En Low Cost Oppsett for Behavioral Audiometri i Gnagere

Summary

En rask og billig metode for de atferdsmessige bestemmelse av å høre parametere som å høre terskler, hørselshemmede eller fantom oppfatninger (subjektiv tinnitus) er beskrevet. Den bruker pre-puls hemming av den akustiske sjokkrespons og kan lett implementeres i en personlig datamaskin med en programmerbar AD / DA-omformer og en piezo-sensor.

Abstract

I auditiv dyreforsøk er det avgjørende å ha presis informasjon om grunnleggende hørsel parametere til forsøksdyr som er involvert i forsøkene. Slike parametre kan være fysiologisk respons kjennetegn ved hørselsbanen, f.eks via hjernestammen audiometri (BERA). Men disse metodene tillater bare indirekte og usikre ekstrapoleringer om auditive percept som tilsvarer disse fysiologiske parametre. Å vurdere perseptuelle nivået av hørsel, atferdsmessige metoder må benyttes. Et potensielt problem med bruk av atferdsmessige metoder for beskrivelse av persepsjon i dyremodeller er det faktum at de fleste av disse metodene innebære noen form for læring paradigmet før fagene kan behaviorally testet, kan f.eks dyrene må lære å trykke på en spak i respons på en lyd. Ettersom disse læring paradigmer endring oppfatning selv ^1,2 følgelig vil de påvirke noe resultat om persepsjon oppnådd meddisse metodene og derfor må tolkes med forsiktighet. Unntaket er paradigmer som gjør bruk av refleks reaksjoner, fordi her ingen læring paradigmer må utføres før perseptuelle testing. En slik refleks er den akustiske sjokkrespons (ASR) som kan sterkt reproduserbart fremkalles med uventede høye lyder i naive dyr. Denne ASR i sin tur kan påvirkes av foregående lyder avhengig perceptibility av dette foregående stimulus: Sounds godt over høreterskel vil fullstendig hemme amplituden av ASR; høres nært terskelen vil bare litt hemme ASR. Dette fenomenet kalles pre-puls hemming (PPI) ^3,4, og mengden av PPI på ASR gradvis avhenger perceptibility av pre-pulsen. PPI av ASR er derfor godt egnet for å bestemme atferdsmessige Audiogrammer hos naive, ikke-utdannede dyr, for å fastslå hørselsvansker eller selv å oppdage mulige subjektiv tinnitus oppfatter i dissedyr. I denne artikkelen demonstrerer vi bruken av denne metoden i en gnager-modell (jf. også ref.. ^5), den mongolske gerbil (Meriones unguiculatus), som er et godt kjent modell arter for skremmeeffekt forskning innenfor normale menneskelige hørevidde (f.eks ^6).

