Summary
Epitopa spesifik T-hücrelerinin alçak frekans popülasyonları izole etmek ve akış sitometrisi ile analiz etmek için bunları MHC tetramerleri ve manyetik mikro-küreler: Bu protokol peptit kullanımı açıklanmıştır. Bu yöntem ilgi endojen T hücre popülasyonlarının doğrudan çalışma sağlar
Abstract
Vivo deneysel modellerde olan adaptif bağışıklık inceleyen araştırmacılar için temel bir gereklilik kendi T hücre antijen reseptör (TCR) özgüllük esas T hücreleri belirlemek için bir yetenek. Pek çok dolaylı yöntemlerle T-hücrelerinin bir yığın nüfus belirli bir antijen ile epitopu özgü T hücreleri proliferasyonu, sitokin üretimi, ya da aktivasyonu 1 ifadesi olarak işlevsel bir yanıt ölçümü ile tespit edilir ile in vitro uyarılmış olduğu kullanılabilir. Bununla birlikte, bu yöntem sadece birçok olası fonksiyon gösteren bir epitopuna özgü T hücreleri belirlemek, ve saf haberci frekanslarda epitopa spesifik T hücreleri saptamak için yeterli değildir. Popüler bir alternatif, TCR transjenik adoptif aktarım modeli olan bir TCR transjenik fare monoklonal T hücreleri EASI olabilir epitopa spesifik T-hücrelerinin geniş bir haberci nüfus oluşturmak için histocompatible taşıyıcılara yerleştirildiği tohumlanmıştırly bir congenic işaretleyici antikor 2,3 kullanımı ile izlenir. Güçlü olmakla birlikte, bu yöntem, 4,5, tek bir epitopu için spesifikliğe sahip olan T hücrelerinin unphysiological frekansı ile ilişkili deneysel eser uğrar. Ayrıca, bu sistem, bir poliklonal popülasyon içindeki epitopa spesifik T hücre klonlarının fonksiyonel heterojen araştırmak için kullanılamaz.
MHC (pMHC) kompleksleri: kazanılmış bağışıklık incelemek için ideal bir şekilde sadece kendi akraba peptid bağlayıcı ile TCR özgüllük ayıran bir yöntem kullanılarak, endojen T-hücresi epitopu repertuarından-spesifik T hücrelerinin doğrudan saptanması içermelidir. PMHC tetramerleri ve akış sitometrisi kullanımı bu 6 gerçekleştirir, ancak şu antijen kaynaklı klonal büyüme bulunamadı epitopa spesifik T-hücrelerinin yüksek frekans popülasyonlarının tespiti ile sınırlıdır. Bu protokol, bir pMHC tetramerleri kullanımı ile koordine yöntem ve magnezyum tanımlamaktik hücre zenginleştirme teknoloji fare lenf dokuları 3,7 son derece alçak frekans epitopa spesifik T hücrelerin saptanması sağlamaktır. Bu teknik sayesinde, bir kapsamlı immün yanıtın tüm aşamalarında farelerde endojen T hücrelerinin tamamı epitop özel popülasyonlarda izleyebilirsiniz.
Protocol
1. Lenfoid Doku gelen Hücre İzolasyonu
- Bir küçük kare ihtiva eden bir 60 mm kültür çanağı, buz cEHAA (EHAA +% 10 FBS, pen / strep, gentamisin, 2 mM L-glutamin, 55 mM 2-merkaptoetanol) ya da diğer eşdeğer T-hücresi orta 1 ml ekleyin buz üzerinde 100 mikron naylon örgü ve yer.
- Fare Euthanize.
- Dalak ve mümkün olduğunca çok sayıda kolayca erişilebilir lenf düğümleri kaldırın. Bunlar en az inguinal, aksiller, brakial, servikal ve mezenterik lenf düğümleri içermelidir. Kültür çanak naylon örgü üstüne yerleştirin.
