Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

मिलान विशेष टी कोशिकाओं की MHC tetramer आधारित संवर्धन: पेप्टाइड

Published: October 22, 2012 doi: 10.3791/4420
Automatic Translation
1, 1
1Center for Immunology and Inflammatory Diseases, and Pulmonary and Critical Care Unit, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

Summary

MHC tetramers और चुंबकीय microbeads मिलान विशेष टी कोशिकाओं की कम आवृत्ति आबादी को अलग करने और उन्हें प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण: इस प्रोटोकॉल पेप्टाइड के उपयोग का वर्णन करता है. इस विधि अंतर्जात से ब्याज की टी सेल की आबादी के प्रत्यक्ष अध्ययन के लिए सक्षम बनाता है

Protocol

1. Lymphoid ऊतक से सेल अलगाव

  1. बर्फ के ठंडे (EHAA + 10% FBS, कलम / strep, gentamycin, 2 मिमी एल glutamine, 55 मिमी 2-mercaptoethanol) cEHAA या अन्य समकक्ष टी सेल मध्यम 1 मिलीग्राम एक 60 मिमी संस्कृति का एक छोटा सा वर्ग युक्त पकवान, जोड़ें 100 सुक्ष्ममापी नायलॉन और बर्फ पर जाल जगह.
  2. माउस euthanize.
  3. तिल्ली और के रूप में कई में संभव के रूप में आसानी से सुलभ लिम्फ नोड्स निकालें. वंक्षण, कम से कम कक्षा, बाहु, गर्भाशय ग्रीवा, और mesenteric लिम्फ नोड्स को शामिल करना चाहिए. उन्हें संस्कृति डिश में नायलॉन जाल के शीर्ष पर रखें.
  4. एक बंद 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब के फ्लैट टॉप का प्रयोग, धीरे मैश नायलॉन जाल खत्म करने के लिए लिम्फोसाइटों को आजाद कराने lymphoid ऊतक. जोड़ें cEHAA और pipet ऊपर और नीचे के एक और 1 मिलीलीटर के निलंबन में कोशिकाओं काम. नायलॉन एक 15 मिलीलीटर polypropylene अपकेंद्रित्र ट्यूब के शीर्ष पर रखा जाल का एक और टुकड़ा के माध्यम से कोशिकाओं का स्थानांतरण. और बर्फ के ठंडे cEHAA, पुलिस के एक और 1 मिलीलीटर के साथ पकवान जाल कुल्लाउसी ट्यूब में संस्करणों oling. 4 मिलीलीटर की एक अंतिम सेल निलंबन मात्रा में प्राप्त दोहराएँ.
  5. ठंड सॉर्टर बफर जोड़ें (पीबीएस + 2% FBS, 0.05% AZIDE) 15 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा और 5 मिनट के लिए 300 XG पर ट्यूब, अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस
  6. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला aspirate, यकीन है तरल का कोई बूंदों ट्यूब के पक्षों पर छोड़ दिया जाता है. एक अंतिम गोली के ही लगभग है कि दो बार के बराबर मात्रा एफसी ब्लॉक (सॉर्टर बफर + 2.4G2 एंटीबॉडी) में सेल गोली Resuspend. उदाहरण के लिए, एक अनुभवहीन माउस के प्लीहा और लिम्फ नोड्स आमतौर पर गोली के बारे में 100 μl की एक सेल का उत्पादन. इस मामले में, एफसी ब्लॉक के 100 μl जोड़ने के लिए 200 μl मात्रा में लाने के लिए. यदि सेल clumping की एक बड़ी डिग्री हुआ है, ध्यान से इस बिंदु पर एक pipet टिप के साथ सेल पेड़ों का झुरमुट को हटा दें.

2. Tetramer धुंधला

  1. 10 एनएम (या empirically अनुकूलित एकाग्रता) की एक अंतिम एकाग्रता पीई या APC लेबल pMHC टेट्रामर जोड़ें.
  2. मिक्स और incubaकमरे के तापमान (या empirically अनुकूलित समय और तापमान) में 1 घंटे के लिए ते.
  3. 15 मिलीलीटर की मात्रा के लिए ठंड सॉर्टर बफर जोड़ें और 5 मिनट के लिए 300 XG, 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब अपकेंद्रित्र बर्फ पर या 4 ° C अब से नमूने रखें.
  4. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला aspirate, यकीन है तरल का कोई बूंदों ट्यूब के पक्षों पर छोड़ दिया जाता है. सेल सॉर्टर बफर में गोली 200 μl की एक अंतिम मात्रा Resuspend. डबल टेट्रामर संवर्धन के लिए, 150 μl की एक अंतिम मात्रा resuspend.

