Summary
نحن تصف إعداد شرائح رقيقة من الشبكية المائية نمر السلمندر (
Abstract
واحدة من المهام المركزية في علم الأعصاب الشبكية هو فهم الدوائر من الخلايا العصبية للشبكية، وكيف تلك الاتصالات هي المسؤولة عن تشكيل الاشارات المرسلة الى المخ. تم الكشف عن الفوتونات في شبكية العين بواسطة قضيب ومخروط خلايا مستقبلة للضوء، التي تحول تلك الطاقة إلى إشارة كهربائية، نقلها إلى الخلايا العصبية للشبكية أخرى، حيث تتم معالجتها وإرسالها إلى الأهداف المركزية في المخ عبر العصب البصري. جاء في وقت مبكر رؤى هامة في الدوائر الشبكية وتجهيز مرئي من الدراسات النسيجية من 1،2 كاجال و، في وقت لاحق، من التسجيلات الكهربية من النشاط ارتفاعه من خلايا الشبكية العقدة - خلايا شبكية العين الناتج من 3،4.
فهم مفصل من المعالجة البصرية في شبكية العين يتطلب فهم الإشارات في كل خطوة في مسار من مبصرة إلى الخلايا العقدية للشبكية. ومع ذلك، العديد من أنواع الخلايا في شبكية العين هي برالعبوات الناسفة عميق في الأنسجة وبالتالي لا يمكن الوصول إليها نسبيا لتسجيل الكهربية. هذا القيد يمكن التغلب عليها من خلال العمل مع شرائح عمودية، في الخلايا التي المقيمين داخل كل طبقة من طبقات شبكية العين هي واضحة للعيان ويمكن الوصول إليها لتسجيل الكهربية.
هنا، نحن تصف طريقة لصنع المقاطع الرأسية من شبكية العين من اليرقات نمر السلمندر (Ambystoma tigrinum). في حين تم تطوير هذا المستحضر في الأصل للتسجيلات مع microelectrodes حادة 5،6، ونحن تصف طريقة لثنائي كامل الخلية التسجيلات المشبك الجهد من خلايا مستقبلة للضوء والخلايا الأفقية وثنائي القطب من الدرجة الثانية التي نعمل التلاعب المحتملة غشاء مبصرة في حين تم تسجيل في وقت واحد بعد ردود متشابك في الخلايا الأفقية أو ثنائي القطب. مبصرات من نمور التاميل السمندل هي أكبر بكثير من تلك الأنواع من الثدييات، مما يجعل هذا الإعداد المثالي ليتخذوا فيه تينهجه التجريبية تحديا تقنيا. ويرد وصف هذه التجارب مع العين في اتجاه يحقق في خصائص اشارة من الشريط متشابك - هيكل متشابك المتخصصة وجدت في عدد قليل فقط من الخلايا العصبية، بما في ذلك قضيب ومخروط مبصرات، التي هي مناسبة تماما للحفاظ على نسبة عالية من منشط الافراج عن العصبي 7 ، 8 - وكيف أنه يساهم في خصائص اشارة فريدة من نوعها من هذا أولا المشبك الشبكية.
Protocol
1. إعداد شرائح الشبكية
- غرفة تجميع (تصميم موضح في الشكل 1). مكان اثنين حبات من الشحوم فراغ، متباعدة ~ 8-10 ملم وبصرف النظر، عبر غرفة تسجيل لتشكيل قناة لsuperfusate والتي لتضمين شرائح الشبكية. إضافة ثانية حبة من الشحوم بضعة ملليمترات أبعد ما وراء كل من هذه الخرز اثنين من الشحوم ليكون بمثابة السدود والحد من امتداد. ضع قطعة صغيرة من الثلاثي KimWipe في نهاية القاعة للتأكد من ملامسة السائل مع الإلكترود المرجعي.
- اضغط قطعة من غشاء النيتروسليلوز (~ 5 × 10 مم؛ 0.8 مسام ميكرون) شقة ضد شريحة المجهر والزجاج إلى قسمين حبات صغيرة من الشحوم فراغ. تجنب وضع الشحوم مباشرة تحت مركز للغشاء النيتروسليلوز، وهذا يمكن منع شبكية العين من الانضمام.
- لإعداد تقطيع الأنسجة، وكسر مزدوج حافة شفرة الحلاقة إلى 4 قطع ونعلق واحد إلى الذراع تشريح. قطع شريحة رقيقة من nitrocellulبيئة نظام التشغيل غشاء لضمان أن طليعة من شفرة الحلاقة وضع مستو ضد غرفة تسجيل، وبالتالي خفض نظيفة من خلال غشاء النيتروسليلوز.
- الحفاظ على كوب صغير من البرمائيات محلول ملحي (الجدول 1) على الجليد في محطة تشريح.