Protocol

1. Oppsett Montering og programmering

1. Installer en D / A-kortet i en PC (f.eks: NI 6229 PCI, National Instruments) og koble den til en avslapnings-boks (f.eks: BNC-2110, National Instruments), bør begge støtte minst én inngang og én utgang kanal med en samplingsfrekvens på minst 44,1 kHz hver.
2. Koble utgangen av avslapnings-boksen via BNC kabel til en lyd forsterker (f.eks: AMP75 wideband effektforsterker, Thomas Wulf).
3. Installer en infrarød webkamera (f.eks: Grand IP Camera Pro, Grandtec Electronics) for dyr overvåking i mørket.
4. Installer en Integrated Development Environment (f.eks: Matlab) for å gjennomføre et program som definert av flytskjemaet i figur 1. En versjon som kjører på Matlab 2007b kan fås gratis fra tilsvarende forfatteren.
5. Innenfor en lydtett kammer installere en høyttaler på et bord. Koble høyttaleren to lyden forsterker.
6. Installer en piezo sensor (f.eks kraftsensor FSG15N1A, Honeywell) på toppen av et isolerende bord, støtter det med kraft og kobler den til via BNC kabel til inngangen av avslapnings-boksen; bakken sensorsignalet.
7. Bygge en målekammer fra en akryl glassrør justert til størrelsen av gnager å måle (for ørkenrotter f.eks: lengde 15 cm, indre diameter 4,3 cm, ytre diameter 4,8 cm). Fikse en rist med en maskevidde på 0,5 mm til forsiden av røret og en polstret dør med en låsemekanisme (f.eks, en krok) til baksiden. Fiksering kan gjøres med varmt lim, for døren kun hengselet og bøylen for kroken er festet til røret.
8. Fest skumplast føtter som passer de måle rørdimensjoner på isolerende sensor bord. Føtter bør støtte røret under foran og bakre ende og løfte røret til sensoren nivå. Sørge for at det er lett kontakt mellom piezo sensor og målekammer. Fest sensoren bord med målekammeret sentrert foran høyttaleren og sette en mikrofon for lyd kontroll ved siden av det (f.eks B & K Type 2669 / B & K Type 4190 knyttet til måling forsterker B & K Type 2610, alle: Bruel og Kjaer) på nivå av dyrene hodet slik at det ikke er i konflikt med røret.
9. Legg merke til at kvaliteten på audiometriske data vil avhenge av kvaliteten av lydsystemet. I alle fall bruke mikrofonen og måle forsterker for å bestemme frekvensen overføring funksjon av systemet før de første eksperimentene og inkluderer en rutine i programvaren for å korrigere for denne frekvensen overføre funksjonen til å gjøre den spektrale produksjon av høyttaleren flat.
10. Juster webkamera med oppsettet slik at man kan overvåke dyrenes atferd.

2. Behavioral Bestemmelse av hørsel Terskler (Audiogrammer)

1. Ta dyret fra sitt hjem buret og sette den hodet først i røret, cmister døren.
2. Sett røret på skum føtter og sensoren. Slå av alt lys og lukke døren til kammeret. Kammeret seg selv er ikke aircondition, men har temperatur, fuktighet og andre miljømessige variabler av den omkringliggende laboratoriet. Luftskifte etter vifter ikke tilrådelig på grunn av den induserte støy, men volumet av kammeret er støtter oksygen for dyret i mange timer. Vent 15 minutter for å la dyret å bli vant til oppsettet. Den akklimatisering er gunstig for dyret som det kan roe ned på sitt eget tempo og bli vant til røret. På den annen side, gjør man ikke se noen forskjeller i oppførsel under akklimatisering tid over flere sesjon, som angir at en ekstra sesjon for familiarizing dyret med røret og kammeret før forsøket ikke er påkrevet.
3. Start programmet og definere parametrene for stimulering (jf. også ref ^5).: Stimuli består av rene toner med forskjellig frequencies. Skremmeeffekt stimulans må bli presentert med et lydtrykknivå høyt nok til å reproduserbart lokke fram en skremmeeffekt. I vårt laboratorium bruker vi intensiteter av 105 dB SPL (stimulus varighet 6 ms inkludert 2 ms cosinus-squared vekst og fall ramper) å lokke fram skremme svar i mongolske ørkenrotter. Prøvestimuli foregående skremmeeffekt stimuli er presentert på varierende frekvenser og intensiteter i området som skal testes, vanligvis nedenfra høreterskel til nivåer godt over terskelen og med frekvenser dekker hele det hørbare området av arten. Frekvens og varighet av skremmeeffekt og testen stimulans blir matchet i hvert forsøk, er interstimulus intervallet mellom skremmeeffekt og test stimulans satt til 100 ms. Bruke minst 15 repetisjoner med randomiserte interstimulus intervaller på 10 ± 2,5 sek for hver frekvens og intensitet kombinasjon av prøvestimuli (jf. Figur 2A, til venstre). Etterfølgende prøvestimuli kan presenteres i enten randomisert eller ikke-løpdomized rekkefølge. Hvis du bruker en ikke-randomisert tilnærming (for eksempel ett test stimulans nivå fast for alle testede frekvenser) tillater 5 min for utvinning mellom ulike tiltakspakker sett. Merk at den bestemmes absolutte terskel vil avhenge randomisering av stimuli, men mulig relativ skift terskelen vil ikke (f.eks etter akustisk traumer, jfr. Ref.. ^5).
4. Før analyse av data, fjerne ugyldige forsøk fra datasettet (f.eks studier der dyret flyttes før skremmeeffekten stimulus;. Jf. figur 2B).
5. Innenfor et tidsvindu av de første 50 ms etter skremmeeffekten stimulans, beregne responsen amplitude (topp til topp mellom det første maksimum til første minimum av responsen) og respons latens (tiden fra start til stimulus respons utbruddet) av hver enkelt prøve .
6. Monter en Boltzmann-funksjonen til fullstendig respons amplitude datasett av en frekvens sortert for prestimulus intensitet for alle gyldige single forsøk. Den 50% punktet på Boltzmann-funksjon ⁷ indikerer høreterskel for denne stimulering frekvens.

