Summary
Vi beskriver en protokoll med kammer lysbilder og media for å immobilisere plante cotyledons for confocal avbildning av epidermis over flere dager med utvikling, dokumentere stomatal differensiering. Fluoroforen-merket proteiner kan spores dynamisk ved uttrykk og subcellulære lokalisering, øke forståelsen av de mulige roller under celledeling og celle-type differensiering.
Abstract
Imaging in vivo dynamikken i mobilnettet atferd gjennom en utviklingsmessig sekvens kan være en kraftig teknikk for å forstå mekanikken i vev mønster. Under dyr utvikling, tast celleproliferasjon og mønster hendelser skje svært raskt. For eksempel, i Caenorhabditis elegans alle celledelinger kreves for larve kroppen blir realisert innen seks timer etter befruktning, med syv mitotiske sykluser 1; de seksten eller flere mitoses av Drosophila embryogenese forekommer i mindre enn 24 timer 2. I kontrast, celledelinger under planteutvikling er langsom, typisk i størrelsesorden av en dag 3,4,5. Dette medfører en unik utfordring og et behov for langsiktige live bildebehandling for å dokumentere dynamiske atferd av celledeling og differensiering hendelser under anlegget organogenesen. Arabidopsis epidermis er en utmerket modell system for å undersøke signalering, celle skjebne og utvikling i planter. I cotyledon består dette vevet av luft-og vanntette fortau celler ispedd jevnt fordelt stomata, ventiler som åpnes og lukkes for å kontrollere gassutveksling og vanntap. Riktig avstand mellom disse stomata er kritisk for sin funksjon, og deres utvikling følger en sekvens av asymmetrisk divisjon og celledifferensiering trinnene å produsere den organiserte epidermis (fig. 1).
Denne protokollen tillater observasjon av celler og proteiner i epidermis over flere dager av utvikling. Denne tidsrammen gir nøyaktig dokumentasjon av stilk-celledelinger og differensiering av epidermal cellene, inkludert stomata og epidermal fortau celler. Fluoriserende proteiner kan være smeltet til proteiner av interesse å vurdere sine dynamikken under celledeling og differensiering prosesser. Denne teknikken tillater oss å forstå lokalisering av et nytt protein, 6 POLAR, under spredning stadium av stomatal-avstamning celler i the Arabidopsis cotyledon epidermis, hvor den er uttrykt i celler foranstående asymmetriske divisjon hendelser og beveger seg til et karakteristisk område av cellen cortex like før divisjonen oppstår. Bilder kan bli registrert og strømlinjeformet video enkelt produsert med public domain programvare for å visualisere dynamisk protein lokalisering og celletyper som de endrer seg over tid.
Protocol
1. Seed Sterilisering
- Forbered seed sterilisering løsning: 33% klorin, 0,1% Triton X-100.
- Place frø bærer ønsket fluorescerende reporter konstruere (s) og genotypen (r) i 1,7 ml rør og påfør en ml sterilisering løsning. Inkuber på nutator i 15 min.
- I en steril hette, bruke en pipetten for å fjerne sterilisering løsning fra røret, forlater frø bak. Skyll med 1 ml sterilt vann. Gjenta fire ganger.
- Inkuber ved 4 ° C i to dager eller mer.
2. Utarbeidelse av Chamber Slide Media
- Bland 20 ml 0,5% oppløsning av Bacto Agar (ikke rent agarose) i vann i en 200 ml kolbe, og mikrobølgeovn inntil oppløsning. Vær forsiktig når du koker løsningen.
- Avkjøl løsningen til omkring 60 ° C.
- Samle 1 ml agaroppløsningen med pipetten og langsomt gjelder dekslet glasset inne i kammeret lysbildet (Lab-Tek II Chambered # 1,5 Tysk Coverglass System). Løsningen which er for varmt eller søkt for raskt kan smelte lim eller sprekk glass.