- الموت ببطء السمندل بواسطة قطع الرأس. Hemisect رئيس sagitally وباب عن طريق الحبل الشوكي. مبلل مكان نصف من الرأس على قطعة من القطن بالمحلول الملحي البرمائيات فوق كتلة مشمع. النصف الآخر من الرأس يمكن أن تكون ملفوفة مع منشفة ورقية رطبة وتخزينها في 4 درجات مئوية لاستخدامها في وقت لاحق اليوم.
- استأصل العين. باستخدام Vannas مقص صغير، قطع الجلد الذي يربط بين العين إلى المدار المحيطة بها. بعد تحرير الجزء الأمامي من العين من الأنسجة المحيطة المدارية، وسحب العين إلى الأمام ومرر مقص تحت العين لقطع طريق عضلات العين والعصب البصري، وتحرير العين من المدار.
- وضع العين منزوعة النواة على سرير من القطن علىمشمع كتلة. تجاهل نصف الرأس. تقليم الدهون الزائدة المدارية من الجزء الخلفي من العين.
- إجراء شق صغير في وسط القرنية مع شفرة جراحية حادة. إزالة القرنية عن طريق تحريك Vannas غرامة مقص في شق وتوسيع نطاق خفض شعاعيا من نحو مشرشر ORA. قطع محيطي حول مشرشر ORA عن طريق تناوب كتلة مشمع أو القطن بين التخفيضات.
- بعد قطع كل الطريق حول العين، وإزالة القرنية والعدسة عن طريق سحبهم من جانب فنجان العين. نقل فنجان العين الناتجة على سطح صلب من كتلة مشمع مبلل بمحلول ملحي البرمائيات. قطع عليه في ثلثي بشفرة حلاقة حادة، وذلك باستخدام حركة النشر غرامة لضمان أن كنت قد قطعت كل الطريق من خلال الصلبة.
- مكان واحد أو قطعتين من فنجان العين على غشاء النيتروسليلوز مع سطح الشبكية أسفل. غمر القطع المتبقية مع المياه المالحة إضافية ووضعها في الثلاجة في ~ 4 درجات مئوية.
- شركة جنرال الكتريكاضغط ntly قطعة من فنجان العين ضد غشاء النيتروسليلوز مع ملقط غرامة. غمر غشاء النيتروسليلوز وقطعة فنجان العين مع عدة قطرات من المياه المالحة الباردة البرمائيات وصمة عار على حواف مع KimWipe لمساعدة شبكية العين على الانضمام. مرة أخرى، يغرق في فنجان العين وغشاء النيتروسليلوز مع عدة قطرات من محلول ملحي بارد البرمائيات وقشر بعيدا الصلبة / المشيمية / الشبكية الظهارة الصبغية الشبكية لعزل (والتي يمكن أن تظهر وردي بسبب وجود رودوبسين غير مقصور). إذا لزم الأمر، وقطع العصب البصري لتحرير شبكية العين.
- إذا لم تلتزم شبكية العين بإحكام، تستنزف المياه المالحة مع KimWipe لسحب شبكية العين أكثر بحزم أسفل على غشاء النيتروسليلوز. استبدال المالحة. أكرر، إذا لزم الأمر.
- ملء الغرفة مع البرد البرمائيات المالحة وتحويلها إلى مرحلة تقطيع الأنسجة. شريحة شبكية العين وغشاء النيتروسليلوز إلى شرائح رقيقة، والعمل من واحدة من نهاية إلى أخرى من خلال تحويل ميكرومتر رنيهفي 125 ميكرون الزيادات. اضغط على شفرة الحلاقة بلطف ولكن بحزم من خلال شبكية العين وغشاء النيتروسليلوز.
- نقل الشرائح الشبكية عن طريق تحريك شرائح من غشاء النيتروسليلوز إلى القناة الرئيسية للغرفة تسجيل. رفع شريط من غشاء الحرة ومن ثم الاحتفاظ بها في المكان في حين نقل غرفة تحتها، ويجري التأكد من الحفاظ على شرائح المغمورة. تضمين حواف الغشاء نتروسليلوز في شرائط من الشحوم فراغ، تناوب عليها 90 درجة لعرض طبقات الشبكية.
- اضغط على شقة غشاء النيتروسليلوز ضد سطح الزجاج. حتى إذا لم يكن هناك شبكية العين على كل قطعة، مكان شرائح من غشاء النيتروسليلوز على فترات منتظمة (~ 1 ملم بعيدا) على طول على طول القناة نضح للمساعدة في تفريق التوتر السطحي، وتحسين تدفق السوائل.
2. إقران تسجيلات خلية كاملة
- بعد كل الشرائح وقد تم نقل، نقل غرفة تسجيل لمرحلة تستقيم، الثابتةالمجهر مرحلة وإرفاق إشارة الرصاص القطب. التركيز على شرائح باستخدام مسافة طويلة في العمل، الغمر بالماء، 40-60X الهدف. يجب وضع المجهر على طاولة الهواء لتخفيف الاهتزازات والمغلقة في قفص فاراداي للحد من التدخل الكهربائية.