3. चुंबकीय संवर्धन

  1. विरोधी पीई Miltenyi या विरोधी APC microbeads के 50 μl जोड़ें. डबल टेट्रामर संवर्धन के लिए दोनों की 50 μl जोड़ें.
  2. मिश्रण और 4 पर 20 मिनट के लिए सेते हैं ° सी.
  3. 15 मिलीलीटर की मात्रा के लिए ठंड सॉर्टर बफर जोड़ें और 5 मिनट के लिए 300 XG, 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब अपकेंद्रित्र
  4. जबकि इंतज़ार कर रही है, एक MidiMACS या QuadroMACS चुंबक पर एक Miltenyi रास चुंबकीय स्तंभ सेट. एक पर एक खुला 15 मिलीलीटर polypropylene अपकेंद्रित्र ट्यूब स्थितिस्तंभ के नीचे सीधे रैक.
  5. स्तंभ के शीर्ष सॉर्टर बफर के 3 मिलीलीटर जोड़ें, यह 15 मिलीलीटर ट्यूब में पलायन करने के लिए अनुमति देता है.
  6. स्तंभ के शीर्ष पर एक 100 सुक्ष्ममापी नायलॉन जाल वर्ग रखें.
  7. जब कोशिकाओं कताई समाप्त कर दिया है, ध्यान से सतह पर तैरनेवाला aspirate और सॉर्टर बफर के 3 मिलीग्राम में गोली resuspend.
  8. स्तंभ के शीर्ष पर नायलॉन जाल के माध्यम से सेल निलंबन स्थानांतरण.
  9. जब सेल निलंबन स्तंभ में पूरी तरह से सूखा है, सॉर्टर बफर का एक और 3 मिलीग्राम के साथ मूल ट्यूब कुल्ला और स्तंभ में नायलॉन जाल के माध्यम से बफर हस्तांतरण प्रक्रिया में जाल rinsing. नायलॉन जाल त्यागें.
  10. जब बफर स्तंभ में पूरी तरह से सूखा है, स्तंभ सॉर्टर बफर का एक और 3 मिलीलीटर जोड़ने.
  11. दोहराएँ कदम 3 x 3 मिलीलीटर washes के एक कुल के लिए 10.
  12. चुंबक और एक नया 15 मिलीलीटर polypropylene अपकेंद्रित्र ट्यूब पर जगह से स्तंभ निकालें.
  13. टी सॉर्टर बफर के 5 मिलीलीटर जोड़ेंवह स्तंभ.
  14. तत्काल इस स्तंभ के शीर्ष में सवार डालने और एक सतत गति में सवार सभी तरह नीचे धक्का, स्तंभ बाहर ट्यूब में बफर मजबूर.
  15. Eluted बाध्य अंश और 5 मिनट के लिए अबाध प्रवाह के माध्यम से अंश 300 XG में 4 डिग्री सेल्सियस युक्त ट्यूबों अपकेंद्रित्र
  16. बाध्य अंश से ध्यान तैरनेवाला aspirate, यकीन है तरल का कोई बूंदों ट्यूब के पक्षों पर छोड़ दिया जाता है. सेल सॉर्टर बफर में गोली बिल्कुल 95 μl की एक अंतिम मात्रा Resuspend. Aspirate और 2 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा अनबाउंड अंश resuspend.