3. Akustisk Trauma og kvantifisering av hørselsskader

1. Forbered ketamin-xylazin-anestesi med en blanding av ketamin hydroklorid: 96 mg / kg (Ketamin-ratiopharm, Ratiopharm); xylazin hydroklorid: 4 mg / kg (Rompun 2%, Bayer); atropin sulfat: 1 mg / kg (Atropinsulfat, B. Braun Melsungen AG) og fysiologisk NaCl-løsning (Berlin-Chemie AG, Berlin) med et forhold på 9:1:2:8.
2. Injiser dyret med 3 ml / kg av anestesi subkutan. Vent til dyret er dypt bedøvet (ca. 5 min, sjekk reflekser, for eksempel ved bruk av pedal tilbaketrekking reflex). For å opprettholde anestesi under målinger, kontinuerlig injisere det anestetiske oppløsning ved en hastighet på 3 ml / kg / time ved hjelp av en sprøytepumpe. Styr vitale tegn med riktig utstyr (for eksempel puste via kamera) og holde dyret varme ved placing det på en oppvarming pad.
3. Indusere en akustisk traumer, for eksempel med en høy ren tone: f.eks 2 kHz ved 115dB SPL for 75 min.
4. Etter slutten av traumer stoppe sprøytepumpen og la dyret våken i en wake-up bur på en oppvarming pad på et rolig sted. Sjekk regelmessig under oppvåkningen fase dersom vitale er stabile. Sette dyr i sitt hjem buret bare når det er helt våken. La dyret gjenopprette fra anestesi (minst 2 dager) og hvile i sin hjemme bur.
5. Utfør 02.01 til 02.06 igjen. Sammenligne høre terskler før og etter den akustiske traumer ved å beregne hvor stor prosentandel av hørselstap for hver frekvens. Etter utløpet av alle eksperimentene smertefritt avlive dyret.