- Superfuse شرائح مستمر بمعدل 1 مل / دقيقة مع محلول ملحي البرمائيات فقاعات مع 100٪ O 2. ربط شفط، والتأكد من أن تدفق وتدفق ومتوازن. تدفق يمكن أن ينظم عن طريق تناوب نهاية مشطوف من الإبرة شفط أو عن طريق تحريك KimWipe في نهاية الحجرة أقرب أو أبعد من الإبرة تدفق. ويمكن أن تظل التحضير في درجة حرارة الغرفة أو تبريد مع جهاز بلتيير أو ببساطة عن طريق وضع وضع كيس من الثلج على المسرح المجهر.
- فحص شرائح تحت ضوء خافت أو الأشعة تحت الحمراء وتحديد زوج من الخلايا - وهي مبصرة (قضيب أو مخروط) وخلية أفقي أو ثنائي القطب قريب - إلى هدف لتسجيل كامل الخلية. يمكن أن تكون قضبان أناdentified من قبل أجسادهم خلية كبيرة وقضيب مثل قطاعات بارزة الخارجي (الشكل 2A). المخاريط هي أصغر من قضبان ولها قطاعات الخارجي مدبب صغير. خلية ثنائي القطب وSOMAS خلية الأفقية هي في الصف الأبعد من أجسام الخلايا في الطبقة النووية الداخلية (INL؛ أرقام 2B و 2C).
- قبل إعداد شرائح، واستخدام مجتذب ماصة لتصنيع بال micropipettes من الزجاج البورسليكات (1.2 مم القطر الخارجي، 0.95 مم القطر الداخلي مع خيوط الزجاج). غيض من كل micropipette ينبغي أن يكون ~ 1-2 ميكرون في القطر.
- باستخدام إبرة الحشوة غير المعدنية (مثل واحد مصنوعة من حقنة 1 سم مكعب أو MicroFil)، وملء الماصات مع الحل داخل الخلايا (الجدول 1) ونعلق على حامل قطب كهربائي.
- رفع الهدف المجهر قليلا. ضع ماصة مبصرة تحت الهدف ومن ثم خفضه بحيث غيض يتم وضع فقط فوق الشرائح. كرر مع خميسانه ماصة الثانية.
- ضبط أي تعويض في مستوى خط الأساس الحالية على مكبر للصوت. تحقق المقاومة ماصة مع بالسيارات 5-10 إزالة إستقطاب النبض. نحن عادة استخدام ماصات التي تتراوح بين 10-15 MΩ، نتيجة تفتق طويلة من رمح والأسمولية منخفضة من الحلول ماصة البرمائيات. مع حلول الثدييات الأسمولية العالي، هذه الماصات نفسه يحمل قيم المقاومة من ~ 8-12 MΩ. في حين أننا قد استخدمت بأقطار طرف أكبر مع قيم المقاومة من 3-4 MΩ في الحلول البرمائيات، ويقابل المزايا التي تقدمها انخفاض المقاومة وصول صعوبة أكبر في ختم على أغشية الخلايا والمتهدمة أكثر سرعة التيارات الكالسيوم وغيرها من رسول الثاني حساسة للاستجابات.
- أثناء تطبيق الضغط الايجابي طفيف، موقف ماصة بعد متشابك بحيث إنها تجري اتصالات مع خلايا الجسم الأفقي أو ثنائي القطب. ثم ضع ماصة قبل المشبكي بحيث إنها تجري اتصالات مع خلايا الجسم من قضيب أو مخروط مبصرة. تسجيلات APPEع أن تكون أكثر استقرارا عندما نصائح ماصة الاتصال الجزء الداخلي بدلا من سوما، خصوصا في المخاريط.
- في حين رصد المقاومة، والإفراج عن الضغط الايجابي على ماصة بعد متشابك. في بعض الأحيان، والإفراج عن الضغط الايجابي هو كاف لتشكيل ختم gigaohm. إن لم يكن، وتطبيق الشفط لطيف مع 1 مل حقنة أو عن طريق الفم. بعد نمت المقاومة تلميح ل> 100 MΩ، وتطبيق المحتمل عقد -60 بالسيارات. بعد الحصول على ختم gigaohm، فارغة من أي العابرين السعة ماصة وتكرار الإجراء الختم لمبصرة ماصة، وتطبيق المحتمل عقد -70 بالسيارات.
- تمزق التصحيح باستخدام فمك أو حقنة لتطبيق الشفط إلى كل خلية بدورها. سوف قضبان، والأقماع، وخلايا القطبين عادة تمزق مع الشفط لطيف. الحصول على تكوين خلية كاملة مع خلية الأفقي قد تتطلب أكبر الشفط (أي مع حقنة سم مكعب 3) في تركيبة مع نبضات الجهد سريع قوي تسليمها مع "ZAP" جمعةeature من مكبر للصوت المشبك التصحيح. سوف تمزق الغشاء وإنشاء تكوين خلية كاملة يكون واضحا من خلال ظهور العابرين السعة خلية كاملة.