- Yavaşça püre lenfositler kurtarmak için naylon örgü üzerinde, kapalı bir 1,5 ml mikrofuge'de tüpünün üst kısmı düz lenfoid doku kullanma. Bir süspansiyon içine hücre çalışması için cEHAA ve pipet aşağı ve yukarı başka bir 1 ml ekleyin. 15 ml polipropilen santrifüj tüpünün üst üzerine yerleştirilen naylon örgü başka bir parça ile hücreleri aktarın. Buz cEHAA, po başka bir 1 ml çanak ve örgü durulayınaynı tüp içine miktarlar oling. 4 ml arasında bir nihai hücre süspansiyonu hacmi elde etmek için tekrarlayın.
- 15 ml'lik bir son hacim için (PBS +% 2 FBS,% 0.05 azid) sıralayıcı soğuk tampon ilave edin ve 4, 300 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj tüpü ° C.
- Dikkatli bir şekilde herhangi bir sıvı damlacıkları tüpün iki tarafında kalan emin olarak süpernatant aspire. Yaklaşık olarak iki kat daha pelet kendisi ile eşit bir son hacim Fc blok (sıralayıcı tamponu + 2.4G2 antikor) olarak hücre pelet yeniden süspanse edin. Örneğin, saf bir fare dalak ve lenf düğümleri genellikle yaklaşık 100 ul hücre peleti üretir. Bu durumda, 200 ul hacim getirmek için Fc blok 100 ul ilave edin. Hücre topaklanma büyük ölçüde meydana gelmiş ise, dikkatli bir pipet ucu ile bu noktada cep tutam çıkarın.
2. Tetramer Boyama
- 10 nM (ya da deneysel olarak optimum konsantrasyon) bir son konsantrasyon için PE-veya APC-etiketli pMHC tetramer ekleyin.
- Mix ve inkübasyonOda sıcaklığında (ya da deneysel olarak optimum süre ve sıcaklığı) 1 saat boyunca te.
- 15 ml'lik bir hacme kadar soğuk tampon sıralayıcı ekleyin ve 300 x g'de, 4 ° C'de 5 dakika süreyle santrifüj tüpü Buz üzerinde veya ° C andan itibaren 4 numune tutun.
- Dikkatli bir şekilde herhangi bir sıvı damlacıkları tüpün iki tarafında kalan emin olarak süpernatant aspire. 200 ul son hacim için sıralayıcı tampon içinde hücre pelet yeniden süspanse edin. Çift tetramer zenginleştirme için, 150 ul nihai hacim için tekrar süspansiyon.
3. Manyetik Zenginleştirme
- Miltenyi anti-PE ya da anti-APC mikroboncuk 50 ul ekle. Çift tetramer zenginleştirme için, her ikisi de 50 ul ilave edin.
- 4'te karıştırın ve 20 dakika için inkübe ° C
- 15 ml'lik bir hacme kadar soğuk tampon sıralayıcı ekleyin ve 300 x g'de, 4 ° C'de 5 dakika süreyle santrifüj tüpü
- Beklerken, bir MidiMACS veya QuadroMACS mıknatıs bir Miltenyi LS manyetik sütun kurdu. Bir açık bir 15 ml polipropilen santrifüj tüpüne yerleştirinsütununun altında doğrudan rafa.
- O 15 ml tüp içine akabilmesi için, sütunun tepesine sıralayıcı tampon 3 ml ilave edilir.
- Sütunun üstüne bir 100 mikron naylon örgü kare yerleştirin.
- Hücreler iplik bitirdiğinizde, dikkatlice süpernatant aspirat ve sıralayıcı tampon 3 ml pelet tekrar süspansiyon haline getirin.
- Sütunun üst üzerine naylon ağ yoluyla hücre süspansiyonu aktarın.
- Hücre süspansiyonu tamamen sütun içine boşalttıktan sonra, sıralayıcı tampon başka bir 3 ml'lik tüp orijinal durulama ve sütun içine naylon ağ üzerinden aktarmak tampon, süreç içinde ağ durulama. Naylon örgü atın.
- Tampon tamamen sütun içine boşalttıktan sonra, kolona sıralayıcı tampon başka bir 3 ml eklenir.
- 3 x 3 ml yıkama toplam 10 adımı yineleyin.
- Yeni bir 15 ml polipropilen santrifüj tüpü üzerinde mıknatıs ve yerden sütun çıkarın.
- T sıralayıcı tampon 5 ml ekleyino sütun.