4. फ्लो

  1. प्रत्येक अंश के लिए, 5 μl हटाने और गिनती मोतियों की एक 5 मिलीलीटर FACS ट्यूब में 200 (200,000 सॉर्टर बफर में मिलीग्राम / के एक एकाग्रता के लिए समायोजित) μl जोड़ें. 4 में अलग सेट ° विश्लेषण के लिए बाद में एक सी है. समय बचाने के लिए, मोती किया जा सकता है लेबल ट्यूबों को प्रयोग के शुरू होने से पहले पूर्व aliquoted.
  2. हूँ तैयार करेंaster एंटीबॉडी के मिश्रण कोशिकाओं की सतह पर मार्कर (1 टेबल) दाग. समय बचाने के लिए, इस प्रयोग के शुरू करने के लिए पहले किया जा सकता है.
  3. बाध्य अंश के लिए एंटीबॉडी कॉकटेल की एक खुराक सीधे जोड़ ट्यूब में ~ 90 कोशिकाओं के μl. यदि अनबाउंड अंश का विश्लेषण वांछित है, एक 5 मिलीलीटर FACS ट्यूब कोशिकाओं के 90 μl हस्तांतरण और एंटीबॉडी कॉकटेल की एक खुराक जोड़ने.
  4. प्रवाह cytometer लिए एकल रंग मुआवजा नियंत्रण के एक पैनल सेट. प्रत्येक के लिए इस्तेमाल किया जा fluorochrome के लिए, एक 5 मिलीलीटर FACS ट्यूब में विरोधी CD4 इसी fluorochrome संयुग्मित एंटीबॉडी के 1 μl साथ बचे हुए अपार अंश कोशिकाओं के 50 μl मिश्रण. याद करने के लिए एक अस्थिर नियंत्रण के रूप में अच्छी तरह से सेट.
  5. भंवर और 30 मिनट के लिए 4 में सभी नमूनों सेते हैं ° सी.
  6. प्रत्येक ट्यूब और अपकेंद्रित्र 300 XG, 4 डिग्री सेल्सियस से कम 5 मिनट के लिए सॉर्टर बफर के 5 मिलीलीटर जोड़ें
  7. अंश के लिए बाध्य है, ध्यान से सतह पर तैरनेवाला aspirate और सॉर्टर buf के 200 μl में कोशिकाओं resuspendfer. एक 1.2 मिलीलीटर FACS microtube में कोशिकाओं का स्थानांतरण. सॉर्टर बफर और पूल के एक ही microtube में एक और 200 μl के साथ ट्यूब कुल्ला. यदि सेल clumps स्पष्ट कर रहे हैं, एक 50 सुक्ष्ममापी फिल्टर के माध्यम से कोशिकाओं गुजरती हैं.
  8. अनबाउंड अंश और मुआवजा नियंत्रण, पसाना या तैरनेवाला और resuspend में 2 मिलीलीटर सॉर्टर बफर aspirate.
  9. प्रवाह cytometer एकल रंग मुआवजा नियंत्रण का उपयोग कर सेट करें. एक अतिरिक्त पैरामीटर के रूप में दर्ज किया जा तितर बितर चौड़ाई (एसएससी डब्ल्यू) की ओर से चयन करें.
  10. दाग लगातार शामिल किए जाने के फाटक के एक दृश्य का उपयोग करने के लिए की पहचान CD4 + या CD8 + टी कोशिकाओं के रूप में आंकड़े 1 और 2 में सचित्र के नमूनों का विश्लेषण. बाध्य भागों के लिए संभव के रूप में के रूप में कई कोशिकाओं 2,000,000 कुल घटनाओं की एक अधिकतम इकट्ठा. अनबाउंड भागों के लिए, 1000000 कुल ईवेंट इकट्ठा. अधिग्रहण की दर में या 3000 के नीचे घटना प्रति सेकेंड रखें.
  11. एक ही मशीन सेटिंग्स का उपयोग, गिनती मनका नमूनों का विश्लेषण. 10,000 कुल ईवेंट ले लीजिए. </ Li>
  12. FCS फ़ाइलों के रूप में सभी डेटा सहेजें.

5. डेटा विश्लेषण

  1. गिनती मनका FlowJo सॉफ्टवेयर का उपयोग कर नमूने के लिए FCS डेटा फ़ाइलों का विश्लेषण. प्लॉट FITC द्वारा आगे तितर बितर और एक गिनती मोती aroung फाटक (आंकड़े 1 और 2) सेट. प्रत्येक नमूने में पाया मोतियों की गिनती की कुल संख्या का निर्धारण करते हैं. सेल एकत्र की घटनाओं की संख्या का निर्धारण करने के लिए एकत्र की घटनाओं की कुल संख्या से घटाएँ.
  2. प्रत्येक नमूने में सभी कोशिकाओं की कुल संख्या 1 बॉक्स में उल्लिखित समीकरण का उपयोग कर की गणना.
  3. दाग बाध्य और अबाध अंश नमूने के लिए FCS डेटा फ़ाइलों का विश्लेषण. लगातार शामिल किए जाने के फाटक के एक दृश्य सेट lymphoid + पक्ष तितर बितर चौड़ाई लो, डंप, CD3, CD4 + या सीडी 8 +, प्रत्येक नमूने में tetramer + टी कोशिकाओं के रूप में आंकड़े 1 और 2 में सचित्र. की पहचान
  4. शामिल किए जाने CD4 को परिभाषित करने के लिए प्रयोग किया जाता द्वार में से प्रत्येक के आवृत्तियों + टेट्रामर द्वारा नमूना में कोशिकाओं की कुल संख्या को गुणा करें+ या सीडी 8 + टेट्रामर + कोशिकाओं मिलान विशेष टी कोशिकाओं (1 बॉक्स) की कुल संख्या की गणना.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

