Summary
Bidrag ACF chromatin remodeling faktor til E4orf4-induceret celledød blev målt. Protokollen omfatter selektion af cellekloner, hvor doxycyclin behandling inducerer betinget knockdown af ACF-underenheder Acf1 og SNF2h, og brugen af DAPI assay til måling af E4orf4-induceret celledød i de inducerbare cellelinjer.
Abstract
Funktionel inaktivering af genekspression i pattedyrceller er afgørende for studiet af bidraget af et protein af interesse til forskellige veje 1,2. Imidlertid er betinget knockdown af genekspression kræves i tilfælde, hvor konstitutiv knockdown ikke tolereres af celler i en længere tidsperiode 3-5. Her beskriver vi en protokol til fremstilling af cellelinier muliggør betinget knockdown af underenheder af ACF kromatin remodellering faktor. Disse cellelinier lette bestemmelse af bidraget af ACF til induktion af celledød ved adenovirus E4orf4-proteinet 6. Sekvenser, der koder korte hairpin RNAs for Acf1 og SNF2h subunits af ACF chromatin remodeling faktor, blev klonet ved siden af en doxycyclin-inducerbar promotor i et plasmid også indeholder et gen for neomycinresistensgenet. Neomycin-resistente cellekloner blev selekteret i nærværelse af G418 og isoleret. De resulterende cellelinjer blev induceret veddoxycyclin behandling, og når Acf1 eller SNF2h ekspressionsniveauer blev reduceret, blev cellerne transficeret med et plasmid der koder for E4orf4 eller en tom vektor. For at bekræfte den specifikke effekt af shRNA konstruktioner blev Acf1 eller SNF2h proteinniveauer genoprettet til WT niveauer ved cotransfektion med et plasmid, der udtrykker Acf1 eller SNF2h der blev gjort resistente over for shRNA ved indføring af tavse mutationer. Evnen af E4orf4 at inducere celledød i de forskellige prøver blev bestemt ved en DAPI-assay, ved hvilken hyppigheden af forekomsten af kerner med apoptotiske morfologier i den transficerede cellepopulation blev målt 7-9.
Protokollen beskrevet her, kan anvendes til bestemmelse af den funktionelle bidrag af forskellige proteiner til induktion af celledød ved deres protein partnere i tilfælde, hvor konstitutiv knockdown kan være celle-letal.
Protocol
1. Generering af Inducerbare cellelinier
- Inden forsøget man nødt til at finde den minimale koncentration af lægemidlet G418, der dræber alle cellerne anvendes til fremstilling af de ønskede cellelinjer. Til dette formål. Plade cellerne af valg i flere dobbelte plader ved 70% konfluens i mediet, der vil blive anvendt under forsøget, og der tilsættes stigende koncentrationer af G418 (0-1,000 ug per ml) Overvåge cellerne dagligt for at bestemme den minimale G418 koncentration, der dræber cellerne effektivt. Celledød observeret inden for 3-7 dage.
- Forud for generering af cellelinjer anbefales det at verificere ved transiente transfektionsassays, at plasmidet der udtrykker shRNA kan reducere et vist omfang ekspression af genet under undersøgelse. Dette kan ske i enhver cellelinie, der effektivt kan transficeres.
- Plade T-Rex-293-celler ved en densitet på omkring 5x10 6 celler per 10 cm plade i 8 ml DMEM-medium (indeholdende 10% Tet systamceller godkendt FBS, 2mM L-glutamin, 100 enheder per ml penicillin og 0,1 mg per ml streptomycin, 5 ug per ml blasticidin). Inkubér pladerne natten over ved 37 ° C, 5% CO2.
- På den følgende dag, ændre medium til 8 ml frisk medium før transfektion.