- Hemen sütunun üst içine piston takın ve bir sürekli hareket halinde, tüpe kolonu tampon zorlayarak, piston tüm yol aşağı doğru itin.
- 300 x g'de 5 dakika boyunca yıkandı bağlı fraksiyonu ve akan ilişkisiz bir fraksiyonu, 4 ° C'de santrifüje içeren tüpler
- Ayrıca herhangi bir sıvı damlacıkları tüpün iki tarafında kalan emin olarak bağlı fraksiyondan süpernatan dikkatlice aspire. Tam olarak 95 ul son hacim için sıralayıcı tampon içinde hücre pelet yeniden süspanse edin. Aspire ve 2 ml arasında bir nihai hacim için bağlanmamış kısmı tekrar süspansiyon.
4. Akış Sitometri
- Her bir fraksiyonu için, 5 ul kaldırmak ve bir 5 ml FACS tüp içinde sayım boncuk 200 ul (sıralayıcı tampon içinde 200,000 / ml 'lik bir konsantrasyon ile ayarlanmış olarak) eklenir. 4 at kenara ° C analizi için geç. Zamandan tasarruf etmek için, boncuklar deney başlamadan önce etiketli tüpler önceden aliquoted edilebilir.
- Ben hazırlayınAntikorların aster karışımı hücreleri yüzey işaretleyicileri (Tablo 1) leke. Zamandan tasarruf etmek için, bu deney başlamadan önce yapılabilir.
- Bağlı fraksiyonu için, tüp içinde hücrelerin ~ 90 ul doğrudan antikor kokteylinin bir doz ekleyin. Bağsız fraksiyonunun analiz istenirse, bir 5 ml FACS tüp için hücre 90 ul aktarımı ve antikor kokteyli bir doz ekleyin.
- Akış sitometresi için tek renk telafisi denetimlerin paneli yukarı ayarlayın. Kullanılmak üzere her florokrom için, karşılık gelen florokrom ile konjuge anti-CD4 antikoru ile bir 1 ul FACS 5 ml tüp içinde kalan bağsız fraksiyonu hücreleri 50 ul ilave edilir. Bunun yanı sıra bir boyanmamış kontrol ayarlamayı unutmayın.
- Girdap ve 4, 30 dakika için tüm örnekler inkübe ° C
- 300 xg 5 dak, 4 ° C 'için her bir tüp ve santrifüj ile sıralayıcı tampon 5 mL
- Bağlı fraksiyonu için, tampon dikkatlice sıralayıcı 200 ul süpernatan aspire hücreleri ve tekrar süspansiyonfer. 1.2 ml FACS mikrotüp içine hücreleri aktarın. Aynı mikrotüp içine sıralayıcı tampon ve havuz başka bir 200 ul ile tüp durulayın. Hücre kümeleri açık ise, bir 50 um filtre aracılığıyla hücre geçmektedir.
- Ilişkisiz fraksiyonu ve tazminat kontrolleri, süzün veya supernatant ve tekrar süspansiyon 2 ml sıralayıcı tampon aspire için.
- Tek renk telafisi kontrollerini kullanarak akış sitometresi ayarlayın. Kaydedilecek ek bir parametre olarak yan dağılım genişliği (SSC-W) seçin.
- Şekiller 1 ve 2 de gösterildiği gibi, + ya da CD8 + T hücreleri CD4 belirlemek için ardışık içerme bir geçitlerinin dizisi kullanılarak boyanan numuneler analiz edin. Bağlı kesirler için, yukarı 2.000.000 toplam etkinlik azami mümkün olduğunca çok sayıda hücreleri toplamak. Ilişkisiz kesirler için, 1.000.000 toplam etkinlik toplamak. Alma hızı saniyede etkinliklerde veya 3000 altında tutun.
- Aynı makine ayarları kullanarak, sayma boncuk örnekleri analiz. 10,000 toplam etkinlik toplayın. </ Li>
- FCS dosyaları gibi tüm verileri kaydedin.
