Summary
We beschrijven een protocol met behulp van dia's kamer en de media te planten zaadlobben voor confocale beeldvorming van de opperhuid te immobiliseren over meerdere dagen van de ontwikkeling, het documenteren van stomata differentiatie. Fluorofoor-gemerkte eiwitten kan dynamisch worden gevolgd door expressie en subcellulaire lokalisatie, het verhogen van het inzicht in de mogelijke rollen tijdens de celdeling en cel-type differentiatie.
Abstract
Imaging in vivo dynamiek van cellulair gedrag gedurende een ontwikkelingsvolgorde een krachtige techniek voor het begrijpen van de mechanismen van weefsel patronen zijn. Tijdens de dierlijke ontwikkeling, de belangrijkste celproliferatie en patroonvorming gebeurtenissen zeer snel. Bijvoorbeeld in Caenorhabditis elegans alle celdelingen die voor de larven bouwplan worden binnen zes uur na bevruchting, met zeven mitotische cycli 1, zestien of meer mitosen van Drosophila embryogenese bij minder dan 24 uur 2. Daarentegen celdelingen tijdens plantenontwikkeling traag, typisch in de orde van een dag 3,4,5. Dit legt een unieke uitdaging en een noodzaak voor de lange termijn live beeldvorming voor het documenteren van dynamische gedrag van celdeling en differentiatie gebeurtenissen tijdens fabriek organogenese. Arabidopsis epidermis is een uitstekend modelsysteem voor het onderzoeken van signalering, lot van de cel, en de ontwikkeling van planten. In de zaadlob, dit weefsel bestaat uit lucht-en waterbestendig stoep cellen afgewisseld met gelijkmatig verdeeld huidmondjes, kleppen die open en dicht bij de gasuitwisseling en verlies van water te controleren. Juiste afstand van deze stomata is cruciaal voor de functie en de ontwikkeling volgt een reeks asymmetrische deling en celdifferentiatie stappen om de georganiseerde epidermis (Fig. 1) te produceren.
Dit protocol maakt waarneming van cellen en eiwitten in de epidermis over verschillende dagen van ontwikkeling. Deze termijn maakt een nauwkeurige documentatie van stam-celdelingen en differentiatie van epidermale cellen, met inbegrip van huidmondjes en epidermale stoep cellen. Fluorescerende eiwitten worden gefuseerd om eiwitten van belang hun dynamiek beoordelen tijdens celdeling en differentiatie. Deze techniek staat te begrijpen het lokaliseren van een nieuw eiwit, POLAR 6, tijdens de fase van proliferatie stomatale-lineage cellen in the Arabidopsis cotyledon epidermis, waar het wordt uitgedrukt in cellen voorafgaand asymmetrische deling gebeurtenissen en verplaatst naar een karakteristiek deel van de cel cortex kort voor splitsing optreedt. Afbeeldingen kunnen worden geregistreerd en gestroomlijnd video gemakkelijk geproduceerd met behulp van public domain software om dynamische eiwit lokalisatie en celtypen te visualiseren als ze veranderen in de tijd.
Protocol
1. Zaadsterilisatie
- Bereid zaadsterilisatie oplossing: 33% bleekmiddel, 0,1% Triton X-100.
- Place zaden die gewenste fluorescerende reporter construct (s) en genotype (s) in 1,7 ml buis en toepassing van 1 ml sterilisatieoplossing. Incubeer op nutator gedurende 15 minuten.
- In een steriele kap, gebruik maken van een pipet om sterilisatie oplossing te verwijderen van de buis, waardoor er zaden achter. Spoelen met 1 ml steriel water. Herhaal vier keer.
- Incubeer bij 4 ° C gedurende twee dagen of meer.
2. Voorbereiding van Kamer Schuif Media
- Meng 20 ml van 0,5% oplossing van Bacto Agar (niet zuiver agarose) in water in een 200 ml kolf en magnetron tot opgelost. Wees voorzichtig bij het koken van de oplossing.
- Koel de oplossing tot ongeveer 60 ° C.
- Verzamel 1 ml agar-oplossing met een pipet en langzaam van toepassing op de dekking van glas in de kamer dia (Lab-Tek II Chambered # 1.5 Duitse coverglass System). Oplossing waarin is te heet of te snel toegepast kunnen lijm of crack glas smelten.