- Transficere cellerne under anvendelse af 10 ug pSuperior.neo + GFP-plasmidet (fig. 1), der koder Acf1 eller SNF2h shRNA drevet af en tetracyklin-inducerbare H1 promotor, samt neomycin-resistens genet fusioneret til GFP og drevet af en konstitutiv PGK-promotor. Tilsæt DNA til 500 pi af 150 mM NaCl. Tilsæt jetPIE reagens til en anden alikvot på 500 pi af 150 mM NaCI ved 2 pi per ug DNA. Tilsæt jetPIE løsning til DNA og bland godt ved hvirvelbehandling. Inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur. Forsigtigt pipetteres DNA-komplekser på de 10 cm plader indeholdende 70-80% konfluente celler. Returnerer pladerne til inkubatoren.
- Den næste dag udskiftes mediet med et selektivt medium (DMEM medium sombeskrevet ovenfor indeholdende yderligere 500 ug per ml G418).
- For de næste to uger overvåger cellerne og erstatte det selektive medium med en tilsvarende frisk medium hver 3-4 dage, indtil kolonierne vises og kan visualiseres uden mikroskop.
- Før isolering af kolonier, fremstille plader med 24 brønde med selektivt medium.
- Identificer kolonier ved øjet, og markere deres placering i bunden af pladen ved hjælp af en farvet markør. Kontrollerer i mikroskop at kolonierne godt adskilt.
- I den sterile hætte, aspireres mediet fra pladen, forsigtigt skylle med varmt PBS, og der opsuges godt alle resterende væske. Tilsæt 3 pi af 0,25% trypsin / EDTA til en koloni på pladen. Afpipetter den trypsin, indtil cellerne løsnes og tilføj dem til en af brøndene i 24-brønds plade. Gentag dette for flere andre kolonier på pladen.
- Dyrke cellerne ved 37 ° C, 5% CO2, indtil de fylder brønden. Derefter opdele celler afledt afhver af de oprindelige kolonier i tre brønde, hver i en særskilt plade med 12 brønde, og inkuber natten over.
- På den følgende dag, udskiftes mediet i en plade med medium indeholdende 1 ug per ml doxycyclin fra en stamopløsning fremstillet i dobbeltdestilleret vand (1-5 mg per ml). Udskifte mediet i en kontrolplade med medium uden doxycyclin. Inkubér cellerne i 72 timer ved 37 ° C, 5% CO2.
- Høst celler fra behandlede en og en ubehandlet brønd i hver celle klon til fremstilling af proteinekstrakter og Western blot-analyse for at bestemme effektiviteten af Acf1 eller SNF2h knockdown. Anvende antistoffer til Acf1 eller SNF2h samt antistoffer mod alpha-tubulin, der tjener som en loading kontrol. Bruge cellerne i tredje brønd, ikke behandles, til udvidelse af udvalgte cellekloner, hvor doxycyclin tilsætning førte til mindst 50% reduktion i niveauet af proteinet, der undersøges. Frys prøver af disse celler i 90% FBS, 10% DMSO til senere brug.
- Plade celler i det selektive medium i 10 cm plader. Tilføj doxycyclin ved 1 ug pr ml til halvdelen af pladerne om og inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2 i 48-72 timer (se figur 4).
- Efter 48 til 72 timer, Trypsinisér cellerne fra hver gruppe af celler, tælle dem og plade 1.5x10 6 celler pr 6 cm plade i det samme medium, med eller uden doxycyclin. Inkuberes cellerne ved 37 ° C, 5% CO2 natten over. Plan, så at hver gruppe af plader fra afsnit 2.1 vil give cellerne i tolv 6 cm plader, herunder to kopier for DAPI assay for hvert punkt og en plade til Western blot-analyse af hver prøve (se figur 4).
- Den følgende dag transficere cellerne i 6 cm plader med følgende kombinationer af plasmider: 1 ug af et tomt plasmid eller en identisk mængde af plasmidet koder for E4orf4, sammen med 4 ug af en vektorudtrykker Acf1-GFP eller SNF2h-GFP gjort resistente over for shRNA i cellekloner ved indføring af tavse mutationer eller 3 ug af den tilsvarende tom vektor og 1 ug plasmid, der udtrykker GFP (fig. 4). Brug jetPIE reagens som beskrevet ovenfor (10 pi per 5 pg DNA) til fremstilling af transfektion blandes. For hver prøve fremstilles en transfektion mix for tre plader.