- Umiddelbart legger til en ekstra ml agaroppløsningen. Agar-media bør nå dekke bunnen av lysbildet kammeret. Dette minimal media er tilstrekkelig til å støtte utviklingen i et anlegg cotyledon, som inneholder lagrede næringsstoffer, for fire til fem dager ved å opprettholde fuktighet og tillater gass diffusjon.
- Cool lysbilde på stasjonære med kammer dekket. Hvis kolbe er dekket tett, kan oppløsningen lagres og reheated for fremtidig bruk.
3. Seed Dissection
- Fjern tube steril frø fra 4 ° C lagring.
- Plasser et papirlommetørkle på scenen av en disseksjonsmikroskop og fukte med vann. Juster vev for å skape en glatt overflate. Vev brukes til å stabilisere frø for disseksjon.
- Pipet 20-30 frø fra røret til vevet, er forsiktig med å plassere dem i dissekere omfanget synsfelt.
- Bruke skarpe tang (Roboz, # 5 biologi tips), Fjern forsiktig frøet frakk fra frøplante innsiden. Både ytre og indre integuments må fjernes.
- Når imaging cotyledon, er det fordelaktig å fjerne hypocotyl og radicle. Cotyledons inneholder nok næringsstoffer for å utvikle flere dager under denne protokollen. Hvis intakt vil hypocotyl rette og forlenge dramatisk, flytte cotyledon ut av tidsforløp synsfelt. Bruk en skalpell til å skjære cotyledons fri fra hypocotyl.
- Hold dissekert cotyledons neddykket i vann, i en mikrorør eller lignende.
- Gjenta 03.04 til 03.06 til ønsket antall cotyledons er nådd. 15-20 vellykkede disseksjoner anbefales før montering.
4. Montering Frøblad i Chamber Slide
- Ved hjelp av en liten (18 mm 2) dekkglass, skjære gjennom agar-media og løfte hele laget opp fra kammeret lysbildet glassplate base.
- Pipet dissekerte cotyledons med et minimum av vann fra å holderøret inn i kammeret lysbildet, under løftet agar laget.
- Senk agar på de cotyledons. Hvis overflødig vann er tilstede, suge det bort med en vev, være forsiktig med å forstyrre cotyledons. Prøver skal ikke lenger bevege seg lett når mount er fullført.
- Plasser dekselet på kammeret lysbilde og flytte lysbilde til mikroskop scenen.
5. Time Lapse Imaging
- Sett opp invertert konfokal mikroskop skal avbilde ønskede fluoroforen (e). LSM700 parametre som brukes: for GFP, eksitasjon ved 488 nm og samling med et band pass filter på 440-530 nm, for RFP, eksitasjon ved 555 nm og samling med et band pass filter på 570-610 nm.
- Inspisere montert prøver for skader. Programmere steder intakt, montert riktig cotyledons inn mikroskop programvare. I 2009 Zen: Fokus på et cotyledon med 20x objektiv og flytte målet til sentrum av kammeret lysbilde. Under Acquisition Mode, endre zoom til 0,5 og rammestørrelse </ Em> til 48x48 piksler. Velg Posisjoner boksen og Scan oversiktsbilde ...-knappen under Positions, deretter øker horisontale og vertikale fliser tall til 30-35. Når skanningen er fullført, klikker du på Posisjoner knappen under fanen Dimensjoner og sted trådkorset på hver cotyledon å observere.
- Sett opp z-serien som omfatter cotyledon epidermis av alle samples.In Zen 2009: Klikk på Z-Stack boksen. Velg hver posisjon under posisjon, og klikk på Flytt til knappen. Fokus på det øverste planet av cotyledon epidermis og klikker på Angi First knappen under Z-Stack. Fokus til den laveste posisjonen hvor epidermis er hensiktsmessig synlig og klikker på Angi Siste knappen. Klikk på knappen ved siden Optimal, som viser den beste z-skivetykkelse, å stille. Sjekk hver cotyledon å bekrefte at disse innstillingene omfatter alle prøver, z parametrene kan ikke angis for individual posisjoner i Zen 2009.