- تأكيد هوية الخلية بعد متشابك من الناحية الفسيولوجية عن طريق تطبيق ومضة ضوء وتقديم سلسلة من الخطوات الجهد من -120 إلى +40 بالسيارات في 20 زيادات بالسيارات (الشكلان 3 و 4).
- لتقييم ما إذا كانت هناك علاقة بين زوج من الخلايا synaptically، وتقديم لمحة (25-100 ميللي ثانية)، 60 بالسيارات الاستقطاب خطوة إلى مبصرة (إلى -10 بالسيارات، بالقرب من ذروة L-نوع الكالسيوم الجهد بوابات الحالي) والبحث لتيارات ما بعد متشابك في الثانية الخلايا العصبية النظام (الشكل 5). خطوة إزالة إستقطاب قوي يجب استحضار سريع، عابر الداخل الحالي بعد متشابك في فترة ما بعد متشابك أفقي أو OFF خلية ثنائي القطب الناجمة عن موجة من إطلاق حويصلة من مخروط (الشكل 5).
Representative Results
وتظهر آثار ممثل الردود ضوء من الخلايا العصبية في شرائح عمودية من السمندل شبكية العين في الشكل 3. المخروط، خلية الأفقي، وOFF خلية ثنائي القطب كل عرض على الخارج الحالية استجابة لظهور ضوء. ويتسبب بارز نحو الداخل في الوقت الحالي بعد ومضة ضوء في التسجيلات الخلية الأفقي وثنائي القطب في زيادة الافراج عن الغلوتامات من مبصرات كما يزيل الاستقطاب في الضوء الإزاحة. وON خلية ثنائي القطب يستجيب مع تيار الداخل في بداية ضوء الناتجة عن الغلوتامات metabotropic تسجيل الدخول قلب مستقبلات الإشارات تتالي وتفعيل قنوات TRPM1 9. الخلايا الأفقية وخلايا القطبين يمكن تمييزها عن بعضها البعض من خلال العلاقات الرابع منها (الشكل 4). الخلايا الأفقية وعادة ما يكون خطي أو تصحيح باطنه الرابع وانخفاض مقاومة المدخلات (<500 MΩ؛ الشكل 4A) في حين أن الخلايا القطبين لديها مقاومة عالية المدخلات(0.5-2 GΩ) وظاهريا-تصحيح I - V (الشكل 4B) الشكل 5 يظهر نتائج ممثلة من التسجيلات من زوج خلية مخروطية الأفقي (الشكل 5A) ومخروط-OFF ثنائي القطب الزوج الخلية (الشكل 5B). في كل منهما، إزالة إستقطاب للمخروط إلى -10 بالسيارات من المحتمل عقد -70 بالسيارات أثار الكالسيوم الجهد بوابات الحالية في مخروط وEPSC إلى الداخل بسرعة في الخلية أفقيا أو ثنائي القطب. هذا حافزا قويا يكفي لتفريغ تجمع بسهولة، المنطلقة من ~ 20 الحويصلات من كل الشريط متشابك، مما أسفر عن EPSC من ~ 47 باسكال / الشريط 10. كان EPSC خلية الأفقي في الشكل 5A 232 السلطة الفلسطينية، مما يشير إلى أنها تلقت اتصالات الشريط 5 من مخروط قبل المشبكي. هذا يوحي تقدير مماثل من 178 باسكال EPSC في الخلية القطبين قبالة (الشكل 5B) أنها تلقت اتصالات الشريط 4 من مخروط قبل المشبكي.
| ماصة قبل المشبكي | ماصة بعد المشبكي | | |
| كلوريد الصوديوم | 116 ملي | 3.5 ملم | 3.5 ملم |
| بوكل | 2.5 ملم | ||
| و CaCl 2 | 1.8 ملي | 1 ملم | 1 ملم |
| MgCl 2 | 0.5 ملي | 1 ملم | 1 ملم |
| HEPES | 10 ملي | 10 ملي | 10 ملي |
| جلوكوز | 5 ملي | ||
| CS-الغلوتامات * | 40 ملم | ||
| CS-غلوكونات ** | 50 ملي | 90 ملم | |
| كلوريد رباعي إيثيل الأمونيوم | 10 ملي | 10 ملي | 9 ملم | 9 ملم |
| GTP | 0.5 ملي | 0.5 ملي | |
| EGTA | 5 ملي | 5 ملي | |
| درجة الحموضة *** | 7.8 | 7.2 | 7.2 |
| الأسمولية **** | 245 الميلي أسمول | 240 الميلي أسمول | 240 الميلي أسمول |
يرصد * CS-الغلوتامات من خلال تحييد 40 ملم حمض الجلوتاميك مع L-40 CsOH ملي في حل ماصة. * ويرصد A 1 M الأوراق المالية من CS-غلوكونات من خلال تحييد حل CsOH مع 45-50٪ حمض D-الغلوكونيك. *** يجب تعديل درجة الحموضة مع هيدروكسيد الصوديوم لحل خارج الخلية وCsOH لحلول ماصة. **** الحفاظ على الأسمولية من الحلول ماصة أدناه فقط أن من الحل خارج الخلية يمنع تورم الخلية ويعزز طول العمر للتسجيل.