4. Test for Acoustic Phantom Perception (Subjektiv tinnitus)

1. Utføre disse målingene før og etter akustisk traumer.
2. Følg 02.01 til 02.02 hvis dyret ikke allerede er i oppsettet.
3. A number av stimulering paradigmer kan brukes til å teste gnagere for subjektiv tinnitus. Forholdet i alle disse fremgangsmåter er å teste for avhengigheten av en taus gap innenfor en bakgrunnsstøy. Hvis gapet oppfattes av dyrene, kan den brukes som en test stimulans å redusere en skremmeeffekt analogt med fremgangsmåten beskrevet i 2. Hvis dyret lider av tinnitus (som sannsynligvis vil utvikle seg etter akustisk traume), vil dette tinnitus oppfattes innenfor den stille gap og derfor gjør gapet mindre fremtredende. Effekten av gapet på skremmeeffekt følgelig blir svakere i tinnitus dyr sammenlignet med friske kontroller (redusert PPI, jfr. ^8). Denne iakttagelsen er testet med to litt forskjellige protokoller.
4. I den første subjektiv tinnitus paradigme som presenteres her (. Figur 2A, senteret, jf. ⁹⁾ bruke følgende parametere for stimulering: skremmeeffekt lydintensitet 105 dB SPL med frekvenser 1-16 kHz i en oktav trinn, Stimuloss lengde 6 ms inkludert 2 ms cosinus-squared vekst og fall ramper. Presentere en hvit støy bakgrunn av 50 dB SPL under forsøket, enten med eller uten en 15 ms gap som forut skremmeeffekten stimulans ved 100 ms; stede minst 15 forsøk for hver frekvens og gap-tilstand. Hvis du bruker en ikke-randomisert tilnærming, la 5 min restitusjon mellom de ulike stimulans sett. Bruk av ulike skremme stimulans frekvenser vil gi et grovt estimat av oppfattet tinnitus frekvens.
5. Som en andre subjektiv tinnitus paradigmet (Figur 2A, høyre) kan du bruke følgende stimulering parametere: skremmeeffekt lydintensitet 105 dB SPL, dobbeltklikk på stimulans med 0,1 ms varighet per klikk og 0,1 ms mellom klikkene, det andre klikket ha omvendt retning sammenliknet med den første. Presentere en Båndpassdesign filtrert støy bakgrunn av 50 dB SPL med en gaussisk filter bredde på 0,5 oktaver og senterfrekvens fra 1 til 16 kHz i oktav trinn. Presentere denne støyen either med eller uten en 15 ms gap som forut skremmeeffekten stimulans ved 100 ms; stede minst 15 forsøk for hver frekvens og gap-tilstand. Hvis du bruker en ikke-randomisert tilnærming, la 5 min restitusjon mellom de ulike stimulans sett. Bruken av ulike Senterfrekvensene av Båndpassdesign bakgrunnsstøy vil gi en grovt estimat av oppfattet tinnitus frekvensen.
6. Følg 2,4 til 2,5; normalisere alle innsamlede data med en referanse datasett for hver testet frekvens og hver traumer tilstand, dvs. før og etter en akustisk traumer.. Denne referansen er responsen amplitude til den rene tone skremmeeffekten stimulans uten prestimulus (jfr. 2.3). Frekvensen bestemmes enten av ren tone eller senterfrekvensen av båndpass filtrert støy. Beregn middelverdien respons hver referanse og normalisere hver beregnede respons amplitude ved å dele det med henvisning sin.
7. Beregn PPI ved å dividere de normaliserte respons amplitudene gapet condition gjennom gjennomsnittet av normalisert nei-gap tilstanden hver testet frekvens.
8. Beregn PPI endring etter traumer i prosent for hver testet frekvens.

Skremmeeffekt svar av dyr er enkelt å generere og analysere. Figur 2B gir en oversikt over et typisk resultat av et dyr stimulert med en ren tone på 105 dB SPL uten prestimulus for 15 ganger. Flertallet av studiene er er gyldige og ugyldige forsøk lett å kjenne igjen (forsøk merket med rød firkant). Responsen amplituder og ventetider er beregnet kun fra gyldige studier.

En typisk behavioral terskel endring er gitt i figur 3A. Audiogrammet av en eksemplarisk dyr ervervet med metoden beskrevet i 2 er gitt før (blå) og etter (rød) en akustisk traumer ved 2 kHz (gule området). En klar hørselstap er vist spesielt ved 2 kHz. Svarene relatert til en subjektiv tinnitus percept kan væresett i Figur 3b, er den normaliserte responsen amplitudene av samme dyr som ovenfor vist exemplarily for stimuleringer en oktav under og over traumer som beskrevet i 4.5. Sammenligningen av svarene på stimuli med og uten gap før (blå) og etter traumer (rød) kan en tolkning av en mulig tinnitus percept. Nedenfor traumer frekvensen ingen endring av reaksjonsmønster kan bli funnet mens ovenfor traumer effekten av gapet forsvant etter traumer, som indikerer en mispercept på denne frekvensen.

Figur 1. Flytdiagram av programmet benyttes til å erverve de atferdsmessige terskler og subjektiv tinnitus data. Vær oppmerksom på at dette kun er en forenklet versjon av programkoden. Forkortelser: GUI - grafisk brukergrensesnitt, ISI - Inter stimulans intervall.