- Sett opp tidsserier på ønsket oppløsning og lengde. Intervaller på 15-30 min i tre dager er effektive for protein dynamikk i epidermal celledeling. Dette intervallet kan endres etter behov. I Zen 2009: Klikk på Time Series boksen. Under tidsrekke, sette Cycles for hvor mange bilder ønskede ved hjelp av glidebryteren eller skrive i tekstfeltet. Still intervall til 30 og bruke rullegardinmenyen til å velge min.
- Begynn xyzt flere posisjoner scan. Merk at antall posisjoner må være begrenset av skanningen spesifikasjoner; hvis total scanningtid er større enn det ønskede intervall, vil tidspunktene ikke være korrekt. Maksimalt seks samtidige posisjoner er mulig når bildebehandling GFP og RFP på 59 z-skiver i en 30-min intervall ved hjelp av vårt system. I Zen 2009: Endre rammestørrelse til ønsket oppløsning og klikk på Start Experiment.
6. Videoredigering
- Fra confocal datafil, lage en maksimal intensitet z-projeksjon av hver gang / stilling kombinasjon og eksport som bildefiler i et lossless format som TIFF. Filnavnene skal være i én serie per posisjon (f.eks POLAR-GFP_pos1_0001, POLAR-GFP_pos1_0002, etc., ikke POLAR-GFP_0001_pos1) for programvare for å kombinere dem til en film. I Zen 2009: Bruk Copy: Subset under Processing fanen for å dele posisjoner i separate filer, så maksimal intensitet projeksjon. Til slutt eksportere som TIFF (Fil: Export, Full oppløsning vinduet - serien).
- Bruk FIJI 7,8 for å justere etterfølgende bilder ved å kjøre bUnwarpJ makro 9 (Plugins: Registrering: bUnwarpJ). Endre registreringsmodus til Mono. Alle Avanserte alternativer kan bruke standardverdier. For lang tid lapse-sekvenser, laste ned og installere makro "Affine + Konsekvent Elastisk 2D-bilde Registrering", som vil gjelde bUnwarpJ til en rekke bilder automatisk, og åpen yvåre data ved hjelp av File: Import: Image Sequence å bruke den. Fjern merkingen MOPS landemerker utvinning og løpe.
- Bruk FIJI / ImageJ eller Quicktime Pro til å åpne sekvensen av sammenstilte bilder og lagre i ønsket videoformat (AVI er et godt valg).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et sett av informative tidspunkter innsamlet med denne metoden er vist i figur 3.. Er cellemembraner merket med RFP (pm-RB) og GFP er smeltet til POLAR protein under sitt opprinnelige arrangøren (POLAR :: POLAR-GFP) 6 På 30-min tid skala, ser vi celledelinger sammen med endringer i protein lokalisering foran dem. Asymmetriske celledelinger i stomatal avstamning skjemaet stilk-celle-lignende stomatal forløpere kalt meristemoids, som har bevart evnen til å gjennomgå ytterligere asymmetriske divisjoner, og deres søster celler, kalt stomatal avstamning bakken celler (SLGCs). SLGCs ikke anta en stomatal forløper skjebne, de ofte transdifferentiate inn fortau celler, men kan gjenoppta asymmetrisk divisjon evne til å produsere en annen meristemoid adskilt fra den første som bladet utvides. Alle disse skjebner gjenspeiles i uttrykket og lokalisering av POLAR :: POLAR-GFP (Fig. 3, Video 1).
jove_content "fo: keep-together.within-page =" always ">
Figur 1. Skjematisk av stomatal utvikling. Protodermal celler inn i stomatal avstamning som meristemoid mor celler (MMC) i et trinn kontrollert av de grunnleggende helix-loop-helix transkripsjonsfaktorer SPEECHLESS (SPCH), Scream (SCRM), og SCRM2. Multimediekort dele asymmetrisk å produsere en meristemoid (M) og stomatal avstamning bakken celle (SLGC), dette trinnet kan forekomme flere ganger og gir en mekanisme som spalteåpningene er adskilt. Celle-state overgang av meristemoid til vakten mor celle (GMC) identitet er rettet spesielt ved bHLH MUTE samt SCRM / 2. En endelig symmetrisk fordeling av GMC og differensiering i to modne vakt celler (GC) krever bHLH FAMA med SCRM / 2 10.ig1large.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større figur.