- Onmiddellijk een tweede ml agar-oplossing. Agar nu volledig bedekken de bodem van de dia kamer. Deze minimale media is voldoende om ontwikkeling in een plant cotyledon die opgeslagen voedingsstoffen, vier tot vijf dagen door het handhaven zodat vocht en gas diffusie bevat.
- Cool dia op benchtop met kamer bedekt. Als kolf wordt goed afgesloten kan worden opgeslagen en oplossing opgewarmd voor toekomstig gebruik.
3. Zaad Dissection
- Verwijderen tube steriel zaad van 4 ° C opgeslagen.
- Plaats een papieren zakdoek op het podium van een dissectiemicroscoop en bevochtig met water. Stel weefsel een glad oppervlak te maken. Weefsel wordt gebruikt om zaden voor dissectie stabiliseren.
- Pipet 20 tot 30 zaden van de buis aan het weefsel, en voorzichtig om ze te plaatsen in het gezichtsveld van de ontleden reikwijdte's standpunt.
- Met behulp van scherpe pincet (Roboz, # 5 biologie tip), Verwijder voorzichtig de zaadhuid van de zaailing binnen. Zowel buitenste en binnenste integumenten worden verwijderd.
- Bij beeldvorming de zaadlob, is het gunstig te verwijderen en de hypocotyl kiemwortel. Zaadlobben bevatten voldoende voedingsstoffen te ontwikkelen voor meerdere dagen onder dit protocol. Als intact zal de hypocotyl recht en dramatisch verlengen, bewegen de zaadlob van het tijdsverloop gezichtsveld. Gebruik een scalpel om de zaadlobben vrij van de hypocotyl snijden.
- Houd ontleed cotyledonen ondergedompeld in water, in een microbuis of dergelijke.
- Herhaal 3.4-3.6 totdat het gewenste aantal zaadlobben bereikt. 15 tot 20 succesvolle dissecties worden aanbevolen voor de montage.
4. Montage zaadlobben in de Kamer Dia
- Met behulp van een kleine (18 mm 2) dekglas, dwars door de agar media en de gehele laag optillen van glas de kamer dia basis.
- Pipet ontleed zaadlobben met een minimum aan water vasthoudenbuis in de kamer glijbaan, onder de opgeheven agar laag.
- Sluit voorzichtig de agar op de zaadlobben. Als er teveel water aanwezig is, laat deze weg met een tissue, en let niet op de zaadlobben verstoren. Specimens moeten niet langer gemakkelijk te verplaatsen wanneer mount is voltooid.
- Plaats de deksel op de kamer dia en zet schuif naar microscoop podium.
5. Time Lapse Imaging
- Stel omgekeerde confocale microscoop om de afbeelding op de gewenste fluorofoor (s). Gebruikt LSM700 parameters: voor GFP, excitatie bij 488 nm en de inning met een band pass filter op 440 tot 530 nm, want RFP, excitatie bij 555 nm en de inning met een band pass filter op 570 tot 610 nm.
- Inspecteer gemonteerd exemplaren op beschadigingen. Programmeer de locaties van intacte, goed gemonteerd zaadlobben in microscoop software. In Zen 2009: Focus op een zaadlob met 20x objectief en objectief naar het centrum van de kamer dia verplaatsen. Onder Acquisitie modus, veranderen Zoom tot 0,5 en frame </ Em> om 48x48 pixels. Selecteer posities checkbox en Scan overzichtsbeeld ... knop onder posities, dan stijgen horizontale en verticale tegel nummers 30-35. Wanneer scan is voltooid, klikt u op de posities knop onder de afmetingen tabblad en de plaats vizier op elke zaadlob te observeren.
- Stel z serie omvat de zaadlob epidermis van alle samples.In Zen 2009: Klik op de Z-Stack uit. Selecteer elke positie onder Positie en klik op de knop Verplaatsen naar. Focus op de bovenste vlak van de zaadlob epidermis en klik op de eerste knop onder Z-Stack. Focus op de laagste stand waarin epidermis is nuttig zichtbaar en klik op de knop Laatst. Klik op de knop naast Optimal, waaruit blijkt de beste z-slice dikte, in te stellen. Controleer elke zaadlob om te bevestigen dat deze instellingen alle monsters omvatten, de z parameters kunnen niet worden ingesteld voor individual posities in Zen 2009.