جدول1. مكونات والمعلمات من أجل إيجاد حلول داخل وخارج الخلية القياسية المستخدمة في هذا البروتوكول.
الشكل 1. تسجيل تصميم غرفة. (AC) الأعلى، الجانب، ومناظر لقطة اعتراضية للغرفة تسجيل تظهر الأبعاد. ويتم تشكيله غرفة من قطعة سميكة 2 ملم من الاكريليك. (D) غرفة تجميعها. Superfusate يدخل غرفة من خلال 10 سم طول من تفلون أنابيب (أنابيب تدفق؛ نوع 24LW). تتم إزالة Superfusate من خلال تطبيق شفط خفيف إلى مشطوف قياس 20 أنبوب معدني في الجانب الآخر من الغرفة. المتاخمة لهذا الأنبوب الناتج هو حج / أجكل بيليه الإلكترود المرجعي. يتم توصيل الرصاص من هذا القطب إشارة إلى إشارة المدخلات من headstage. مثلث صغير من KimWipeوضعت فوق القطب إشارة إلى إبقائه على اتصال مع الحل وتنظيم تدفق الحل في أنبوب تدفق. يتم تشكيل قاعدة للغرفة عن طريق وضع شريحة المجهر والزجاج في حواف راحة للغرفة. يقام الشريحة في مكان مع حبة من الشحوم فراغ. هي جزء لا يتجزأ من شرائح غشاء النيتروسليلوز مع شرائح الشبكية في حبات من الشحوم فراغ التي تشكل قناة للحل لتدفق. قبل اتخاذ شرائح، يتم اضافته ل5 × 10 مم قطعة من غشاء النيتروسليلوز إلى غرفة مع اثنين من حبات صغيرة من الشحوم فراغ. يتم وضع قطعة من الجانب فنجان العين الزجاجية أسفل على هذا الغشاء نتروسليلوز ورفع بعيدا بمجرد أن تلتزم شبكية العين. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
الشكل 2. أزواج الخلية صبغ مليئة في هاءإعداد شريحة rtical. A) صور من قضيب أفقي والخلايا synaptically يقترن التي كانت مليئة المتناقضة الأصباغ الفلورية التي أدرجت عن طريق ماصة التصحيح خلال وقت واحد تسجيل كامل الخلية. أدرج وسيفر الأصفر (2 ملغ / مل) في حل ماصة قضيب (الصفراء) وsulfarhodamine B (1 ملغ / مل) أدرج في أفقي خلية حل ماصة (البنفسجية). تم القبض على الصور الفلورسنت باستخدام قرص الغزل المجهر متحد البؤر (بيركن إلمر Ultraview LCI) مجهزة بكاميرا CCD تبريد (أوركا ER) والتي شنت على المجهر مرحلة ثابتة (نيكون E600 FN مع 60X، 1.0 NA الهدف الغمر بالماء). تم مضافين هذه الصور على الصور مجال مشرق من شرائح الشبكية المقابلة باستخدام أدوبي فوتوشوب. B) الصور من مخروط وsynaptically يقترن OFF خلية ثنائي القطب. بين القطبين خلية محوار محطة ramifies في الأبعد (S1) sublamina من طبقة ضفيري الداخلية بالقرب من الحدود مع الطبقة النووية الداخلية. 
الشكل (3). التيارات المسجلة تحت المشبك الجهد من أربعة الخلايا العصبية للشبكية مختلفة ردا على مشرق 500 ميللي ثانية مضة من الضوء الأبيض ضوء أثار. ومخروط (A)، خلية الأفقي 
الشكل 4. الحالية ذات الجهد (IV) علاقات حالخلايا القطبين orizontal وخارجها. (A) لوحة الأعلى، والتيارات التي حركها غشاء سلسلة من 150 ميللي ثانية الخطوات الجهد من -120 إلى +40 بالسيارات تطبيقها في 20 زيادات بالسيارات (اللوحة السفلية) إلى خلية الأفقي. الخلايا الأفقية وعادة ما يكون مقاومة المدخلات المنخفضة والعلاقات الرابع خطي أو تصحيح باطنه. (B) علاقة الرابع من خلية ثنائي القطب قبالة ردا على سلسلة من الخطوات الجهد. الخلايا القطبين لديها أعلى المقاومة الإدخال والرابع تصحيح ظاهريا، ويرجع ذلك إلى تفعيل التيارات البوتاسيوم الجهد مسور. 