Figur 2. Diagram av frø disseksjon og montering prosedyre. Frø er sterilisert og holdes ved 4 ° C, frøet strøk og hypocotyls fjernes, og cotyledons montert under agar-media i et kammer lysbilde for avbildning på en invertert konfokal mikroskop.
Figur 3. Time-lapse bildebehandling demonstrerer POLAR :: POLAR-GFP distal lokalisering før asymmetrisk celledeling. Serie A: POLAR-GFP vises først jevnt fordelt, så omtrent to timer før asymmekraftforbruket divisjoner (pilspisser) POLAR-GFP segregerer unna stedet der begynnende meristemoid. Serie B: Etter den første asymmetrisk divisjon (pilspiss), forsvinner POLAR-GFP i begge celler, noe som tyder rask overgang til vokte mor celle (GMC) tilstand av meristemoid. GMC (stjerne) deler symmetrisk og skiller å danne stomatal vakt celler, mens søsteren celle gjenvinner POLAR-GFP uttrykk, antagelig presaging et senere asymmetrisk divisjon.
Video 1. Strømlinjeformet, registrert video av POLAR :: POLAR-GFP lokalisering under forsterkning og avstanden mellom en stomatal forløper celle. Utgangspunktet synes POLAR-GFP jevnt i cellen, ved 39 timer etter spiring, det polarizes sterkt, like før en divisjon (40.0h) å plassere en mindre meristemoid ved den motsatte enden av cellen. Jo større celle til høyre gjenvinner også stomatal avstamning identitet, og med 45 timers POLAR-GFP lokalisering flytter grenser til stomatal forløper. Divisjonen ved 47 hr produserer en ny meristemoid (høyre) orienterte unna eksisterende meristemoid (til venstre) fra den første. Sluttresultatet er to stomata atskilt med en celle. (Bilder mangler fra videoen ikke ble samlet og representerer ikke vesentlige endringer.) Klikk her for å se filmen .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette time-lapse confocal teknikken gir longitudinelle studier av fluorescently merket protein uttrykk og lokalisering i enkelte celler i Arabidopsis cotyledon epidermis, som i tilfelle av POLAR og andre dynamisk skiftende proteiner er avgjørende for en riktig forståelse av sin funksjon. Tidligere har vedvarende tidsforløp bildebehandling blitt brukt til å undersøke Arabidopsis root soppinfeksjon 11 og meristem vekst 5,12, men legger til cotyledon epidermis utvider allsidigheten av denne teknikken og tillater bruk for ekstra proteiner, spesielt assistere voksende feltet av stomatal utvikling .
Protokollen viktigste begrensningen er at det er i dag begrenset til cotyledons, som inneholder de næringsstoffene de trenger for tidlig utvikling. Videre er cotyledon utvikling ikke akkurat identisk gjennomgått i luft fordi gelen mediet begrenser gassutveksling. Skanning laser eksponering og rom lys er tilstrekkelig for photomorphogenesis, indusere cotyledon ekspansjon og kloroplast modning, men stomata kan av og til utvikle seg i tilstøtende par på grunn av lav CO 2-konsentrasjon. Denne tendensen kan reduseres ved hjelp av bare et tynt lag av media og minimal montering vann som anvist i denne protokollen.