- Stel tijdreeksen op de gewenste resolutie en lengte. Intervallen van 15-30 min voor drie dagen zijn effectief voor eiwit dynamiek in epidermale celdeling. Dit kan worden gewijzigd indien nodig. In Zen 2009: Klik op het Time Series uit. Onder Time Series, stelt Cycli voor het aantal beelden gewenst met behulp van de schuifregelaar of typen in het tekstveld. Stel Interval tot 30 en gebruik de pull-down menu om min te selecteren.
- Begin xyzt multi-positie scan. Merk op dat het aantal posities te beperken door de scan specificaties als totale scantijd groter is dan de gewenste interval, de tijdstippen niet juist. Maximaal zes gelijktijdige posities mogelijk bij beeldvorming GFP en RFP op 59 z-segmenten in 30 min interval met ons systeem. In Zen 2009: Change Frame Grootte op de gewenste resolutie en klik op Start Experiment.
6. Videobewerking
- Uit de confocale gegevensbestand, maken een maximale intensiteit z-projectie van elke tijd / positie combinatie en export als beeldbestanden in een lossless formaat zoals TIFF. Bestandsnamen moeten worden in een reeks per positie (bijvoorbeeld POLAR-GFP_pos1_0001, POLAR-GFP_pos1_0002, enz., niet POLAR-GFP_0001_pos1) voor software om ze te combineren in een film. In Zen 2009: Gebruik Copy: Subset onder het tabblad Verwerking om posities te splitsen in aparte bestanden, dan Maximum Intensity Projection. Tot slot, exporteren als TIFF (Bestand: Export, Volledige resolutie beeldvenster - serie).
- Gebruik FIJI 7,8 beelden achter elkaar af te stemmen door het uitvoeren van de macro bUnwarpJ 9 (Plugins: Registratie: bUnwarpJ). Wijzig Registratie Mode op Mono. Alle Geavanceerde opties kunt gebruiken standaardwaarden. Voor lange time lapse sequenties, downloadt en installeert u de macro "Affine + Consistent Elastische 2D beeldregistratie", die bUnwarpJ automatisch van toepassing zijn op een serie beelden, en open yonze gegevens met behulp van File: Import: Afbeelding Sequence om het te gebruiken. Haal het vinkje weg MOPS monumenten extractie en run.
- Gebruik FIJI / ImageJ of Quicktime Pro om de volgorde van de uitgelijnde afbeeldingen te openen en in de gewenste video formaat (AVI is een goede keuze) op te slaan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een reeks informatieve tijdstippen verzameld deze methode wordt getoond in figuur 3. Celmembranen zijn gelabeld met RFP (pm-rb) en GFP gefuseerd met POLAR eiwit onder zijn oorspronkelijke promotor (POLAR :: POLAR-GFP) 6 Bij de 30-min tijdschaal, zien we celdelingen, samen met de veranderingen in de eiwit lokalisatie daaraan voorafgaande. Asymmetrische celdelingen in de stomatale lijn vorm stamcelachtige zoals stomata precursors genoemd meristemoids, die het vermogen verdere asymmetrische gebieden ondergaan behouden en hun zuster cellen, genaamd stomatale lineage grond cellen (SLGCs). SLGCs niet uit van een stomatale precursor lot, en vaak transdifferentiëren in bestrating cellen, maar kunnen asymmetrische deling vermogen weer een andere meristemoid op afstand van het eerste als het blad expandeert produceren. Al deze lot worden weerspiegeld in de expressie en lokalisatie van POLAR :: POLAR-GFP (Fig. 3, Video 1).