الشكل 5. أمثلة من تسجيل البيانات المقترنة. (A) تسجيل من مخروط الجهد بوابات الكالسيوم الحالي (المخروط أنا كا (المخروط V م). تم طرح التسرب والسعة العابرين باستخدام تسرب الطرح بروتوكول P / 8. A سريع مثير آخر متشابك الحالية (EPSC؛ HC PSC) تم تسجيلها في وقت واحد من خلية الأفقي، وتبين أن هذه الخلايا اثنين تقترن synaptically (B) وقد سجل EPSC في خلية ثنائي القطب قبالة ردا على نفس الحوافز في بلد آخر. مخروط.
Discussion
وقد ثبت إعداد شريحة الشبكية مفيدة جدا لتحليل الدوائر والآليات التي تستخدمها في شبكية العين لمعالجة المعلومات البصرية. كانت القدرة على الحصول على تسجيلات خلية كاملة في وقت واحد من الخلايا العصبية قبل وبعد متشابك مفيدة بشكل خاص في هذا المسعى. إقران تسجيلات خلية كاملة هي أسهل بكثير لتحقيق مع شرائح من شبكية العين مع الاستعدادات مسطحة جبل لأن يتعرض لها طبقات الشبكية المختلفة. وعلاوة على ذلك، لأن من الخلايا العصبية في شبكية العين الخاصة بهم كبيرة، السلمندر لها تاريخ طويل تمهيدا الشبكية، وبالتالي توفير نظام نموذجي خاصة تتميز جيدا.
مع الممارسة، وشرائح صحية من السمندل شبكية العين يمكن أن تكون مستعدة بشكل منتظم. ويمكن لبعض الخطوات الرئيسية يجعل الفرق بين النجاح والفشل. 1) تأكد من هي التي شنت على شفرة الحلاقة على تقطيع اللحم والأنسجة بحيث يضع شقة ضد سطح الزجاج وشرائح نظيفة على الرغم من كل الأنسجة وunderlyiنانوغرام غشاء النيتروسليلوز. إذا كنت قد قدمت خفض نظيفة من خلال غشاء النيتروسليلوز، يجب أن تسمع بنقرة وخافت مثل شفرة حلاقة الضربات سطح شريحة زجاجية. 2) تأكد من التزمت الشبكية إلى غشاء النيتروسليلوز. خلاف ذلك، يمكن أن شبكية العين تطفو بعيدا عن غشاء خلال أي مرحلة من مراحل الإجراءات. 3) لا تعرض قطع شرائح في الهواء، حيث سيؤدي ذلك إلى تلف العديد من الخلايا السطحية. 4) تأكد من أن شرائح وغشاء النيتروسليلوز شقة تقع ضد شريحة زجاجية بحيث طبقات الشبكية واضحة تحت المجهر تشريح. 5) تحقيق التوازن بين معدلات تدفق superfusate وتدفق من أجل تجنب تفيض غرفة تسجيل. هذا يمنع التغيرات المفاجئة في مستويات الحل، الذي يمكن أن يسبب حركات الأنسجة المفاجئ. 6) اختيار زوج صحية من الخلايا قريبة من بعضها البعض. الخلايا التي تحتوي السيتوبلازم على نحو سلس وأكثر صحة من الخلايا مع السيتوبلازم محبب. الخلايا أعمق في شريحة هم أكثر عرضة للاحتفاظ يخدع متشابك سليمةالكياسة. 7) تأكد من غيض ماصة لم يكسر أو نحى ضد الأنسجة الأخرى أو الحطام على طول الطريق وصولا إلى الخلايا. 8) للتحقق من مقاومة ماصة لضمان عدم انسداد مع الحطام أو فقاعة، وكلاهما يمكن أن تجعل من الصعب الحصول على تسجيل كامل الخلية الجودة.
بدلا من ربط شبكية العين على الورق مرشح النيتروسليلوز، تضمين بعض المحققين شبكية العين في كتلة من أجار واستخدام vibratome لخفض شرائح الشبكية. على الرغم من أننا لم يحاكم هذا النهج، كيم وآخرون. 11 مناقشة مزايا كلا النهجين. في تجربتهم، النهج القائم على أجار يوفر العائد أكثر اتساقا من شرائح مسطحة مع طبقات الشبكية-يرسم بشكل جيد ولكن النهج القائم على الورق مرشح ينتج خلايا مستقبلة للضوء أكثر صحة.