Fluorofor utvalg er også viktig for å lykkes med denne teknikken. Både GFP og RFP fungerer godt, og la dobbel merking for å visualisere cellen periferien eller vurdere protein samlokalisering. Tilpassede filtre sterkt redusere autofluorescens og la påvisning av fluorescerende protein tags selv når klorofyll er til stede. Men selv filtrert CFP autofluorescens i germinating cotyledons sterk nok til å hindre synligheten av nesten alle signaler ved hjelp av LSM700. For instrumenter med en spektral unmixing evne, kan et bredere utvalg av fluoroforer være gjennomførbart.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi takker Amanda Rychel for å få hjelp i utviklingen av tidsforløp protokollen og Lynn Pillitteri for å konstruere POLAR :: POLAR-eGFP. Vi er også takknemlige for ABRC for å gi pm-rb konstruere. Denne protokollen ble utviklet gjennom et støtte fra PRESTO prisen fra Japan Science Technology and Agency. Forskning på POLAR ble også støttet av Universitetet i Washington Royalty forskningsfond (RRF-4098) og National Science Foundation (MCB-0855659). KMP er en NSF Graduate Research Fellow (DGE-0718124), og KUT er en HHMI-GBMF etterforsker.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| One-chamber slide | Nunc (Thermo Scientific) | 155360 | Or two-chamber (155379) |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Zen 2009 software |
| 20x objective lens | Zeiss | 420650-9901 | NA 0.8, Plan-APOCHROMAT |
| Dissecting microscope | Benz (National) | 431TBL | Illuminates from below |
| #5 forceps, biology tip | Roboz Surgical Instrument | RS-4978 | Very fine tips are critical |
References
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The Embryonic Cell Lineage of the Nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100, 64 (1983).
- Foe, V., Odell, G., Edgar, B. A. Chapter 3 Mitosis and Morphogenesis: Point and Counterpoint. Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, NY. (1993).
- Vincent, C. A., Carpenter, R., Coen, E. S. Cell Lineage Patterns and Homeotic Gene Activity During Antirrhinum Flower Development. Current Biology. 5, 1449 (1995).
- Beemster, G. T. S., De Vusser, K., De Tavernier, E., De Bock, K., Inzé, D. Variation in Growth Rate between Arabidopsis Ecotypes Is Correlated with Cell Division and A-Type Cyclin-Dependent Kinase Activity. Plant Physiology. 129 (2), 854 (2002).
- Grandjean, O., Vernoux, T., Laufs, P., Belcram, K., Mizukami, Y., Traas, J. In Vivo Analysis of Cell Division, Cell Growth, and Differentiation at the Shoot Apical Meristem in Arabidopsis. Plant Cell. 16 (1), 74 (2004).
- Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. Molecular Profiling of Stomatal Meristemoids Reveals New Component of Asymmetric Cell Division and Commonalities among Stem Cell Populations in Arabidopsis. Plant Cell. 23 (9), 3260 (2011).
- Fiji Is Just ImageJ. , Fiji. Available from: http://fiji.sc/wiki/index.php/Fiji (2008).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J.
- Arganda-Carreras, I., Sorzano, S. ánchez, Marabini, C. O., Carazo, R., de Solorzano, J. M. O. rtiz-, C,, Kybic, J. Consistent and Elastic Registration of Histological Sections Using Vector-Spline Regularization. Computer Vision Approaches to Medical Image Analysis, ser. Lecture Notes in Computer Science. 4241, Springer. Heidelberg, Berlin. 85-95 (2006).
- Peterson, K. M., Rychel, A. L., Torii, K. U. Out of the Mouths of Plants: The Molecular Basis of the Evolution and Diversity of Stomatal Development. Plant Cell. 22 (2), 296 (2010).
- Czymmek, K. J., Fogg, M., Powell, D. H., Sweigard, J., Park, S. -Y., Kang, S. In vivo Time-lapse Documentation Using Confocal and Multi-Photon Microscopy Reveals the Mechanisms of Invasion into the Arabidopsis Root Vascular System by Fusarium oxysporum. Fungal Genetics and Biology. 44 (10), 1011 (2007).
- Campilho, A., Garcia, B., Toorn, H. V., Wijk, H. V., Campilho, A., Scheres, B. Time-Lapse Analysis of Stem-cell Divisions in the Arabidopsis thaliana Root Meristem. Plant Journal. 48, 619 (2006).