चित्रा 1 प्रतिनिधि pMHCII टेट्रामर समृद्ध और अनुभवहीन चूहों से तिल्ली लिम्फ नोड के नमूने के प्रवाह cytometry भूखंडों को दर्शाया गया है, जबकि 2 चित्रा पहले प्रासंगिक पेप्टाइड + CFA के साथ प्रतिरक्षित चूहों के लिए प्रतिनिधि डेटा को दर्शाया गया है. सीरियल gating के विश्लेषण CD4 + टी सेल आबादी से autofluorescent और अन्य अवांछित घटनाओं को हटा. CD8 + टी सेल की आबादी pMHCII CD4 की टेट्रामर धुंधला हो जाना + टी कोशिकाओं के लिए एक उपयोगी आंतरिक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है. नोट है कि संवर्धन बाध्य भिन्न आमतौर पर अनबाउंड fractions से एक autofluorescent कोशिकाओं के अनुपात काफी अधिक होते हैं, gating अधिक चुनौतीपूर्ण बना.

मिलान एक नमूने में विशिष्ट टी कोशिकाओं की निरपेक्ष संख्या समृद्ध नमूना का समयबद्ध अंश में सभी कोशिकाओं की कुल संख्या बढ़, मनका गिनती विश्लेषण से निर्धारित रूप से गणना कर रहे हैं, determi के रूप टेट्रामर + हैं कि इन कोशिकाओं के अनुपात के साथ,नेड सेल धुंधला हो जाना विश्लेषण (1 बॉक्स) से.

चित्रा 1 में अनुभवहीन माउस के लिए सभी कोशिकाओं के, नमूने का समयबद्ध अंश में एकाग्रता (/ 5589 4411) (200.000) (0.200/0.005) 6,31 = x 10 6 मिलीग्राम /. नमूने में सभी कोशिकाओं की कुल संख्या (6.31 x 10 6 मिलीग्राम /) (0,095) 6,00 = 10 5 x. अंत में, की कुल संख्या का मिलान - विशिष्ट CD4 + टी कोशिकाओं (6.00 x 10 5) (41.5%) (96.6%) (10.2%) (62.3%) (0.64%) = 98.

चित्रा 2 में प्रतिरक्षित माउस के लिए सभी कोशिकाओं के, नमूने का समयबद्ध अंश में एकाग्रता (/ 3590 6410) (200.000) (0.200/0.005) 1,43 = x 10 7 मिलीग्राम /. नमूने में सभी कोशिकाओं की कुल संख्या (1.43 x 7 मिलीग्राम / 10) (0.095) 1.36 = 6 x 10. अंत में, की कुल संख्या का मिलान - विशिष्ट CD4 + टी कोशिकाओं (1.36 10 x 6) (40.9%) (93.9%) (9.54%) (72.0%) (42.7%) 1.53 = 10 4 x </> मजबूत.

मिलान विशेष टी कोशिकाओं की संख्या के रूप में संवर्धन गिरावट की दक्षता आठ बढ़ जाती है, तो टेट्रामर + कोशिकाओं मिलान विशेष टी कोशिकाओं की बहुत उच्च आवृत्तियों वाले नमूनों की अपार अंश में देखा जा सकता है. ऐसे मामलों में, मिलान विशेष टी कोशिकाओं की संख्या अनबाउंड अंश में मौजूद अलग से गणना की जा सकती है और बाध्य अंश में पाया नंबर करने के लिए जोड़ा है. इसलिए, चित्रा 2 में सभी कोशिकाओं के, नमूना की अपार अंश में एकाग्रता (/ 969 9031) (200.000) (0.200/0.005) 7,46 = x 10 7 मिलीग्राम / सभी कोशिकाओं की कुल संख्या 7.46 (x 10 7 मिलीग्राम /) (2.0) = 8 x 10, और 1.49 की कुल संख्या का मिलान - विशिष्ट CD4 + टी कोशिकाओं 1.49 (10 x 8) (62.7%) (96.4%) (44.5%) (54.7%) (0.0409 %) 8,97 = 10 3 x. बाध्य और अबाध भागों में संख्या जोड़ना, 1.53 x 10 4 8.97 + 10 3 x 2.43 = x10 4 कुल मिलान विशिष्ट सीडी 4 + टी कोशिकाओं में पूरे नमूना. दरअसल, अगर मिलान विशिष्ट सेल विस्तार पर्याप्त रूप से मजबूत है, संवर्धन प्रक्रिया को छोड़ दिया जा सकता है.