قضبان ومخاريط هي المسؤولة عن transducing الضوء إلى تغيرات في غشاء المحتملة. مع تسجيلات المقترنة، لا يمكن للغشاء المحتملة من قضبان أو الأقماع يكون manipulانبعاث العوادم مباشرة وبالتالي فإن القدرة على توليد استجابات ضوء، في حين مفيدة لتحديد أنواع الخلايا، قد لا تكون ضرورية. ولذلك فإننا كثيرا ما تعد شرائح في الضوء الأبيض. ومع ذلك، حتى عندما أعدت تحت إضاءة ساطعة، يمكن السمندل الخلايا العصبية للشبكية توليد استجابات ضوء كبيرة كما يتضح من الردود في الشكل. 3. ويرجع ذلك جزئيا إلى خزان كبير نسبيا من حامل اللون في حجم كبير الجزء الخارجي ولكنها قد تعكس أيضا قدرة الخلايا على تجديد مولر 11-CIS-الشبكية لالأقماع 12. للحصول على كامل الردود ضوء الظلام مكيفة، يمكن للمرء أن إعداد الشرائح تحت إضاءة الأشعة تحت الحمراء. لتشريح تحت ضوء الأشعة تحت الحمراء، ونحن نعلق GENIII صورة مكثفات (Nitemate NAV3، ليتون إندستريز، تمب، من الألف إلى الياء) لمن خلال oculars المجهر تشريح وإلقاء الضوء على الأنسجة مع مصباح يدوي LED الأشعة تحت الحمراء. لتقطيع وغيرها من الإجراءات التي لا تجري تحت مجهر تشريح، ونحن توظيف IMA رئيس محمولةGE تكثيف. لوضع ماصات التصحيح، ونحن تصور شرائح باستخدام كاميرا CCD حساس الأشعة تحت الحمراء (على سبيل المثال WATEC 502H، WATEC شركة، ميدلتاون، NY) لنصرة تستقيم، المجهر مرحلة ثابتة. مع هذه الاحتياطات، يمكن للمرء الحصول على ردود قضيب واظهار حساسية فوتون واحد 6 و 13.
واحد الحد من العمل في شرائح الشبكية هو أن العمليات الخلوية طويلة من الخلايا العصبية حقل كبير الشبكية قد تفقد العديد من التشعبات من خلال إجراء تشريح. ولذلك الاستعدادات شريحة الشبكية هي أكثر فائدة لدراسة علم وظائف الأعضاء من الخلايا فيه اتصالات متشابك تنطوي على عمليات بالقرب من خلايا الجسم. شبكية العين البرمائيات والثدييات تشترك في العديد من أنواع الخلايا نفسها، والاستفادة من آليات فسيولوجية مماثلة 14-16. بينما السمندل شبكية العين هو نموذج جيد لكثير من جوانب شبكية الثدييات، فارق واحد مهم ويبدو أن وجود مسار مخصص قضيب في الثدييات التي INVOالتلاميذ اتصالات من الخلايا المتخصصة قضيب القطبين على AII خلايا عديم الاستطالات 14. على قيد إضافي من شبكية العين السمندل هو عدد قليل من الأدوات الوراثية وضعت خصيصا لهذه الأنواع. ومع ذلك، والأجسام المضادة والكواشف shRNA التي تستهدف المناطق المحمية جيدا في الأنواع الأخرى يمكن أن تستخدم بنجاح في السمندل، كما يمكن العديد من مثبطات جزيء صغير والكواشف الببتيد. بالإضافة إلى ذلك، مع بضعة تعديلات في تقنية، يمكن إعداد شرائح الشبكية من الأنواع الأخرى التي بعض من هذه الأدوات هي أكثر توافرا.
وراء فائدتها لإقران تسجيل كامل الخلية، وإعداد شريحة الشبكية السمندل هو أيضا قابلة لمجموعة متنوعة من المناهج الأخرى. كما نوقش أعلاه، شرائح الشبكية يمكن استخدامها لدراسة الاستجابات ضوء في تركيبة مع مختلف البروتوكولات المشبك الجهد 17. ويمكن أيضا أن يتم تحميل الخلايا العصبية للشبكية مع الأصباغ الفلورية حساسة للكا 2 +، الكلورين -، أو نا+ قدم من خلال ماصة التصحيح أو بواسطة حمام تطبيق 15،18-20. ويمكن إدخال A الببتيد الفلورسنت التي تربط إلى الوشاح متشابك 21 من خلال ماصة التصحيح وتستخدم للتصوير الشريط أو 10، عندما مترافق إلى فلوريسئين، لحاد وإلحاق أضرار انتقائي الشريط 22. وقد استخدمنا أيضا شرائح الشبكية في تركيبة مع نقاط الكم لرصد تحركات قنوات الكالسيوم الفردية في قضيب ومخروط المحطات متشابك 23. وهكذا، فإن شريحة الشبكية العمودي هو إعداد التجريبية تنوعا لدراسة آليات متشابك الأساسية وظائف معالجة فريدة من نوعها أجريت في المشبك الأولى في مسار الإشارات البصرية.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل عن طريق البحث للوقاية من العمى والمعاهد الوطنية للصحة منح EY10542.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue slicer | Stoelting | 51425 | |
| Double edge razor blades | Ted Pella, Inc | 121-6 | |
| Nitrocellulose membranes | Millipore | AAWP02500 | Type AAWP 0.8 mm pore |
| Borosilicate glass pipettes | World Precision Instruments | TW120F-4 | 1.2mm OD 0.95 mm ID |
| Ag/AgCl pellet | Warner | E206 | |
| MicroFil | World Precision Instruments | MF34G-5 | 34 ga. Filling needle, 67 mm long |
References
- Thorpe, S. A., Glickstein, M. The Structure of the Retina. , Charles C Thomas. Springfield, IL USA. (1972).