5. Veri Analizi
- FlowJo yazılımı kullanarak sayma boncuk örnekleri için FCS veri dosyalarını analiz edin. Plot ileri FITC ile saçılım ve (Şekil 1 ve 2) sayma boncuklar Kottbusser bir kapı ayarlayın. Her bir numune içinde tespit edilen boncuk sayma sayısını belirler. Toplanan hücre olayların sayısını belirlemek için toplanan olayların toplam sayıdan çıkart.
- Kutu 1'de denklemler kullanılarak her bir örnek tüm hücrelerinin toplam sayısını hesaplayın.
- Lekeli ilişkili ve ilişkisiz fraksiyonu örnekleri için FCS veri dosyalarını analiz edin. Lenfoid +, yan genişlik dağılım-lo, dökümü-, CD3 +, CD4 + ya da CD8 +, tetramer Şekiller 1 ve 2 de gösterildiği gibi, her bir numune içinde + T hücreleridir. Belirlemek için ardışık içerme kapıları bir dizi ayarlama
- CD4 tanımlamak için kullanılan içerme kapılarının her biri sıklığı + tetramer göre örnek bir hücre toplam sayısı çarpma+ Ya da CD8 + tetramer + hücreleri epitopu özgü T hücreleri (Kutu 1) toplam sayısını hesaplamak için kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 2'de daha önceden ilgili peptid + CFA ile bağışık hale getirilen farelerin için temsilci veriler göstermektedir iken Şekil 1, saf farelerden alınan pMHCII tetramer zenginleştirilmiş dalak ve lenf düğümü numuneleri için temsili akış sitometrisi parselleri göstermektedir. Seri yolluk CD4 analizi + T hücre popülasyonlarının gelen autofluorescent ve diğer istenmeyen olaylar kaldırır. CD8 + T hücre populasyonunun CD4 pMHCII tetramer boyama + T hücreleri için kullanışlı bir iç negatif kontrol olarak hizmet vermektedir. Zenginleştirme bağlı kesirler genellikle yolluk daha zorlu hale, ilişkisiz fraksiyonları hariç autofluorescent hücrelerin daha büyük bir bölümünü içeren unutmayın.
Bir örnek olarak epitopu-spesifik T hücrelerinin mutlak sayılarının belirleyiciler olarak, tetramer + vardır, bu hücrelerin oranı ile, boncuk sayısı analizi ile belirlendiği gibi, zenginleştirilmiş örnek bağlı fraksiyonu içinde tüm hücrelerin toplam sayısı çarpılarak hesaplanırHücre boyama analizi (Kutu 1) Ned.
Şekil 1 'de saf fare için, numunenin bağlı fraksiyonu içinde tüm hücrelerin konsantrasyonu (4411/5589) (200.000) (0.200/0.005) = 6,31 x 10 6 / ml idi. Örnekteki tüm hücrelerin toplam sayısı (6.31 x 10 6 / ml) (0.095) = 6.00 x 10 5. Son olarak, epitop-spesifik toplam CD4 + T hücre sayısı olduğu (6.00 x 10 5) (% 41.5) (% 96.6) (% 10.2) (% 62.3) (0.64%) = 98.
Şekil 2 'de immünize fare için, numunenin bağlı fraksiyonu içinde tüm hücrelerin konsantrasyonu (6410/3590) (200.000) (0.200/0.005) = 1,43 x 10 7 / ml idi. Örnekteki tüm hücrelerin toplam sayısı (1.43 x 10 7 / mL) (0.095) = 1.36 x 10 6. Nihayet, epitop-spesifik CD4 sayısı + T hücreleri (1.36 x 10 6) (% 40.9) (% 93.9) (9.54%) (72.0%) (42.7%) = 1.53 x 10 4 <> / Strong.