- Efter en 15 minutters inkubering af DNA med jetPIE reagens ved stuetemperatur pipetteres forsigtigt lige mængder af DNA-komplekser fra hver transfektion blanding på tre 6 cm plader og inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2 natten over.
3. DAPI assay i transfekterede celler
- Den næste dag, ekstrahere proteiner fra en plade pr prøve til Western blot-analyse for at bestemme, at Acf1 eller SNF2h er effektivt slået ned, og at E4orf4 blev udtrykt ens i de forskellige prøver.
- Suges mediet fra pladerne bestemt til DAPIassay, vaskes pladerne forsigtigt med PBS, og der tilsættes 1 ml 4% paraformaldehyd fremstillet i PBS for at dække cellerne. Fremstilling af paraformaldehydopløsning og behandling af cellerne med dette kemikalie bør gennemføres i et kemisk stinkskab. Inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur uden omrystning.
- Aspirer paraformaldehyd og vaskes tre gange med PBS, rocking ved stuetemperatur i 5 minutter hver gang. Der tilsættes 80% ethanol holdt ved -20 ° C og inkuberes ved -20 ° C i mindst 1 time. Pladerne kan holdes under ethanol ved -20 ° C i adskillige dage, så længe de forsegles godt for at undgå fordampning af ethanol og tørring.
- Aspirer ethanol og vaske cellerne to gange med PBS og en gang med PBS-BT (PBS indeholdende 0,5% BSA og 0,05% Tween-20),. Rocking ved stuetemperatur i 5 min hver gang
- For at forhindre ikke-specifik antistofbinding, blokere cellerne i 1 ml PBS-BT-puffer indeholdende 10% gedeserum i 20 minutter, mens rokkende ved stuetemperatur. Vask derefter than celler to gange i PBS-BT, 5 minutter hver vask.
- Inkubér cellerne med det primære antistof (et E4orf4-specifikt antistof i vores tilfælde) i 1 ml PBS-BT i 1 time under rokkende ved stuetemperatur. Derefter vaskes to gange i PBS-BT og en gang i PBS indeholdende 0,1% BSA, 5 minutter hver vask.
- Inkubér cellerne i 1 ml PBS-0.1% BSA indeholdende den passende sekundære fluorescens-mærket antistof, og 0,5 ug per ml slutkoncentration af DAPI i 40 minutter under rokkende ved stuetemperatur i mørke. Vask derefter med PBS i 5 minutter, tørre godt ved sugning og holde pladerne på hovedet i yderligere en time til natten over at nå fuldstændig tørring. Derefter monteres dækslides på cellerne under anvendelse Fluoromount-G-opløsning. Holde pladerne ved 4 ° C i mørke indtil den er klar til at tælle apoptotiske kerner.
- Spørg en kollega til at identificere de forskellige plader med nye numre, så tælle apoptotisk kerner i de forskellige prøver kan gøres på en fordomsfri måde.
- Visualiser cellerne under et upright fluorescerende mikroskop ved en forstørrelse på 400 gange (i luft) eller 630X (i immersionsolie). Identificere transficerede celler, der er farvet for de forskellige proteiner, der udtrykkes i hver prøve, og tælle antallet af kondenserede eller fragmenterede kerner visualiseret ved DAPI-farvning inden for den transficerede cellepopulation. Overvåge flere felter og tælle i alt mindst 200 transficerede celler.
- Procentdelen af kerner med apoptotisk morfologi i den transficerede cellepopulation. Gentag forsøget med dubletter, til 2-3 gange beregne den statistiske signifikans af ændringer mellem de forskellige prøver.
4. Repræsentative resultater
Effektiviteten af opnåelse af kolonier, som betinget knockdown af genekspression har været vellykket er variabel, afhængigt af den involverede genet. I vores hænder, opnåede vi 7 succesfulde kolonier ud af 12 testet for Acf1 og 6 ud af 18 for SNF2h. Figur 2 shOWS en repræsentativ plade af udvalgte cellekloner (figur 2A) og en enkelt koloni (figur 2B). Figur 3 viser et repræsentativt blot fremstillet med proteiner ekstraheret fra celler af forskellige kloner dyrket i nærvær eller fravær af doxycyclin i 72 timer. Blottet blev farvet med antistoffer mod SNF2h og alpha-tubulin, der tjener som en loading kontrol. To af klonerne (nummer 4 og 5) udviste en kraftig reduktion i SNF2h niveauer upon doxycyclin induktion. Det skal bemærkes, at selv om pSuperior.neo + GFP-plasmidet (fig. 1) anvendes til frembringelse af cellelinierne koder for et neo-GFP-fusionsproteinet, den grønne fluorescens i de stabile cellelinjer var meget lav og ekspression af andre GFP-fusionsproteiner indføres transient i disse celler kunne let påvises over baggrunden grøn fluorescens.
En skematisk fremstilling af de eksperimenter, der udføres i cellekloner til MEAKontroller virkningen af Acf1 eller SNF2h knockdown på E4orf4-induceret celledød er vist i fig. 4. Den nødvendige tid til knockdown af genekspression ved doxycyclin behandling kan variere afhængigt af proteinets stabilitet, hvis niveauer skal reduceres. For Acf1 og SNF2h blev en 72 hr som er nødvendig for effektiv knockdown på proteinniveauet.
Figur 5 viser et eksempel på celler, der udtrykker E4orf4 og GFP og undergår celledød manifesterer sig ved fremkomsten af DAPI-farvede kerner med en kondenseret eller fragmenteret morfologi. Figur 6 viser resultaterne af et repræsentativt forsøg viser, at doxycyclin-induceret Acf1 knockdown førte til en stigning i E4orf4-stimuleret celledød (figur 6A). Denne stigning skyldtes ikke en stigning i E4orf4 niveauer (figur 6B). Endvidere genoprettelse af Acf1 til doxycyclin-inducerede celler mindre stigningen i E4orf4 toksicitet til de niveauer, observeret i ikke-inducerede celler (figur 6).
Figur 1. Kort af pSuperior.neo + GFP plasmid. Kortet viser det tetracyklin-inducerbare H1 promotor, der driver shRNA ekspression og PGK-promotor, der driver ekspression af et neo-GFP-fusionsproteinet. Kortet blev tilpasset fra OligoEngine pSuperior manual.
Figur 2. Identifikation af neomycin-resistente kolonier. Billeder af en plade indeholdende kolonier (A) og af en enkelt koloni (B) er vist. Kolonierne blev opnået ved dyrkning af cellerne i 14 dage i et selektivt medium indeholdende neomycin.
Figur 3. Undersøgelse af knockdown effektivitet i udvalgte kolonier. Celler fra flere kolonier valgt i nærvær af neomycin blev udpladet i to fordybninger. Én brønd af hver prøve blev induceret af doxycyclin (+) og en brønd blev efterladt ubehandlet (-). Proteiner blev ekstraheret 72 timer efter induktion og kromatograferet på SDS-PAGE. Western blot blev farvet successivt med antistoffer mod SNF2h og alpha-tubulin (der tjener som en loading kontrol) og viser SNF2h niveauer i inducerede og kontrol-celler.
Figur 4. Planlægge en typisk knockdown-DAPI assay eksperiment. Hinanden følgende trin af forsøget er vist, herunder doxycyclin behandling for at opnå Acf1 eller SNF2h knockdown, a transfektion at genoprette Acf1 eller SNF2h ekspression eller at indføre en empty vektor og indføre E4orf4 eller dets tilsvarende tom vektor i cellerne, og analyse af resultaterne. Doxycyclin-behandlede plader er vist i rød (Dox) og kontrolplader er markeret med blåt. Klik her for at se større figur .
Figur 5. Påvisning af E4orf4-induceret celledød af DAPI-assay. Celler hvilken der er foretaget forskellige behandlinger beskrevet i figur 4 blev fikseret og farvet med E4orf4-specifikke antistoffer og DAPI at visualisere kernerne i transficerede celler. Denne særlige billede blev taget fra en prøve indeholdende E4orf4 og kontrol GFP-proteinet. (A) GFP. (B) E4orf4. (C) DAPI. (D) flettede billeder. De hvide pile mærket GFP-og E4orf4-transficerede celler indeholdende kerner med apoptotiske morfologier. Røde pilemarkere kerner med uregelmæssige former, der ikke medregnes som apoptotiske kerner. Stjerner mark mitotisk kerner eller kerner, der netop har delt.
Figur 6. Acf1 knockdown øger E4orf4-induceret celledød. (A) Celler fra T-Rex-293-afledt cellelinie, der udtrykker Acf1-shRNA fra en tetracyklin-inducerbar promotor blev induceret med doxycyclin (+ Dox) eller lades ubehandlet (-Dox). Tre dage senere blev cellerne transficeret med plasmider, der udtrykker E4orf4 (+ E4orf4) eller en tom vektor (-E4orf4) sammen med en tom vektor eller et plasmid, der udtrykker GFP-mærket Acf1, som blev gjort resistente over for shRNA ved indføring af tavse mutationer. Cellerne blev fikseret 24 timer efter transfektion og farvet med antistoffer mod E4orf4 og med DAPI. Induktion af celledød blev målt ved hjælp af DAPI beskrevet ovenfor, og procentdelen of transficerede celler med komprimeret eller fragmenteret kerner blev bestemt. Et repræsentativt eksperiment med tre gentagelser er vist, og fejlsøjlerne repræsenterer standardafvigelsen. (B) Celler fra parallelle plader blev høstet til Western blot analyse. Blottet blev farvet med antistoffer mod E4orf4, GFP, og Acf1. Den endogene Acf1 og Acf1-GFP er vist i to separate paneler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Knockdown af specifik genekspression er en vigtig metode til undersøgelsen af bidraget af et protein til regulatoriske veje. Siden konstitutiv knockdown af ekspression af essentielle gener negativt påvirker celleproliferation, kan deres undersøgelse kræve enten forbigående introduktion af siRNAs eller anvendelse af stabile betingede knockdown-systemer. Generering af stabile cellelinjer med kapacitet til medikament-induceret ekspression af shRNAs beskrevet her, tilvejebringer en fordel i forhold til transiente transfektioner der måske ikke er effektiv i mange cellelinjer, og over anvendelsen af virus, som kræver gentagen fremstilling og undertiden en yderligere kortvarigt Udtrykket markering. Cellelinjerne, når der genereres, kræver ikke yderligere forberedelse. Endvidere i vore hænder, var forbigående transfektioner af shRNA konstruktioner meget mindre effektive i at vælte genekspression sammenlignet med induktion af shRNA udtryk i de udvalgte cellelinjer. Det anbefalered dog at undersøge i hvert enkelt forsøg, at lægemiddelinduceret knockdown forblev effektiv. En potentiel ulempe ved anvendelsen af stabile cellelinjer for betinget knockdown af genekspression er, at de har erhvervet yderligere ændringer under udvælgelsesprocessen, der potentielt kan påvirke resultatet af eksperimenter. Men for at overvinde dette problem, kan man udføre forsøget i to parallelle cellelinier eller vende knockdown effekt ved introduktion af et plasmid, der udtrykker et shRNA-resistent WT protein. Hvis WT protein eliminerer virkningen af shRNA, kan en klonal virkning kan udelukkes.
Klassisk, caspase-afhængig apoptose, kan analyseres ved flere metoder, herunder påvisning af caspaseaktivering, annexin-V-farvning, Tunnel farvning, detektering af en sub-G1 cellepopulation ved FACS, etc. 10. Imidlertid E4orf4 inducerer en ikke-klassisk, caspase-uafhængig celledød i mange cellelinjer og adskillige metoderfor apoptose afsløring gælder ikke for påvisning af denne unikke form for celledød 6,7,11,12. Det er tidligere blevet vist, at de mest typiske morfologier i forbindelse med E4orf4-induceret celledød indbefatter membran blæredannelse, nuklear kondensation eller fragmentering, og celle løsgørelse 13. Derfor måler man normalt E4orf4-induceret celledød ved at analysere nukleare kondensation og fragmentering, eller celletab.
Ved anvendelse af DAPI analysen, bør man være særlig opmærksom på følgende punkter: 1) at opretholde en optimal objektivitet af testen, er det stærkt anbefales, at analysen vil blive udført i en "blind måde", så den person, der tæller antallet af celler indeholdende kerner med apoptotiske morfologier vil ikke være klar over prøvens identitet. 2) Det anbefales at opretholde strenge kriterier for at identificere nukleare apoptotiske morfologier, som ikke bør forveksles med mitotisk kerner eller kerner med uneven-morfologier (se figur 5). Yderligere celledød assays kan også anvendes som en udlæsning af eksperimentet, såsom klonogene celleoverlevelsesrater assays 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet (delvis) af Israel Science Foundation (Grant 399/11), af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) inden for rammerne af Den tysk-israelske Projekt Samarbejde (DIP), og af Rappaport Family Institut for Forskning i Medical Sciences.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High glucose DMEM | Gibco | 41965 | |
| Tet system approved FBS | Clontech | 631106 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | |
| T-REx-293 cells | Invitrogen | R710-07 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| blasticidin | Invitrogen | R210-01 | |
| pSuperior.neo+GFP plasmid | OligoEngine | VEC-PBS-0007/0008 | |
| jetPIE | Polyplus transfection | 101-40 | |
| doxycycline | Sigma | D9891 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 |
References
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science (New York, N.Y). 296, 550-553 (2002).
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference. Cancer. 2, 243-247 (2002).
- Czauderna, F. Inducible shRNA expression for application in a prostate cancer mouse model. Nucleic acids research. 31, e127 (2003).
- Matsukura, S., Jones, P. A., Takai, D. Establishment of conditional vectors for hairpin siRNA knockdowns. Nucleic acids research. 31, e77 (2003).
- Wiznerowicz, M., Trono, D. Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference. Journal of. 77, 8957-8961 (2003).
- Brestovitsky, A., Sharf, R., Mittelman, K., Kleinberger, T. The adenovirus E4orf4 protein targets PP2A to the ACF chromatin-remodeling factor and induces cell death through regulation of SNF2h-containing complexes. Nucleic acids research. 39, 6414-6427 (2011).
- Livne, A., Shtrichman, R., Kleinberger, T. Caspase activation by adenovirus E4orf4 protein is cell line-specific and is mediated by the death receptor pathway. J. Virol. 75, 789-798 (2001).
- Shtrichman, R., Kleinberger, T. Adenovirus type 5 E4 open reading frame 4 protein induces apoptosis in transformed cells. J. Virol. 72, 2975-2982 (1998).
- Shtrichman, R., Sharf, R., Kleinberger, T. Adenovirus E4orf4 protein interacts with both Ba and B' subunits of protein phosphatase 2A, but E4orf4-induced apoptosis is mediated only by the interaction with Ba. Oncogene. 19, 3757-3765 (2000).
- Galluzzi, L. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell death and differentiation. 16, 1093-1107 (2009).
- Lavoie, J. N., Nguyen, M., Marcellus, R. C., Branton, P. E., Shore, G. C. E4orf4, a novel adenovirus death factor that induces p53-independent apoptosis by a pathway that is not inhibited by zVAD-fmk. J. Cell Biol. 140, 637-645 (1998).
- Li, S. The adenovirus E4orf4 protein induces growth arrest and mitotic catastrophe in H1299 human lung carcinoma cells. Oncogene. 28, 390-400 (2009).
- Lavoie, J. N., Champagne, C., Gingras, M. -C., Robert, A. Adenovirus E4 open reading frame 4-induced apoptosis involves dysregulation of Src family kinases. J. Cell Biol. 150, 1037-1055 (2000).