Fluorochrome प्रतिरक्षी
प्रशांत ब्लू डंप (B220, CD11b, CD11c, F4/80)
प्रशांत ऑरेंज CD8
FITC CD3
पीई pMHC टेट्रामर या प्ररूपी मार्कर
PerCP CD4
APC pMHC टेट्रामर या प्ररूपी मार्कर
700 AlexaFluor CD44

तालिका 1. एंटीबॉडी धुंधला हो रणनीति सुझाव

चित्रा 1 : सामग्री चौड़ाई = "6in" के लिए: src = src = "/ files/ftp_upload/4420/4420fig1.jpg" / "/ files/ftp_upload/4420/4420fig1highres.jpg">
चित्रा 1 फ्लो मिलान विशिष्ट CD4 के cytometric विश्लेषण + टेट्रामर आधारित pMHCII संवर्धन के बाद अनुभवहीन चूहों में टी कोशिकाओं. प्रतिनिधि भूखंडों (A) बाध्य अनबाउंड और (बी) भागों के लिए दिखाए जाते हैं. फाटकों के एक उत्तराधिकार lymphoid स्कैटर का चयन, पक्ष तितर बितर widthlo, डंप, CD3 + घटनाओं के लिए सेट कर रहे हैं. इनमें से CD4 + या CD8 + घटनाओं मिलान विशेष टी कोशिकाओं या पृष्ठभूमि धुंधला हो जाना के विश्लेषण के लिए gated हैं. (सी) बाध्य और अबाध अंश (डी) से अस्थिर कोशिकाओं की aliquots फ्लोरोसेंट गिनती मोती के साथ मिलाया गया और अलग से विश्लेषण किया. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

/ oad/4420/4420fig2.jpg ">
चित्रा मिलान विशिष्ट CD4 + टेट्रामर आधारित pMHCII संवर्धन के बाद पेप्टाइड प्रतिरक्षित चूहों में टी कोशिकाओं के प्रवाह 2. Cytometric विश्लेषण. प्रतिनिधि भूखंडों (A) बाध्य अनबाउंड और (बी) भागों के लिए दिखाए जाते हैं. फाटकों के एक उत्तराधिकार lymphoid स्कैटर का चयन, पक्ष तितर बितर widthlo, डंप, CD3 + घटनाओं के लिए सेट कर रहे हैं. इनमें से CD4 + या CD8 + घटनाओं मिलान विशेष टी कोशिकाओं या पृष्ठभूमि धुंधला हो जाना के विश्लेषण के लिए gated हैं. (सी) बाध्य और अबाध अंश (डी) से अस्थिर कोशिकाओं की aliquots फ्लोरोसेंट गिनती मोती के साथ मिलाया गया और अलग से विश्लेषण किया. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

1 बॉक्स मिलान विशेष टी सेल संख्या की गणना.

मिलान विशिष्ट टी कोशिकाओं की निरपेक्ष संख्या सबसे अच्छा फ्लोरोसेंट गिनती मोती की सहायता के साथ गणना कर रहे हैं. अस्थिर की एक अशेष भाजकप्रत्येक नमूना से कोशिकाओं एक ज्ञात एकाग्रता पर सेट मोतियों की गिनती और फिर प्रवाह cytometry से विश्लेषण का एक निर्धारित मात्रा के साथ मिलाया जाता है. कोशिकाओं के नमूने में एकाग्रता फ्लोरोसेंट गिनती मोती के ज्ञात एकाग्रता के साथ अपनी आवृत्ति की तुलना से inferred किया जा सकता है.

1 समीकरण
नमूने में कोशिकाओं की कुल संख्या तो कुल नमूना मात्रा के साथ सेल एकाग्रता गुणा करके गणना की है.

2 समीकरण
नमूने में मिलान विशेष टी कोशिकाओं की कुल संख्या सिर्फ टेट्रामर पॉजिटिव कोशिकाओं है कि प्रतिशत से गुणा नमूना में सभी कोशिकाओं की कुल संख्या है.

3 समीकरण

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

pMHC टेट्रामर आधारित सेल संवर्धन विधि इस प्रोटोकॉल द्वारा प्रस्तुत अंतर्जात टी सेल repertoires से मिलान विशेष टी कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है. मिलान विशेष टी कोशिकाओं के उनके TCRs की क्षमता को बाँध आत्मीय pMHC ligands के आधार पर सीधे pMHC tetramers का उपयोग पता लगाने में सक्षम बनाता है. संवर्धन है कि इस तरह के प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं की अत्यंत दुर्लभ आबादी उनके आनुवंशिक मेकअप या अग्रदूत आवृत्ति के किसी भी हेरफेर के बिना टी कोशिकाओं की अंतर्जात repertoires से पता लगाया जा सकता है संवेदनशीलता के स्तर प्रदान करता है. नतीजतन, इस तकनीक के अन्वेषक सीधे उनके अनुभवहीन स्तर से vivo प्रयोगात्मक प्रणालियों में से प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के सभी चरणों के माध्यम से अंतर्जात प्रतिजन विशेष टी सेल आबादी पर नज़र रखने की अनुमति देता है.