Epitopa spesifik T hücrelerinin sayısını gibi zenginleştirme azalır 8 verim artar, böylece tetramer + hücrelerinin epitopa spesifik T-hücrelerinin çok yüksek frekanslar içeren örneklerin ilişkisiz bir fraksiyonu olarak görülebilir. Bu gibi durumlarda, epitopa spesifik T hücrelerinin sayısını ilişkisiz fraksiyonunda mevcut ayrı ayrı hesaplanır ve bağlı fraksiyonu içinde bulunan numarası için ilave edilebilir. Bu nedenle, Şekil 2 'de, örnek ilişkisiz fraksiyonu içinde tüm hücrelerin konsantrasyonu (9031/969) (200.000) (0.200/0.005) = 7,46 x 10 7 / ml, bütün hücrelerin toplam sayısı (7,46 x 10 7 / ml) (2.0) = 1.49 x 10 8 ve epitopu özgü CD4 toplam sayısı + T hücreleri (1.49 x 10 8) (% 62.7) (% 96.4) (% 44.5) (% 54.7) (0,0409 %) = 8.97 x 10 3. İlişkili ve ilişkisiz fraksiyonları numaraları ekleme, 1.53 x 10 4 + 8.97 x 10 3 = 2.43 vardır x10 4 toplam epitop-spesifik CD4 + tüm örneklem T hücreleri. Epitopa spesifik hücre genişleme yeterince güçlü olması durumunda Nitekim, zenginleştirme işlemi atlanabilir.
| Florokrom | Antikor |
| Pacific Blue | dökümü (B220, CD11b, CD11c F4/80) |
| Pasifik Turuncu | CD8 |
| FITC | CD3 |
| PE | pMHC tetramer veya fenotipik belirteç |
| PerCP | CD4 |
| APC | pMHC tetramer veya fenotipik belirteç |
| AlexaFluor 700 | CD44 |
Tablo 1. Antikor boyama stratejisi Önerilen
: İçerik-width = "6in" fo: src = src = "/ files/ftp_upload/4420/4420fig1.jpg" / "/ files/ftp_upload/4420/4420fig1highres.jpg">
Şekil 1. Epitopu özgü CD4 akış sitometrik analizi + pMHCII tetramer tabanlı bir zenginleştirme ardından saf farelerde T hücreleridir. Örnek parselleri bağlı (A) ve ilişkisiz (B) fraksiyon için gösterilmiştir. Kapıları ardına +, yan-saçılım-widthlo damperli, CD3 + olaylar lenfoid-dağılım seçmek için ayarlanır. Bunlar arasında, CD4 + ya da CD8 + olaylar epitopu özgü T hücreleri veya arka plan boyama analizi için kapı vardır. Bağlı (C) ve ilişkisiz (D) fraksiyondan boyanmamış Hücrelerin alikotlan floresan sayma boncuklar ile karıştırılır ve ayrı ayrı analiz. Edildi büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
oad/4420/4420fig2.jpg "/>
Epitopu özgü CD4 + pMHCII tetramer tabanlı bir zenginleştirme aşağıdaki peptit aşılanmış farelerde T hücrelerinin Şekil 2. Akım sitometrik analizi. Örnek parselleri bağlı (A) ve ilişkisiz (B) fraksiyon için gösterilmiştir. Kapıları ardına +, yan-saçılım-widthlo damperli, CD3 + olaylar lenfoid-dağılım seçmek için ayarlanır. Bunlar arasında, CD4 + ya da CD8 + olaylar epitopu özgü T hücreleri veya arka plan boyama analizi için kapı vardır. Bağlı (C) ve ilişkisiz (D) fraksiyondan boyanmamış Hücrelerin alikotlan floresan sayma boncuklar ile karıştırılır ve ayrı ayrı analiz. Edildi büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Kutu 1. Epitop-spesifik T hücre sayıları hesaplanması
Epitopa spesifik T hücrelerinin mutlak sayılarının en iyi şekilde floresan sayma boncuklar yardımıyla hesaplanır. Boyanmamış bir kısımHer bir numune bir hücre akış sitometrisi ile analiz bilinen bir konsantrasyonda ayarlanmış boncuk sayma ve daha sonra belirli bir hacmi ile karıştırılır. Örnek olarak hücrelerin konsantrasyonu floresan sayma boncuk bilinen konsantrasyon ile bir frekans karşılaştırma sonucuna varılabilir.
Örnek olarak hücrelerin toplam sayısı daha sonra, toplam numune hacmi ile hücre konsantrasyonu çarpılması ile hesaplanır.