jove_content "fo: keep-together.within-page =" always ">
Figuur 1. Schema van stomatale ontwikkeling. Protodermal cellen binnen de stomatale afkomst als meristemoid moedercellen (MMC) in stap gecontroleerd door de basic helix-loop-helix transcriptiefactoren SPEECHLESS (SPCH), SCREAM (SCRM) en SCRM2. MMCs delen asymmetrisch een meristemoid (M) en stomatale cel lijn grond (SLGC) produceren, kan deze stap meerdere keren voorkomen en biedt een mechanisme waarmee stomata elkaar geplaatst. De cel-state overgang van de meristemoid aan de bewaker moedercel (GMC) identiteit wordt duidelijk voorgeschreven door de bHLH MUTE alsmede SCRM / 2. Een laatste symmetrische verdeling van de GMC en de differentiatie in twee volwassen sluitcellen (GC) vereist dat de bHLH FAMA met SCRM / 2 10.ig1large.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Diagram zaad dissectie en montageprocedure. Zaden worden gesteriliseerd en bewaard bij 4 ° C, de zaadvliezen en hypocotylen verwijderd en de zaadlobben bevestigd onder agar media in een kamer dia beeldvorming op een omgekeerde confocale microscoop.
Figuur 3. Time-lapse imaging toont POLAR :: POLAR-GFP distale lokalisatie voorafgaand aan asymmetrische celdeling. Serie A: POLAR-GFP verschijnt in eerste instantie gelijkmatig verdeeld, daarna ongeveer twee uur voor asymmetrischesche divisies (pijlpunten) POLAR-GFP scheidt uit de buurt van de site van de beginnende meristemoid. Serie B: Na de eerste asymmetrische deling (pijlpunt), POLAR-GFP verdwijnt in beide cellen, wat een snelle overgang naar moedercel (GMC) staat bewaken door de meristemoid. De GMC (sterretje) verdeelt symmetrisch en onderscheidt te vormen stomatale sluitcellen, terwijl de zuster cel herwint POLAR-GFP expressie, vermoedelijk voorbode van een latere asymmetrische divisie.
Video 1. Gestroomlijnde, geregistreerde video van POLAR :: POLAR-GFP localisatie tijdens de amplificatie en de afstand van een stomatale voorloper cel. Aanvankelijk POLAR-GFP gelijkmatig in de cel met 39 uur na ontkieming, het polariseert sterk, net voor splitsingen (40.0h) die een kleinere meristemoid aan de andere kant van de cel. De grotere cel rechts herwint ook stomatale lineage identiteit en 45 hr POLAR-GFP lokalisatie verplaatst naast de stomatale precursor. De verdeling op 47 uur produceert een nieuwe meristemoid (rechts) gericht af van de huidige meristemoid (links) uit de eerste. Het eindresultaat is twee stomata gescheiden door een cel. (Foto's ontbreken in de video werden niet verzameld en vertegenwoordigen geen significante veranderingen.) Klik hier om film te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze time-lapse confocale techniek maakt longitudinale studies van fluorescent gemerkte eiwit expressie en lokalisatie in afzonderlijke cellen van de epidermis Arabidopsis cotyledon die bij POLAR en dynamisch veranderende eiwitten is essentieel voor een goed begrip van hun functie. Eerder heeft geleidelijk time lapse imaging gebruikt om Arabidopsis wortel schimmelinfectie 11 en meristeem groei 5,12 onderzoeken, maar het toevoegen van de zaadlob epidermis vergroot de veelzijdigheid van deze techniek en maakt het gebruik extra eiwitten, met name ondersteuning van de groeiende sector van stomata ontwikkeling .
Het protocol belangrijkste beperking is dat het op dit moment beperkt tot zaadlobben, die de voedingsstoffen die ze nodig hebben voor de vroege ontwikkeling bevatten. Verder zaadlob ontwikkeling is niet precies gelijk aan die ondergaan in de lucht, omdat de gel medium beperkt gasuitwisseling. Scannen laser blootstelling en kamer verlichting zijn geschikt voor fotomorfogenese, het induceren van zaadlob uitbreiding en chloroplast rijping, maar huidmondjes kan af en toe ontwikkelen in aangrenzende paren als gevolg van lage CO 2-concentratie. Deze tendens kan worden verminderd door slechts een dunne laag media en minimale montage water zoals aangegeven in dit protocol.