इस प्रोटोकॉल pMHC वर्ग (pMHCII) द्वितीय tetramers के उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया मिलान विशिष्ट CD4 + माध्यमिक lymphoid अंग से टी कोशिकाओं को समृद्धचूहों की है. हालांकि, तकनीक भी है pMHC वर्ग मैं (pMHCI) tetramers और CD8 + टी 9 कोशिकाओं के लिए लागू है. CD4 विपरीत, CD8 coreceptor TCR MHC बातचीत स्थिर करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और इस pMHCI टेट्रामर 10 धुंधला के लिए व्यावहारिक निहितार्थ हो सकते हैं. सबसे विशेष रूप से, CD8 एंटीबॉडी के उपयोग क्लोनों कि CD8 टेट्रामर बाध्यकारी नहीं ख़राब करने के लिए प्रतिबंधित किया जाना चाहिए, और वे टेट्रामर धुंधला हो जाना के बाद कोशिकाओं को जोड़ा जाना चाहिए. दरअसल, कुछ pMHCI tetramers उत्परिवर्तित MHCI CD8 बाध्यकारी साइटों के साथ किया गया है इंजीनियर CD8 + टी कोशिकाओं को nonspecific बाध्यकारी 11,12 को कम करने.

Tetramer एकाग्रता, ऊष्मायन समय और ऊष्मायन तापमान काफी टेट्रामर धुंधला हो की क्षमता को प्रभावित कर सकते हैं, और शर्तों के उच्च टेट्रामर संकेत, कम पृष्ठभूमि संकेत, कम टेट्रामर internalization, और सेल फिजियोलॉजी न्यूनतम परिवर्तन का सबसे अच्छा संयोजन को प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. आदर्श रूप में, इन शर्तों ख चाहिएई empirically प्रत्येक अद्वितीय अभिकर्मक के लिए निर्धारित है. हमारे हाथ में, तथापि, 10 एनएम के अंतिम एकाग्रता और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के एक ऊष्मायन सबसे pMHCI या pMHCII tetramers के लिए अच्छा सामान्य शर्तों प्रदान करता है. सामान्य में, pMHCI tetramers pMHCII tetramers की तुलना में अधिक आसानी से दाग लगता है, और धुंधला हो जाना अक्सर के रूप में छोटा रूप में 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रदर्शन किया जा सकता है.

इस प्रक्रिया के पैमाने पर लगभग एक नमूना में सभी माध्यमिक lymphoid एक माउस के अंगों का विश्लेषण करने के लिए अनुकूल है. इसलिए, प्रत्येक नमूना पूरे घूम एक माउस के परिधीय टी सेल प्रदर्शनों की सूची का एक काफी व्यापक विश्लेषण का प्रतिनिधित्व करता है. मिलान विशेष टी कोशिकाओं को भी थाइमस 13,14 सहित अन्य प्रासंगिक ऊतकों से समृद्ध किया जा सकता है. जब 4-5 सप्ताह पुराने चूहों से thymii विश्लेषण कर रहे हैं, मिलान विशिष्ट एकल सकारात्मक thymocytes परिधीय अनुभवहीन टी कोशिकाओं के उन लोगों के लिए इसी तरह की संख्या का पता लगाया जा सकता है. मिलान विशिष्ट thymocytes डबल पॉजिटिवतथापि, बहुत TCR अभिव्यक्ति की अपने स्तर कम करने के कारण का पता लगाने के लिए मुश्किल हैं.

इस प्रोटोकॉल का भी मिलान विशिष्ट मानव CD4 रक्त या अन्य 15-17 ऊतकों में या CD8 + टी कोशिकाओं का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. एपीटोप विशेष टी कोशिकाओं की आवृत्ति लगभग चूहों और मनुष्य के 17 के बीच में ही है तो, 50 के विश्लेषण के 100 मिलीलीटर खून जमा प्लीहा और माउस की एक 18 लिम्फ नोड्स के रूप में मिलान विशिष्ट टी कोशिकाओं की तुलना संख्या उपज होता है.

