht jedoch vor, eine Endkonzentration von 10 nM und eine Inkubation von 1 h bei Raumtemperatur gut generische Bedingungen für die meisten pMHCI oder pMHCII Tetramere. Im allgemeinen scheinen pMHCI Tetramere leichter als Fleck pMHCII Tetramere und Färbung kann oft bei 4 ° C für weniger als 30 min durchgeführt werden.
Das Ausmaß dieser Prozedur wird für die Analyse von fast allen sekundären lymphatischen Organen einer Maus in einer einzelnen Probe geeignet. Daher stellt jede Probe eine ziemlich umfassende Analyse des gesamten zirkulierenden peripheren T-Zell-Repertoire einer Maus. Epitop-spezifischer T-Zellen können auch aus anderen relevanten Geweben, einschließlich des Thymus 13,14 angereichert werden. Wenn thymii 4-5 Wochen alten Mäusen analysiert werden, kann epitopspezifischen einzelne positive Zahlen an Thymozyten ähnlich denen der periphere naiven T-Zellen erkannt werden. Epitop-spezifischen doppelt positiven Thymozyten,sind jedoch sehr schwierig, aufgrund ihrer niedrigen TCR-Expression zu erkennen.
Dieses Protokoll kann auch angepasst ist, um Epitop-spezifischen humanen CD4 erkennen + oder CD8 + T-Zellen im Blut oder anderen Geweben 15-17 werden. Die Häufigkeit der Epitop-spezifischer T-Zellen in etwa gleich zwischen Maus und Mensch 17, so dass die Analyse von 50 - 100 ml Blut wäre vergleichbaren Anzahl von Epitop-spezifischer T-Zellen als gepoolt Milz und Lymphknoten einer Maus 18 zu ergeben.
Eine große Herausforderung bei der durchflusszytometrischen Analyse von Zellen nach Tetramer-basierte Anreicherung Unterscheidungsmerkmal wahre Zelle Ereignisse Hintergrund. Dies ist hauptsächlich auf die Tatsache, dass viele autofluoreszierenden Zellen auch unspezifisch angereichert während des Prozesses. Wenn nicht sorgfältig ausgeblendet, können diese Zellen als falsch autofluoreszierenden Tetramer-positiven Zellen erscheinen und werfen die Genauigkeit der Analyse, insbesondere im Fall von seltenen naive T-Zell-populations. Unser Protokoll verwendet ein zweistufiges Gating Strategie, in der CD3 + Veranstaltungen sind erste gated vom Dump Linie + Ereignisse, und dann CD4 + Veranstaltungen sind gated vom CD8 + Veranstaltungen. In diesem Prozess sind autofluoreszierenden Zellen, die sich entlang der Mitte jeder diagonalen FACS Plot liegen neigen, gated aus der Analyse in zwei Iterationsschritte. Die Beseitigung von autofluoreszierenden Veranstaltungen geht auf Kosten der vielen fluoreszierenden Farben, so empfehlen wir die Verwendung von Durchflusszytometern Lage von mindestens 6 fluoreszierenden Parameter.
Meist pMHC Tetramere an PE konjugiert und APC aufgrund der Helligkeit dieser Fluorochrome, und Anti-PE und anti-APC magnetische Mikroperlen sind leicht verfügbar zu einer Anreicherung mit ihnen zu ermöglichen. Jedoch können auch andere Fluorochrome auch so verwendet werden, solange entsprechende magnetische Mikrobeads zur Verfügung stehen. Tatsächlich können mehrere Tetramere mit unterschiedlichen Fluorochrom Etiketten zusammen mit dem entsprechenden Antikörper-konjugierten Mikrofon verwendet werdenrobeads gleichzeitig bereichern Multi-Epitop-spezifische T-Zell-Populationen aus derselben Probe. Wir haben eine sehr einfache Antikörper-Setup, das Fluorochrom für die Verwendung von PE-und APC-markierten Tetrameren (Tabelle 1) optimiert wird dargelegt, aber viele andere wirksame Kombinationen sind möglich, um die Flexibilität in der Studie der phänotypische Marker erhöhen.
CD8 +-T-Zellpopulationen kann als interne negative Kontrolle verwendet werden, da sie nicht auf pMHCII Liganden (und umgekehrt für Epitop-spezifischen CD8 + T-Zell-Anreicherung) binden sollte. Die Häufigkeit der Tetramer + CD8 +-Zellen in einer Probe stellt eine gute Bewertung des Ausmaßes von Hintergrund Tetramerfärbung, obwohl gutgläubiger Tetramer-positiven CD8 + T-Zellen mit Kreuz-restringierte Epitope Spezifität an pMHCII bei sehr kleinen Frequenzen 19 existieren kann. Gelegentlich während sehr starke Immunantworten können diese Zellen bei expandiertem Frequenzen existieren. Wenn gewünscht, TCR transgenen T-Zellen with oder ohne relevante Epitop-Spezifität als zusätzliche positive und negative Kontrollen verwendet werden. Beachten Sie, dass aus unbekannten Gründen einige TCR transgenen Zellen und Hybridome nicht gut färben mit ihren entsprechenden Tetramere.
Unser Protokoll beinhaltet die Verwendung von fluoreszierenden Kügelchen Zählen in die Berechnung der Zellzahlen unterstützen. Während Zellzahlen kann auch manuell mit einem Hämozytometer erreicht werden, finden wir, dass die Verwendung des Zählens Kügelchen führt zu viel größere experimentelle Genauigkeit, insbesondere wenn mehrere Ermittler beteiligt sind. Aufgrund der geringen Anzahl und Volumen der Zellen, die in diesem Protokoll behandelt werden, sollte die Minimierung des experimentellen Fehlers eine hohe Priorität eingeräumt werden.
Tetramerfärbung ist kompatibel mit Handy Fixierung und Permeabilisierung, und mehrere Studien haben erfolgreich intrazelluläre Zytokin-und Transkriptionsfaktor-Expression in Zellen nach Tetramer-basierte Zellanreicherung 20,21 analysiert.Gleichwohl tragen die zusätzlichen Schritte involviert zusätzliche Zellverluste in den Proben.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Andre Han und Lawrence Yen für die technische Unterstützung, und die Mitglieder der Jenkins Labor für Hilfe bei der Entwicklung dieses Protokolls danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PE or APC conjugated pMHC tetramer (or multimer) | Made by investigator, obtained from the NIH tetramer core, or purchased from commercial sources | ||
| Anti-PE conjugated magnetic microbeads | Miltenyi | 130-048-801 | |
| Anti-APC conjugated magnetic microbeads | Miltenyi | 130-090-855 | |
| LS magnetic columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MidiMACS or QuadroMACS magnet | Miltenyi | 130-042-302 or 130-090-976 | |
| Cell counting beads | Life Technologies | PCB-100 |
References
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