Örnek olarak epitopu-spesifik T hücrelerin sayısı sadece tetramer pozitif olan hücrelerin yüzdesi ile çarpılan örnek olarak bütün hücrelerin toplam sayısıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol tarafından sunulan pMHC tetramer tabanlı cep zenginleştirme yöntemi endojen T hücre çizgilerinden epitop-spesifik T hücreleri incelemek için güçlü bir araçtır. PMHC tetramerleri kullanımı, doğrudan doğruya aynı kökten gelen pMHC ligandlar bağlamak için kendi TCRS yeteneğine dayalı epitopa spesifik T hücrelerin saptanması sağlar. Zenginleştirme antijen-spesifik T hücrelerinin çok nadir topluluğunun, genetik ya da haberci frekans herhangi bir düzenlemesi olmadan T hücrelerinin endojen çizgilerinden tespit edilebilir ki bu tür bir hassasiyet düzeyi sağlar. Sonuç olarak, bu yöntem araştırmacının, doğrudan bağışıklık tepkisinin her aşamasında yoluyla saf düzeylerini in vivo deneysel sistem içinde dan endojen antijen-spesifik T hücre popülasyonu izlemesine olanak verir.
Bu protokol epitop-spesifik CD4 + ikincil lenfoid organ T hücreleri zenginleştirmek pMHC sınıf II (pMHCII) tetramers kullanımı için optimize edilmiştirfarelerin s. Bununla beraber, bu teknik, aynı zamanda pMHC sınıf I (pMHCI) tetramerleri ve CD8 + T hücreleri 9 için de geçerlidir. CD4 aksine, CD8 coreceptor TCR-MHC etkileşimleri stabilize önemli bir rol oynar ve bu pMHCI tetramer boyama için 10 pratik etkileri olabilir. En önemlisi, CD8 antikor kullanımı CD8-tetramer bağlayıcı zarar vermemesi klonları ile sınırlı olması gerektiğini ve tetramer boyama sonrasında hücreler ilave edilmelidir. Gerçekten de, bazı pMHCI tetramers CD8 + T hücrelerinin nonspesifik bağlayıcı 11,12 hafifletmek için mutasyona MHCI-CD8 bağlayıcı sitelerle tasarlanmış edilmiştir.
Tetramer konsantrasyonu, inkübasyon süresi ve inkübasyon sıcaklığı büyük ölçüde tetramer boyama verimini etkileyebilir ve koşulları yüksek tetramer sinyal, düşük arka sinyal, düşük tetramer içselleştirilmesi ve hücre fizyolojisi minimal değişiklikler en iyi kombinasyonunu elde etmek için optimize edilmelidir. İdeal olarak, bu koşullar b gerekirE ampirik benzersiz her reaktifin belirlenir. Bizim elimizde Bununla birlikte, 10 nM bir nihai konsantrasyon ve oda sıcaklığında 1 saat arasında değişen bir inkübasyon en pMHCI veya pMHCII tetramerleri için iyi bir genel koşullar sağlar. Genel olarak, pMHCI tetramerleri pMHCII tetramerleri göre daha kolay bir şekilde leke görünmektedir ve boyanması genellikle yalnızca 30 dk için 4 ° C sıcaklıkta gerçekleştirilir.
Bu prosedürün ölçekli tek bir örnek bir fare neredeyse tüm ikincil lenfoid organlara analizi için uygundur. Bu nedenle, her örnek bir fare genelinde dolaşan periferik T hücre repertuarı oldukça kapsamlı bir analizini temsil eder. Epitop-spesifik T hücreleri de dahil olmak üzere, timüs 13,14 ilgili diğer dokular, zenginleştirilmiş olabilir. 4-5 haftalık fareler thymii analiz edildiğinde, tek bir epitopuna spesifik olarak timositlerde pozitif çevresel saf T hücreleri ile benzer numaralar tespit edilebilir. Epitop özel çift pozitif timositleri,Ancak nedeniyle TCR ifade onların düşük seviyelere tespit etmek çok zordur.
Bu protokol, aynı zamanda kan veya diğer dokulara 15-17 + ya da CD8 + T hücreleri epitopu özgü insan CD4 tespit etmek için adapte edilebilir. 100 ml kan toplanmış ve bir fare dalak 18 lenf düğümleri olarak epitopu-spesifik T hücrelerin sayısı karşılaştırılabilir doğuracak - epitopa spesifik T-hücrelerinin frekans kabaca farelerde ve insanlarda 17 arasında aynı olduğu, 50, analiz yani.