टेट्रामर आधारित संवर्धन के बाद कोशिकाओं का प्रवाह cytometric विश्लेषण में एक प्रमुख चुनौती भेद पृष्ठभूमि से सच सेल घटनाओं है. यह मोटे तौर पर तथ्य यह है है कि कई autofluorescent कोशिकाओं को भी इस प्रक्रिया के दौरान गैर विशेष रूप से समृद्ध कर रहे हैं के कारण है. ध्यान से gated बाहर यदि नहीं, तो इन कोशिकाओं autofluorescent झूठी टेट्रामर पॉजिटिव कोशिकाओं के रूप में दिखाई देते हैं और दुर्लभ अनुभवहीन टी सेल पी के मामले में विशेष रूप से विश्लेषण की सटीकता फेंक कर सकते हैंopulations. हमारी प्रोटोकॉल एक दो कदम gating रणनीति है जो CD3 + घटनाओं 1 gated डंप + वंश घटनाओं, और फिर CD4 से दूर रोजगार + घटनाओं gated CD8 + घटनाओं से दूर कर रहे हैं. इस प्रक्रिया में, जो किसी भी FACS साजिश के विकर्ण केंद्र के साथ झूठ हैं autofluorescent कोशिकाओं, दो कदम चलने का विश्लेषण के gated बाहर हैं. autofluorescent घटनाओं के प्रभावी हटाने कई फ्लोरोसेंट रंगों की कीमत पर आता है, तो हम अत्यधिक प्रवाह कम से कम 6 फ्लोरोसेंट मापदंडों का सक्षम cytometers के उपयोग की सलाह देते हैं.

हाल pMHC tetramers पीई और APC इन fluorochromes की चमक के कारण संयुग्मित हैं, और विरोधी पीई और विरोधी APC चुंबकीय microbeads आसानी से कर रहे हैं उनके साथ संवर्धन सक्षम करने के लिए उपलब्ध है. हालांकि, अन्य fluorochromes भी इतने लंबे समय से इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में इसी चुंबकीय microbeads उपलब्ध हैं. दरअसल, विभिन्न fluorochrome लेबल के साथ कई tetramers इसी mic एंटीबॉडी संयुग्मित के साथ एक साथ इस्तेमाल किया जा सकता हैएक साथ एक ही नमूना से एकाधिक मिलान विशेष टी सेल आबादी को समृद्ध robeads. हम एक बहुत ही बुनियादी सेटअप एंटीबॉडी fluorochrome कि पीई और APC लेबल tetramers (1 टेबल) के उपयोग के लिए अनुकूलित है रेखांकित किया है, लेकिन कई अन्य प्रभावी संयोजन प्ररूपी मार्करों के अध्ययन में लचीलापन बढ़ाने के लिए संभव है.

CD8 + टी सेल आबादी एक आंतरिक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, के बाद से वे pMHCII ligands मिलान विशिष्ट CD8 + टी सेल संवर्धन के लिए (और इसके विपरीत) करने के लिए बाध्य होना चाहिए. एक नमूने में tetramer + CD8 + कोशिकाओं की आवृत्ति पृष्ठभूमि टेट्रामर धुंधला हो जाना के स्तर का एक अच्छा मूल्यांकन प्रदान करता है, हालांकि सदाशयी टेट्रामर पॉजिटिव CD8 + टी पार प्रतिबंधित pMHCII epitopes विशिष्टता के साथ कोशिकाओं को बहुत छोटे 19 आवृत्तियों पर मौजूद हो सकता है. कभी कभी बहुत मजबूत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के दौरान, इन कोशिकाओं को विस्तारित आवृत्तियों पर मौजूद हो सकता है. अगर वांछित, TCR ट्रांसजेनिक टी कोशिकाओं बुद्धिh या प्रासंगिक मिलान विशिष्टता के बिना अतिरिक्त सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. ध्यान दें कि अज्ञात कारणों के लिए, कुछ TCR ट्रांसजेनिक कोशिकाओं और हाइब्रिडोमास अच्छी तरह से उनके प्रासंगिक tetramers साथ नहीं दाग नहीं है.

हमारी प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट गिनती मोती का उपयोग करने के लिए सेल नंबर की गणना में सहायता शामिल है. जबकि कोशिका की गिनती भी स्वयं एक hemacytometer साथ कर सकते हैं प्राप्त किया जा, हम पाते हैं कि बहुत अधिक प्रयोगात्मक परिशुद्धता में मोती परिणाम की गिनती का उपयोग करते हैं, खासकर जब कई जांचकर्ताओं शामिल कर रहे हैं. छोटे कोशिकाओं कि इस प्रोटोकॉल में नियंत्रित किया जाता है की संख्या और संस्करणों के कारण, प्रयोगात्मक त्रुटि के न्यूनतम एक उच्च प्राथमिकता होनी चाहिए.