- Piccolino, M. Cajal and the retina: a 100-year retrospective. Trends Neurosci. 11, 521-525 (1998).
- Hartline, H. K. The response of single optic nerve fibers of the vertebrate eye to illumination of the retina. Am. J. Physiol. 121, 400-415 (1938).
- Kuffler, S. W. Discharge patterns and functional organization of mammalian retina. J. Neurophysiol. 16, 37-68 (1953).
- Werblin, F. S. Transmission along and between rods in the riger salamander retina. J. Physiol. 280, 449-470 (1978).
- Wu, S. M. Synaptic connections between neurons in living slices of the larval tiger salamander retina. J. Neurosci. Meth. 20, 139-149 (1987).
- Heidelberger, R., Thoreson, W. B., Witkovsky, P. Synaptic transmission at retinal ribbon synapses. Prog. Retin. Eye Res. 24, 682-720 (2005).
- Schmitz, F. The making of synaptic ribbons: how they are built and what they do. Neuroscientist. 15, 611-624 (2009).
- Morgans, C. W., Brown, R. L., Duvoisin, R. M. TRPM1: the endpoint of the mGluR6 signal transduction cascade in retinal ON-bipolar cells. Bioessays. 32, 609-614 (2010).
- Bartoletti, T. M., Babai, N., Thoreson, W. B. Vesicle pool size at the salamander cone ribbon synapse. J. Neurophysiol. 103, 419-423 (2010).
- Kim, M. H., Vickers, E., von Gersdorff, H. Patch-clamp capacitance measurements and Ca2+ imaging at single nerve terminals in retinal slices. J. Vis. Exp. (59), e3345 (2012).
- Wang, J. S., Estevez, M. E., Cornwall, M. C., Kefalov, V. J. Intra-retinal visual cycle required for rapid and complete cone dark adaptation. Nat. Neurosci. 12, 295-302 (2009).
- Thoreson, W. B., Tranchina, D., Witkovsky, P. Kinetics of synaptic transfer from rods and cones to horizontal cells in the salamander retina. Neuroscience. 122, 785-798 (2003).
- Wu, S. M. Synaptic organization of the vertebrate retina: general principles and species-specific variations: the Friedenwald lecture. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 1263-1274 (2010).
- Babai, N., Thoreson, W. B. Horizontal cell feedback regulates calcium currents and intracellular calcium levels in rod photoreceptors of salamander and mouse retina. J. Physiol. 587, 2353-2364 (2009).
- Babai, N., Morgans, C. W., Thoreson, W. B. Calcium-induced calcium release contributes to synaptic release from mouse rod photoreceptors. Neuroscience. 165, 1447-1456 (2010).
- Thoreson, W. B., Burkhardt, D. A. Contrast encoding in retinal bipolar cells: current vs. voltage. Vis. Neurosci. 20, 19-28 (2003).
- Thoreson, W. B., Bryson, E. J., Rabl, K. Reciprocal interactions between calcium and chloride in rod photoreceptors. J. Neurophysiol. 90, 1747-1753 (2003).
- Cadetti, L., Bryson, E. J., Ciccone, C. A., Rabl, K., Thoreson, W. B. Calcium-induced calcium release in rod photoreceptor terminals boosts synaptic transmission during maintained depolarization. Eur. J. Neurosci. 23, 2983-2990 (2006).
- Luo, J., Boosalis, B. J., Thoreson, W. B., Margalit, E. A comparison of optical and electrophysiological methods for recording retinal ganglion cells during electrical stimulation. Curr. Eye Res. 37, 218-227 (2012).
- Zenisek, D., Horst, N. K., Merrifield, C., Sterling, P., Matthews, G. Visualizing synaptic ribbons in the living cell. J. Neurosci. 24, 9752-9759 (2004).
- Snellman, J., Mehta, B., Babai, N., Bartoletti, T. M., Akmentin, W., Francis, A., Matthews, G., Thoreson, W. B., Zenisek, D. Acute destruction of the synaptic ribbon reveals a role for the ribbon in vesicle priming. Nat. Neurosci. 14, 1135-1141 (2011).
- Mercer, A. J., Chen, M., Thoreson, W. B. Lateral mobility of presynaptic L-type calcium channels at photoreceptor ribbon synapses. J. Neurosci. 31, 4397-4406 (2011).