Tetramer tabanlı zenginleştirme takiben hücre akım sitometri analizi büyük bir meydan okuma arka plandan ayırt gerçek hücre olaylardır. Bu birçok autofluorescent hücrelerinin sürecinde de non-spesifik olarak zenginleştirilmiş olması büyük ölçüde kaynaklanmaktadır. Dikkatli bir şekilde kapı üzerinden değil ise, bu autofluorescent hücreler yanlış tetramer pozitif hücrelerde ortaya çıkabilir ve özellikle nadir saf T-hücresi p durumunda, analiz doğruluğu kurtulmakopulations. Bizim protokol CD3 + olayları uzak dökümü soyu + olaylar ve ardından CD4 gelen ilk kapı olduğu bir iki adım yolluk strateji benimseyerek + olaylar uzaklıkta CD8 + olaylardan kapı vardır. Bu süreç içinde, herhangi bir FACS arsa çapraz merkez boyunca uzanmak eğilimindedir autofluorescent hücreler, iki aşamada iteratif analiz tetkik vardır. Autofluorescent olayların etkili temizlenmesi birçok floresan renkler maliyetle geliyor, bu yüzden biz son derece en az 6 floresan parametreleri yeteneğine akışı sitometrinin kullanılmasını öneririz.
En pMHC tetramers PE ve APC bu florokromlar ait parlaklık nedeniyle konjuge olan ve anti-PE, anti-APC manyetik mikroboncukları kolayca onlarla zenginleştirme sağlamak için kullanılabilir. Karşılık gelen manyetik mikro-küreler olarak kullanılabilir Bununla birlikte, diğer florokromlar de o kadar uzun süre kullanılabilir. Gerçekten de, farklı florokrom etiketler ile çoklu tetramerleri, karşılık gelen antikor-konjuge mikrofon ile birlikte kullanılabiliraynı anda aynı örnekten birden epitop-spesifik T hücre popülasyonlarının zenginleştirmek robeads. Biz PE-ve APC-etiketli tetramers (Tablo 1) kullanımı için optimize edilmiş bir çok temel antikor-florokrom kurulum ana hatlarıyla, ama birçok diğer etkili kombinasyonları fenotipik belirteçlerin çalışma esnekliği artırmak mümkündür.
Bunlar pMHCII giren ligandlar olan (ve-epitopuna spesifik CD8 + T hücre zenginleştirme için tersi de geçerlidir) bağlamak gerekir beri CD8 + T hücre popülasyonu, dahili bir negatif kontrol olarak da kullanılabilir. PMHCII epitoplara çapraz kısıtlı özgüllük ile iyi niyetli tetramer-pozitif CD8 + T hücreleri çok küçük frekanslarda 19 itibariyle mevcut olsa da bir örnek tetramer + CD8 + hücrelerinin sıklığı, plan tetramer boyanma düzeyi iyi bir değerlendirme sağlar. Bazen çok güçlü bir bağışıklık yanıtları sırasında, bu hücrelerin genişletilmiş frekanslarda bulunabilir. Arzu edildiği takdirde, TCR transjenik T hücreleri yânih ya da uygun epitop özgünlüğü olmadan ek bir pozitif ve negatif kontroller olarak kullanılabilir. Bilinmeyen nedenlerle, bazı TCR transgenik hücreleri ve hibridomlar bunların ilgili tetramers iyi leke unutmayın.
Bizim protokol hücre sayıları hesaplanmasına yardımcı floresan sayma boncuk kullanımı içerir. Hücre sayımı da hemasitometre ile manuel elde edilebilir olsa da, biz çok daha fazla deneysel hassas boncuk sonuçları sayma kullanımı, birden fazla araştırmacı katılıyor özellikle bulabilirsiniz. Bu protokolde işlenir hücrelerin az sayıda ve hacimleri nedeniyle, deneysel hata minimizasyonu yüksek bir öncelik olmalıdır.