Tetramer धुंधला हो सेल निर्धारण और permeabilization के साथ संगत है, और कई अध्ययनों सफलतापूर्वक टेट्रामर आधारित कोशिका संवर्धन 20,21 के बाद intracellular और कोशिकाओं में प्रतिलेखन कारक अभिव्यक्ति cytokine विश्लेषण.हालांकि, अतिरिक्त कदम शामिल नमूनों में अतिरिक्त सेल नुकसान के लिए योगदान करते हैं.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

लेखकों के लिए इस प्रोटोकॉल के विकास में मदद के लिए आंद्रे हान और लॉरेंस येन तकनीकी सहायता के लिए और जेनकींस प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद करना चाहते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PE or APC conjugated pMHC tetramer (or multimer) Made by investigator, obtained from the NIH tetramer core, or purchased from commercial sources
Anti-PE conjugated magnetic microbeads Miltenyi 130-048-801
Anti-APC conjugated magnetic microbeads Miltenyi 130-090-855
LS magnetic columns Miltenyi 130-042-401
MidiMACS or QuadroMACS magnet Miltenyi 130-042-302 or 130-090-976
Cell counting beads Life Technologies PCB-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. Laboratory analysis of T-cell immunity. Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).
  2. Kearney, E. R., Pape, K. A., Loh, D. Y., Jenkins, M. K. Visualization of peptide-specific T cell immunity and peripheral tolerance induction in vivo. Immunity. 1, 327-339 (1994).
  3. Moon, J. J. Tracking epitope-specific T cells. Nat Protoc. 4, 565-581 (2009).
  4. Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance. Science. 312, 114-116 (2006).
  5. Marzo, A. L. Initial T cell frequency dictates memory CD8+ T cell lineage commitment. Nat Immunol. 6, 793-799 (2005).
  6. Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nature reviews. Immunology. 11, 551-558 (2011).
  7. Moon, J. J. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27, 203-213 (2007).
  8. Seah, S. G. The linear range for accurately quantifying antigen-specific T-cell frequencies by tetramer staining during natural immune responses. European Journal of Immunology. 41, 1499-1500 (2011).
  9. Obar, J. J., Khanna, K. M., Lefrancois, L. Endogenous naive CD8+ T cell precursor frequency regulates primary and memory responses to infection. Immunity. 28, 859-869 (2008).
  10. Daniels, M. A., Jameson, S. C. Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers. J Exp Med. 191, 335-346 (2000).
  11. Pittet, M. J. Alpha 3 domain mutants of peptide/MHC class I multimers allow the selective isolation of high avidity tumor-reactive CD8 T cells. Journal of Immunology. 171, 1844-1849 (2003).
  12. Choi, E. M. High avidity antigen-specific CTL identified by CD8-independent tetramer staining. Journal of Immunology. 171, 5116-5123 (2003).
  13. Chu, H. H. Positive selection optimizes the number and function of MHCII-restricted CD4+ T cell clones in the naive polyclonal repertoire. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11241-11245 (2009).
  14. Chu, H. H., Moon, J. J., Kruse, A. C., Pepper, M., Jenkins, M. K. Negative Selection and Peptide Chemistry Determine the Size of Naive Foreign Peptide-MHC Class II-Specific CD4+ T Cell Populations. J Immunol. 185, 4705-4713 (2010).
  15. Legoux, F. Impact of TCR reactivity and HLA phenotype on naive CD8 T cell frequency in humans. J Immunol. 184, 6731-6738 (2010).
  16. Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K., Hasan, M., Albert, M. L. Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies. Blood. 115, 3718-3725 (2010).
  17. Kwok, W. W. Frequency of Epitope-Specific Naive CD4+ T Cells Correlates with Immunodominance in the Human Memory Repertoire. Journal of Immunology. 188, 2537-2544 (2012).
  18. Jenkins, M. K., Chu, H. H., McLachlan, J. B., Moon, J. J. On the composition of the preimmune repertoire of T cells specific for Peptide-major histocompatibility complex ligands. Annu Rev Immunol. 28, 275-294 (2010).
  19. Matechak, E. O., Killeen, N., Hedrick, S. M., Fowlkes, B. J. MHC class II-specific T cells can develop in the CD8 lineage when CD4 is absent. Immunity. 4, 337-347 (1996).
  20. Burchill, M. A. Linked T cell receptor and cytokine signaling govern the development of the regulatory T cell repertoire. Immunity. 28, 112-121 (2008).
  21. Pepper, M. Different routes of bacterial infection induce long-lived TH1 memory cells and short-lived TH17 cells. Nature Immunology. 11, 83-89 (2010).

Tags

इम्यूनोलॉजी 68 अंक सेलुलर जीवविज्ञान आणविक जीवविज्ञान टी सेल टी सेल रिसेप्टर tetramer प्रवाह cytometry प्रतिजन विशिष्ट इम्यूनोलॉजी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया चुंबकीय संवर्धन,
मिलान विशेष टी कोशिकाओं की MHC tetramer आधारित संवर्धन: पेप्टाइड
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Legoux, F. P., Moon, J. J.… More

Legoux, F. P., Moon, J. J. Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells. J. Vis. Exp. (68), e4420, doi:10.3791/4420 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter