Summary
Contribución del factor de remodelación de la cromatina ACF a la muerte celular inducida por E4orf4 se midió. El protocolo incluye la selección de clones de células en las que el tratamiento con doxiciclina induce desmontables condicional de la ACF subunidades Acf1 y SNF2h, y el uso del ensayo de DAPI para medir E4orf4 inducida por la muerte celular en las líneas celulares inducibles.
Abstract
Inactivación funcional de la expresión génica en células de mamífero es crucial para el estudio de la contribución de una proteína de interés a 1,2 diversas vías. Sin embargo, desmontables condicional de la expresión génica se requiere en los casos cuando desmontables constitutiva no es tolerado por las células durante un largo periodo de tiempo 3-5. Aquí se describe un protocolo para la preparación de líneas celulares que permiten desmontables condicional de subunidades del factor de remodelación de la cromatina ACF. Estas líneas celulares de facilitar la determinación de la contribución de la ACF para la inducción de muerte celular por el adenovirus E4orf4 proteína 6. Las secuencias que codifican los ARN de horquilla corta para las subunidades Acf1 y SNF2h del factor de remodelación de la cromatina ACF se clonaron al lado de un promotor inducible por doxiciclina en un plásmido también contiene un gen para el gen de resistencia a neomicina. Resistentes a la neomicina se seleccionaron clones de células en presencia de G418 y aislado. Las líneas celulares resultantes fueron inducidos porel tratamiento con doxiciclina, y una vez Acf1 o los niveles de expresión reducida SNF2h fueron, las células fueron transfectadas con un plásmido que codifica E4orf4 o un vector vacío. Para confirmar el efecto específico de las construcciones shRNA, los niveles de Acf1 o SNF2h proteínas se restauraron a niveles de tipo silvestre por cotransfección con un plásmido que expresa Acf1 o SNF2h que se volvieron resistentes a la shRNA por introducción de mutaciones silenciosas. La capacidad de E4orf4 para inducir la muerte celular en las diferentes muestras se determinó por un ensayo de DAPI, en los que se midió la frecuencia de aparición de núcleos con morfologías apoptóticas en la población de células transfectadas 7-9.
El protocolo aquí descrito puede ser utilizado para la determinación de la contribución funcional de proteínas diferentes a la inducción de muerte celular por los socios de sus proteínas en los casos en que puede ser desmontables constitutiva celular letal.
Protocol
1. Generación de líneas celulares inducibles
- Antes del experimento se necesita para encontrar la concentración mínima del fármaco G418 que mata todas las células utilizadas para la preparación de las líneas celulares deseados. Para este propósito, la placa de las células de elección en varios duplicados de placas a 70% de confluencia en el medio que se utilizará durante el experimento y añadir concentraciones crecientes de G418 (0-1.000 g por ml). Monitorear las células diariamente para determinar la concentración mínima G418 que mata a las células de manera eficiente. La muerte celular se observa dentro de 3-7 días.
- Antes de la generación de líneas celulares, se recomienda verificar por ensayos de transfección transitoria que el plásmido que expresa el shRNA puede reducir en cierta medida la expresión del gen bajo estudio. Esto se puede hacer en cualquier línea celular que pueden ser eficientemente transfectadas.
- Placa T-REx-293 células a una densidad de alrededor de 5x10 6 células por placa de 10 cm en 8 ml de medio DMEM (que contiene 10% Tet symadre aprobadas FBS, 2 mM de L-glutamina, 100 unidades por ml de penicilina y 0,1 mg de estreptomicina por ml, 5 mg por ml blasticidin). Se incuban las placas durante la noche a 37 º C, 5% de CO 2.
- Al día siguiente, cambiar el medio a medio fresco 8 ml antes de la transfección.
- Transfectar las células utilizando 10 g de pSuperior.neo + GFP plásmido Acf1 (Figura 1) que codifica o shRNA SNF2h dirigido por un promotor inducible por tetraciclina H1, así como el gen de resistencia a neomicina fusionado a GFP y conducido por un promotor PGK constitutiva. Añadir el ADN a 500 l de 150 mM de NaCl. Añadir el reactivo jetPIE a otra alícuota de 500 l de 150 mM de NaCl a 2 l por g de ADN. Añadir la solución jetPIE al ADN y mezclar adecuadamente por agitación. Incubar durante 15 min a temperatura ambiente. Pipetear suavemente complejos de ADN en las placas de 10 cm que contienen 70-80% de células confluentes. Devolver las placas a la incubadora.
- Al día siguiente, sustituir el medio con un medio selectivo (medio DMEM como sedescrito anteriormente que contiene un adicional de 500 g por ml de G418).
- Para las dos semanas siguientes supervisar las células y reemplazar el medio selectivo con un medio fresco cada día similares 3-4 hasta que aparecen colonias y se pueden visualizar con un microscopio.
- Previo al aislamiento de colonias, preparar 24-pocillos con medio selectivo.
- Identificar colonias por ojo, y marque su ubicación en la parte inferior de la placa usando un marcador de color. Verificar al microscopio que las colonias estén bien separados.
- En la campana estéril, aspirar el medio de la placa, enjuagar suavemente con PBS caliente y aspirar así todo el líquido restante. Añadir 3 l de 0,25% de tripsina / EDTA a una colonia en la placa. Pipetear la tripsina varias veces hasta que las células se separen y añadirlos a uno de los pocillos de la placa de 24 pocillos. Repita esto para varias otras colonias en la placa.
- Cultivar las células a 37 º C, 5% de CO 2 hasta que llenan el pozo. A continuación, dividir las células derivadas decada una de las colonias originales en tres pozos, cada uno en una separada 12-pocillos, y se incuban durante la noche.
- Al día siguiente, reemplazar el medio en una placa con medio que contiene 1 mg por ml de doxiciclina a partir de una solución madre preparada en agua destilada dos veces (1-5 mg por ml). Sustituir el medio en una placa de control con medio sin doxiciclina. Incuban las células durante 72 horas a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Células de una cosecha tratada y no tratada un pocillo de cada clon de células para la preparación de extractos de proteína y análisis de transferencia Western para determinar la eficiencia de Acf1 o desmontables SNF2h. Utilizar anticuerpos frente a Acf1 o SNF2h así como anticuerpos frente a alfa-tubulina, que sirve como control de carga. Usar las células en la tercera así, no se trata, para la expansión de clones de células seleccionados en los que además de doxiciclina condujeron a la reducción de al menos 50% en el nivel de la proteína en estudio. Congelar alícuotas de estas células en FBS al 90%, DMSO al 10% para su uso posterior.
- Células de la placa en el medio selectivo en placas de 10 cm. Añadir doxiciclina a 1 g por ml de medio de las placas y se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 48-72 horas (ver Figura 4).
- Después de 48-72 hr, Tripsinizar las células de cada grupo de células, contarlos, y la placa de 1.5x10 6 células por placa de 6 cm en el mismo medio, con o sin doxiciclina. Se incuban las células a 37 º C, 5% de CO 2 durante la noche. Plan de manera que cada grupo de placas de sección 2,1 proporcionará las células durante doce placas de 6 cm, incluyendo dos duplicados para el ensayo de DAPI para cada punto, así como una placa para el análisis de transferencia Western de cada muestra (ver figura 4).
- En el día siguiente transfectar las células en placas de 6 cm con las siguientes combinaciones de plásmidos: 1 g de un plásmido vacío o una cantidad idéntica de la plásmido que codifica E4orf4, junto con 4 g de un vectorexpresando Acf1-GFP o GFP-SNF2h hacerse resistentes a la shRNA en los clones de células por introducción de mutaciones silenciosas, o 3 g de la correspondiente vector vacío y 1 g de plásmido que expresa GFP (Figura 4). Usar el reactivo jetPIE como se describió anteriormente (10 l por g de ADN 5) para preparar la mezcla de transfección. Para cada muestra, preparar una mezcla de transfección de tres placas.
- Tras una incubación de 15 min de ADN con el reactivo jetPIE a temperatura ambiente, pipetear suavemente cantidades iguales de complejos de ADN a partir de cada mezcla de transfección sobre tres placas de 6 cm y se incuban a 37 ° C, 5% de CO 2 durante la noche.
3. Ensayo de DAPI en las células transfectadas
- El día siguiente, extraer las proteínas de una placa por muestra para análisis de transferencia Western para determinar que Acf1 o SNF2h se han derribado y eficiente que E4orf4 se expresó igualmente en las diferentes muestras.
- Aspirar el medio de las placas destinados a la DAPIensayo, se lavan las placas suavemente con PBS y añadir 1 ml de paraformaldehído al 4% en PBS preparado para cubrir las células. Preparación de la solución de paraformaldehído y el tratamiento de las células con esta sustancia química se lleva a cabo en una campana química. Incubar durante 15 min a temperatura ambiente sin agitación.
- Aspirar el paraformaldehído y lavar tres veces con PBS, balanceo a temperatura ambiente durante 5 min cada vez. Añadir 80% de etanol se mantuvo a -20 ° C y se incuba a -20 ° C durante al menos 1 h. Las placas se pueden mantener bajo etanol a -20 ° C durante varios días mientras se sellan bien para evitar la evaporación de etanol y secado.
- Aspirar el etanol y lavar las células dos veces con PBS y una vez con PBS-BT (PBS que contiene 0,5% de BSA y 0,05% de Tween-20), mecedora a temperatura ambiente durante 5 min cada vez.
- Para evitar la unión no específica de anticuerpos, bloquear las células en 1 ml de PBS-BT tampón que contiene 10% de suero de cabra durante 20 min mientras balanceo a temperatura ambiente. A continuación, lavar tél las células dos veces en PBS-BT, a 5 minutos cada lavado.
- Se incuban las células con el anticuerpo primario (un anticuerpo específico de E4orf4 en nuestro caso) en 1 ml de PBS-BT durante 1 hora mientras balanceo a temperatura ambiente. A continuación, lavar dos veces en PBS-BT y una vez en PBS que contenía 0,1% de BSA, 5 min cada lavado.
- Se incuban las células en 1 ml de BSA PBS-0,1% que contiene el apropiado anticuerpo secundario marcado fluorescentemente y 0,5 g por ml de concentración final de DAPI durante 40 min mientras balanceo a temperatura ambiente en la oscuridad. Entonces lavar con PBS durante 5 min, secar bien por aspiración y mantener las placas boca abajo durante una hora adicional a toda la noche para conseguir un secado completo. A continuación, montar cubierta se desliza en las células, usando Fluoromount G-solución. Se mantienen las placas a 4 º C en la oscuridad hasta que esté listo para contar los núcleos apoptóticos.
- Pídale a un colega para identificar las diversas placas con números nuevos, por lo que contando núcleos apoptóticos en las diferentes muestras se puede hacer de una manera imparcial.
- Visualice las células bajo una umicroscopio fluorescente pright a una magnificación de 400X (en el aire) o 630x (en aceite de inmersión). Identificar las células transfectadas que están teñidas para las diversas proteínas expresadas en cada muestra, y contar el número de núcleos condensados o fragmentados visualizado por tinción con DAPI dentro de la población de células transfectadas. Supervisar varios campos y contar con un total de al menos 200 células transfectadas.
- Calcular el porcentaje de núcleos con morfología apoptótica dentro de la población de células transfectadas. Repetir el experimento, con duplicados, 2-3 veces para calcular la significación estadística de los cambios entre las diferentes muestras.
4. Los resultados representativos
La eficacia de la obtención de colonias en las que desmontables condicional de la expresión génica ha tenido éxito es variable, dependiendo del gen implicado. En nuestras manos, se obtuvieron 7 colonias de éxito de 12 pruebas de Acf1 y 6 de cada 18 para SNF2h. Figura 2 shDebe A una placa representativa de clones de células seleccionadas (Figura 2A) así como de una única colonia (Figura 2B). Figura 3 muestra una transferencia de representante preparado con proteínas extraídas de células de diversos clones cultivados en la presencia o ausencia de doxiciclina durante 72 hr. La transferencia se tiñeron con anticuerpos frente a SNF2h y para alfa-tubulina, que sirve como control de carga. Dos de los clones (número 4 y 5) mostraron una fuerte reducción en los niveles de SNF2h a la inducción doxiciclina. Cabe señalar que, aunque el pSuperior.neo + plásmido GFP (Figura 1) usado para la generación de las líneas celulares codifica una proteína de fusión neo-GFP, la fluorescencia verde en las líneas celulares estables fue muy baja y la expresión de otras proteínas de fusión GFP introducido transitoriamente en estas células podría ser fácilmente detectados por encima de la fluorescencia verde de fondo.
Una representación esquemática de los experimentos llevados a cabo en los clones de células para medirAsegúrese de que el efecto de Acf1 o desmontables SNF2h sobre la muerte celular inducida por E4orf4 se muestra en la figura. 4. El tiempo necesario para la caída de la expresión génica mediante el tratamiento con doxiciclina puede variar dependiendo de la estabilidad de la proteína cuyos niveles se debe reducir. Para Acf1 y SNF2h, un 72 horas de tratamiento se requiere para knockdown eficiente a nivel de proteínas.
La Figura 5 muestra un ejemplo de células que expresan E4orf4 y GFP y experimentando la muerte celular manifiesta por la aparición de núcleos teñidos con DAPI con una morfología condensada o fragmentada. Figura 6 muestra los resultados de un experimento representativo que demuestra que la doxiciclina inducida Acf1 desmontables llevado a una aumentar en E4orf4 estimulada por la muerte celular (Figura 6A). Este aumento no fue resultado de un aumento en los niveles de E4orf4 (Figura 6B). Además, la restauración de Acf1 a las células doxiciclina inducida disminuye el aumento de E4orf4 toxicidad a los niveles observada en las células no inducidas (Figura 6).
Figura 1. Mapa de la pSuperior.neo + plásmido GFP. El mapa muestra el promotor inducible por tetraciclina H1 conducción shRNA expresión y la expresión del promotor PGK conducción de una proteína de fusión neo-GFP. El mapa es una adaptación del manual de Oligoengine pSuperior.
Figura 2. Imágenes de identificación de las colonias resistentes a la neomicina. De una placa que contiene colonias (A) y de una única colonia (B) son mostrados. Las colonias se obtuvieron por cultivo de las células durante 14 días en un medio selectivo que contiene neomicina.
Figura 3. Las células examen de la eficiencia caída en las colonias seleccionadas. De varias colonias seleccionadas en presencia de neomicina se cultivaron en pocillos duplicados. Un pocillo de cada muestra fue inducida por doxiciclina (+) y uno bien se dejaron sin tratar (-). Las proteínas se extrajeron 72 horas después de la inducción y se cromatografió en SDS-PAGE. El Western blot se tiñeron sucesivamente con anticuerpos frente a SNF2h y para alfa-tubulina (que sirve como control de carga) y muestra los niveles de SNF2h en células inducidas y de control.
Figura 4. Planificación de un típico experimento desmontables-DAPI ensayo. Sucesivos pasos del experimento se muestran, incluyendo el tratamiento con doxiciclina para lograr Acf1 o desmontables SNF2h, una transfección para restaurar Acf1 o SNF2h expresión o para introducir un énfasisTy vector e introducir E4orf4 o su vector vacío correspondiente en las células, y el análisis de los resultados. Doxycycline placas tratadas se muestran en rojo (Dox) y las placas de control están marcados en azul. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 5. Células de detección de la muerte celular inducida por E4orf4 por el ensayo de DAPI. Que se sometieron a los diversos tratamientos descritos en la Figura 4 se fijaron y tiñeron con anticuerpos específicos de E4orf4 y DAPI para visualizar los núcleos de las células transfectadas. Esta imagen específica fue tomada de una muestra que contiene E4orf4 y la proteína de control GFP. (A) GFP. (B) E4orf4. (C) DAPI. (D) las imágenes fusionadas. Las flechas blancas marca de las buenas prácticas agrarias y E4orf4 transfectadas las células que contienen núcleos con morfologías apoptóticas. Las flechas rojasmarcar los núcleos con formas irregulares que no se cuentan como núcleos apoptóticos. Los asteriscos marca núcleos mitótico o núcleos que acaba dividida.
Figura 6. Acf1 desmontables mejora E4orf4 la muerte celular inducida. (A) Las células de la línea celular T-REx-293-derivada expresando Acf1-shRNA partir de un promotor inducible por tetraciclina fueron inducidas con doxiciclina (+ DOX) o se deja sin tratar (Dox-). Tres días más tarde, las células fueron transfectadas con plásmidos que expresan E4orf4 (+ E4orf4) o un vector vacío (-E4orf4) junto con un vector vacío o un plásmido que expresa GFP-etiquetados Acf1, que se hizo resistente a la shRNA por la introducción de silencio mutaciones. Las células se fijaron veinticuatro horas después de la transfección y se tiñeron con anticuerpos para E4orf4 y con DAPI. La inducción de la muerte celular se midió por el ensayo de DAPI se ha descrito anteriormente y el porcentaje of células transfectadas con núcleos condensados o fragmentados se determinó. Un experimento representativo con tres repeticiones se muestra, y las barras de error representan la desviación estándar. (B) Las células de placas paralelas se recogieron para análisis de transferencia Western. La transferencia se tiñeron con anticuerpos frente a E4orf4, GFP, y Acf1. El endógena Acf1 y Acf1 GFP-se muestran en dos paneles separados.
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Discussion
Desmontables de la expresión génica específica es un enfoque importante para la investigación de la contribución de una proteína a las vías de regulación. Desde desmontables constitutivo de expresión de genes esenciales afecta negativamente la proliferación celular, su estudio puede requerir ya sea introducción transitoria de siRNAs o la aplicación de sistemas estables desmontables condicionales. Generación de líneas celulares estables con capacidad de expresión inducida por el fármaco de shRNAs descritos aquí, proporciona una ventaja sobre las transfecciones transitorias que pueden no ser eficiente en muchas líneas celulares, y de corta duración sobre el uso de virus que requieren una preparación repetida y, a veces un adicional Selección plazo. Las líneas de células, una vez generada, no requieren preparación adicional. Además, en nuestras manos, transfecciones transitorias de constructos shRNA fueron mucho menos eficiente en derribar expresión génica en comparación con la inducción de la expresión de shRNA en las líneas celulares seleccionadas. Es recomiendanSin embargo ed examinar en cada experimento que la caída inducida por drogas se mantuvo eficiente. Una desventaja potencial de la utilización de líneas celulares estables para knockdown condicional de la expresión génica es que puede haber adquirido cambios adicionales durante el proceso de selección que potencialmente podrían afectar el resultado de los experimentos. Sin embargo, para superar este problema, se puede llevar a cabo el experimento en dos líneas celulares paralelas o revertir el efecto caída por introducción de un plásmido que expresa una proteína shRNA resistente WT. Si la proteína WT elimina el efecto de la shRNA, entonces un efecto clonal se puede descartar.
Clásica, caspasa-dependiente de la apoptosis, se puede ensayar por numerosos métodos, incluyendo la detección de la activación de caspasas, la tinción de anexina-V, la tinción de túnel, la detección de una población de células sub-G1 por FACS, etc 10. Sin embargo, E4orf4 induce una no clásica, caspasa-independiente de la muerte celular en muchas líneas celulares y varios métodospara la detección de la apoptosis no son aplicables para la detección de este modo único de la muerte celular 6,7,11,12. Se ha demostrado previamente que las morfologías más típicos asociados con la muerte celular inducida por E4orf4 incluyen formación de ampollas en la membrana, condensación nuclear o fragmentación y desprendimiento de células 13. Por lo tanto, suelen medir E4orf4 inducida por la muerte celular mediante el ensayo de condensación nuclear y la fragmentación, o pérdida de células.
Cuando se utiliza el ensayo de DAPI, se debe prestar especial atención a los siguientes puntos: 1) Para mantener la objetividad óptimo de la prueba, es muy recomendable que el ensayo se llevará a cabo en un "ciegas" para que la persona que cuenta el número de células que contienen los núcleos con morfologías apoptóticas no será consciente de la identidad de la muestra. 2) Se recomienda mantener criterios estrictos para identificar nucleares morfologías apoptóticas que no se deben confundir con los núcleos mitótico o núcleos con UNEVbaño morfologías (ver Figura 5). Otros ensayos de muerte celular también se puede emplear como una lectura de salida del experimento, tal como los ensayos clonogénicos de supervivencia celular 8.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado (en parte) por la Israel Science Foundation (Grant 399/11), por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) en el marco de la cooperación germano-israelí Proyecto (DIP), y por el Instituto de la Familia Rappaport de Investigación en las Ciencias Médicas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High glucose DMEM | Gibco | 41965 | |
| Tet system approved FBS | Clontech | 631106 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | |
| T-REx-293 cells | Invitrogen | R710-07 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| blasticidin | Invitrogen | R210-01 | |
| pSuperior.neo+GFP plasmid | OligoEngine | VEC-PBS-0007/0008 | |
| jetPIE | Polyplus transfection | 101-40 | |
| doxycycline | Sigma | D9891 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 |
References
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