Tetramer boyama hücre fiksasyon ve geçirgenliği ile uyumludur ve çeşitli çalışmalar başarıyla tetramer tabanlı cep zenginleştirme 20,21 takiben hücrelerde intrasellüler sitokin ve transkripsiyon faktörü ekspresyonu analiz edilmiştir.Bununla birlikte, söz konusu ilave adımlar örneklerinde ek hücre kaybına katkıda bulunur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar, bu protokolün geliştirilmesi için yardım Jenkins laboratuar Andre Han ve Lawrence Yen teknik yardım ve üyelerine teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PE or APC conjugated pMHC tetramer (or multimer) | Made by investigator, obtained from the NIH tetramer core, or purchased from commercial sources | ||
| Anti-PE conjugated magnetic microbeads | Miltenyi | 130-048-801 | |
| Anti-APC conjugated magnetic microbeads | Miltenyi | 130-090-855 | |
| LS magnetic columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MidiMACS or QuadroMACS magnet | Miltenyi | 130-042-302 or 130-090-976 | |
| Cell counting beads | Life Technologies | PCB-100 |
References
- Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L.
- Kearney, E. R., Pape, K. A., Loh, D. Y., Jenkins, M. K. Visualization of peptide-specific T cell immunity and peripheral tolerance induction in vivo. Immunity. 1, 327-339 (1994).
- Moon, J. J.
- Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance. Science. 312, 114-116 (2006).
- Marzo, A. L. Initial T cell frequency dictates memory CD8+ T cell lineage commitment. Nat Immunol. 6, 793-799 (2005).
- Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nature reviews. Immunology. 11, 551-558 (2011).
- Moon, J. J. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27, 203-213 (2007).
- Seah, S. G. The linear range for accurately quantifying antigen-specific T-cell frequencies by tetramer staining during natural immune responses. European Journal of Immunology. 41, 1499-1500 (2011).
- Obar, J. J., Khanna, K. M., Lefrancois, L. Endogenous naive CD8+ T cell precursor frequency regulates primary and memory responses to infection. Immunity. 28, 859-869 (2008).
- Daniels, M. A., Jameson, S. C. Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers. J Exp Med. 191, 335-346 (2000).
- Pittet, M. J. Alpha 3 domain mutants of peptide/MHC class I multimers allow the selective isolation of high avidity tumor-reactive CD8 T cells. Journal of Immunology. 171, 1844-1849 (2003).
- Choi, E. M. High avidity antigen-specific CTL identified by CD8-independent tetramer staining. Journal of Immunology. 171, 5116-5123 (2003).
- Chu, H. H. Positive selection optimizes the number and function of MHCII-restricted CD4+ T cell clones in the naive polyclonal repertoire. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11241-11245 (2009).
- Chu, H. H., Moon, J. J., Kruse, A. C., Pepper, M., Jenkins, M. K. Negative Selection and Peptide Chemistry Determine the Size of Naive Foreign Peptide-MHC Class II-Specific CD4+ T Cell Populations. J Immunol. 185, 4705-4713 (2010).
- Legoux, F. Impact of TCR reactivity and HLA phenotype on naive CD8 T cell frequency in humans. J Immunol. 184, 6731-6738 (2010).
- Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K., Hasan, M., Albert, M. L. Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies. Blood. 115, 3718-3725 (2010).
- Kwok, W. W. Frequency of Epitope-Specific Naive CD4+ T Cells Correlates with Immunodominance in the Human Memory Repertoire. Journal of Immunology. 188, 2537-2544 (2012).
- Jenkins, M. K., Chu, H. H., McLachlan, J. B., Moon, J. J. On the composition of the preimmune repertoire of T cells specific for Peptide-major histocompatibility complex ligands. Annu Rev Immunol. 28, 275-294 (2010).
- Matechak, E. O., Killeen, N., Hedrick, S. M., Fowlkes, B. J. MHC class II-specific T cells can develop in the CD8 lineage when CD4 is absent. Immunity. 4, 337-347 (1996).
- Burchill, M. A. Linked T cell receptor and cytokine signaling govern the development of the regulatory T cell repertoire. Immunity. 28, 112-121 (2008).
- Pepper, M. Different routes of bacterial infection induce long-lived TH1 memory cells and short-lived TH17 cells. Nature Immunology. 11, 83-89 (2010).