Fluorofoor selectie is ook van belang voor succes met deze techniek. Zowel GFP en RFP werk goed, en laat dubbele etikettering om de cel periferie te visualiseren of eiwit co-lokalisatie te beoordelen. Aangepaste filters sterk verminderen autofluorescentie en laat gevoelige detectie van fluorescerende eiwit-tags, zelfs wanneer chlorofyl aanwezig is. Zelfs gefiltreerd CFP autofluorescentie in kiemende zaadlobben sterk genoeg om de zichtbaarheid van bijna alle signaal met de LSM700 voorkomen. Voor instrumenten met een spectrale unmixing vermogen, kan een bredere selectie van fluoroforen haalbaar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken Amanda Rychel voor hulp bij de ontwikkeling van de time lapse-protocol en Lynn Pillitteri voor de bouw van POLAR :: POLAR-eGFP. We zijn ook dankbaar ABRC voor het verstrekken van de pm-rb te construeren. Dit protocol is ontwikkeld door middel van een ondersteuning van de PRESTO award uit Japan Wetenschap Technologie en het Agentschap. Onderzoek naar POLAR werd ook ondersteund door de Universiteit van Washington Royalty Research Fund (RRF-4098) en de National Science Foundation (MCB-0855659). KMP is een NSF Graduate Research Fellow (DGE-0718124), en KUT is een HHMI-GBMF onderzoeker.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| One-chamber slide | Nunc (Thermo Scientific) | 155360 | Or two-chamber (155379) |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Zen 2009 software |
| 20x objective lens | Zeiss | 420650-9901 | NA 0.8, Plan-APOCHROMAT |
| Dissecting microscope | Benz (National) | 431TBL | Illuminates from below |
| #5 forceps, biology tip | Roboz Surgical Instrument | RS-4978 | Very fine tips are critical |
References
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The Embryonic Cell Lineage of the Nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100, 64 (1983).
- Foe, V., Odell, G., Edgar, B. A. Chapter 3 Mitosis and Morphogenesis: Point and Counterpoint. Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, NY. (1993).
- Vincent, C. A., Carpenter, R., Coen, E. S. Cell Lineage Patterns and Homeotic Gene Activity During Antirrhinum Flower Development. Current Biology. 5, 1449 (1995).
- Beemster, G. T. S., De Vusser, K., De Tavernier, E., De Bock, K., Inzé, D. Variation in Growth Rate between Arabidopsis Ecotypes Is Correlated with Cell Division and A-Type Cyclin-Dependent Kinase Activity. Plant Physiology. 129 (2), 854 (2002).
- Grandjean, O., Vernoux, T., Laufs, P., Belcram, K., Mizukami, Y., Traas, J. In Vivo Analysis of Cell Division, Cell Growth, and Differentiation at the Shoot Apical Meristem in Arabidopsis. Plant Cell. 16 (1), 74 (2004).
- Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. Molecular Profiling of Stomatal Meristemoids Reveals New Component of Asymmetric Cell Division and Commonalities among Stem Cell Populations in Arabidopsis. Plant Cell. 23 (9), 3260 (2011).
- Fiji Is Just ImageJ. , Fiji. Available from: http://fiji.sc/wiki/index.php/Fiji (2008).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J.
- Arganda-Carreras, I., Sorzano, S. ánchez, Marabini, C. O., Carazo, R., de Solorzano, J. M. O. rtiz-, C,, Kybic, J. Consistent and Elastic Registration of Histological Sections Using Vector-Spline Regularization. Computer Vision Approaches to Medical Image Analysis, ser. Lecture Notes in Computer Science. 4241, Springer. Heidelberg, Berlin. 85-95 (2006).
- Peterson, K. M., Rychel, A. L., Torii, K. U. Out of the Mouths of Plants: The Molecular Basis of the Evolution and Diversity of Stomatal Development. Plant Cell. 22 (2), 296 (2010).
- Czymmek, K. J., Fogg, M., Powell, D. H., Sweigard, J., Park, S. -Y., Kang, S. In vivo Time-lapse Documentation Using Confocal and Multi-Photon Microscopy Reveals the Mechanisms of Invasion into the Arabidopsis Root Vascular System by Fusarium oxysporum. Fungal Genetics and Biology. 44 (10), 1011 (2007).
- Campilho, A., Garcia, B., Toorn, H. V., Wijk, H. V., Campilho, A., Scheres, B. Time-Lapse Analysis of Stem-cell Divisions in the Arabidopsis thaliana Root Meristem. Plant Journal. 48, 619 (2006).