Figur 2. Auditiv sjokkrespons (ASR) stimuli. A Ordninger av de tre forskjellige stimuleringsregimer brukt. Venstre panel: pre-puls hemming (PPI) av ASR målt uten ren tone test stimulans før (grønn) skremmeeffekt tone (rød); responsen perioden er avbildet i blått. Midtre panelet: gap / støy paradigme med ren tone skremmeeffekt stimulans presentasjon av ulike frekvenser på en hvit støy bakgrunn. Høyre panel: gap / støy paradigme med klikk skremmeeffekt stimulans presentasjon på Båndpassdesign filtrert bakgrunn av ulike Senterfrekvensene B Eksempler auditive skremme svar av 15 studier tatt opp med terskelen paradigmet uten prestimulus ved 1 kHz stimulering frekvens.. Tre studier telles ugyldige (røde firkanter) som dyret beveget allerede før stimulering utbruddet.

<img alt = "Figur 3" src = "/ files/ftp_upload/4433/4433fig3.jpg" />
Figur 3. Eksemplariske resultater av ASR i ett dyr. En Behavioral terskel før (blå) og etter (rød) den akustiske traumer ved 2 kHz (gule området). Tersklene regnes fra svarene til PPI modulert ASR protokoll ved hjelp Boltzmann-funksjonen vendepunkt som terskelverdi. Vær oppmerksom på at hørselstap på 2 kHz utgjør mer enn 66%, mens farer unna traumer frekvens man ofte kan se selv forbedring av hørsel terskler B Normalisert respons amplituder (åpne sirkler:. Enkle forsøk, fylt sirkler: Midler værhår: standardavvik) under stimulering med gapet / støy klikk ASR-protokollen (4,5) for 1 og 4 kHz Senterfrekvensene. Responser sorteres for utprøving uten og med gap i støy før og etter traumer på 2 kHz. Kun på 4 kHz effekten av gapet vanishes etter traumer som indikerer en subjektiv tinnitus percept rundt dettefrekvens.

Discussion

Vi presenterer en billig og enkel å bygge oppsett for audiometriske målinger i gnagere basert på pre-puls hemming av akustiske skremme responser som kan brukes til å bestemme atferdsmessige hørsel terskler (= Audiogrammer ¹⁰⁾ og auditive fantom persepter som subjektiv tinnitus ^11. Spesielt sistnevnte mål er i fokus for flere nyere rapporter ^8,12,13,14 og kan ses som en forutsetning for elektrofysiologiske undersøkelser av neuronal mekanismene bak denne sykdommen. Ved hjelp av denne metoden er det skille mulig hvilke dyr gjorde utvikle en subjektiv tinnitus percept etter akustisk traumer og de ​​som ikke gjorde det, og deretter videre undersøke disse personene, f.eks med elektrofysiologiske opptak i grunnskolen auditiv cortex.

En kritisk steg i analysen av skremmeeffekt data etter akustisk traumer er en normalisering av data til skremmeeffekt amplitude som kanmaksimalt fremkalles uten forutgående test stimulus: Dette er spesielt viktig å skille redusert skremme svar basert på hørselstap fra redusert PPI i tinnitus dyr: Effektene av den akustiske traumer endrer seg over tid, som dyret delvis gjenoppretter fra det, men omtrent 50 % av hørselstap er permanent. I motsetning til rapporter nevnt ovenfor, hvor de auditive tersklene er testet, men ikke brukt for kalibrering, prøvde vi å minimalisere virkningene av de forskjellige høreapparater tersklene hver frekvens, og effekten av den akustiske traumer selve ved normalisering hver respons amplitude med en referanse. I tillegg bruker vi to forskjellige typer protokoller for å vurdere eventuelle tinnitus percept, med den første (4,4) fungerer bedre for dyr testet over lengre tidsskalaer fra en uke etter traumer på, og den andre "klassiske" (4,5) fungerer bedre for dyr testet innen en uke etter traumer.

En begrensning med denne metoden er Clearly at man ikke kan vurdere akutte virkningene av en akustisk traumer. Minst to dager mellom anestesi og den første post-måling bør velges, som dyret har å komme seg fra den. For å oppnå et estimat av akutt hørselstap direkte etter traume, hjernestamme audiometri (BERA) kan brukes.