Summary
대뇌 국소 빈혈의 여러 동물 모델은 스트로크의 인간의 조건을 시뮬레이션하기 위해 개발되었습니다. 이 프로토콜은 쥐의 허혈성 뇌졸중에 대한 엔도 테린-1 (동부 표준시-1) 유발 중간 뇌동맥 폐색 (MCAO) 모델에 대해 설명합니다. 또한 중요한 고려 사항, 장점,이 모델의 단점은 설명되어 있습니다.
Abstract
뇌졸중은 2009 년 1, 2에 미국에서 추정 70,000,000,000달러 비용이, 장애 세계에서 사망의 세 번째 주요 원인의 최고의 원인입니다. 대뇌 국소 빈혈의 여러 모델은 뇌졸중의 인간의 조건을 모방하기 위해 개발되었습니다. 그것은 중간 대뇌 동맥 (MCA) 영역 3 허혈성 손상에서 모든 스트로크 결과의 80 %에있는을 제안하고 있습니다. 1990 년대 초, 엔도 테린-1 (동부 표준시 - 1) (4) craniotomy 후 MCA의 표면에 직접 인접를 적용하여 국소 빈혈을 유발하는 데 사용되었다. 나중에,이 모델은 초점 뇌성 국소 빈혈을 생산하기 위해 MCA에 동부 표준시-1 인접의 stereotaxic 주사를 사용하여 5 바뀌 었습니다. 이 모델의 주요 장점은 신속하게 절차를 수행 할 수있는 능력, 동부 표준시 - 1의 복용량을 변경하여 동맥 수축을 제어 할 수있는 기능 제공, 뇌에 혈액을 공급뿐만 아니라 점차적으로 reperfusi extracranial 혈관을 조작 할 필요없이 포함가격에있는 더 밀접하게 5-7 인간 reperfusion을 모방 한 것이 었지요. 한편, 동부 표준시-1 모델은 craniotomy의 필요성뿐만 아니라, 뇌졸중 볼륨 8 높은 가변성을 포함 단점이 있습니다. 이 변화는 동부 표준시-1 주입하는 동안 대뇌 국소 빈혈을 확인하기 위해 레이저 도플러 flowmetry (LDF)의 사용을 줄일 수 있습니다. 스트로크 변화에 영향을 미칠 요소는 주입과 동부 표준시-1의 배치의 정밀도가 6을 사용하여 포함되어 있습니다. 또 다른 중요한 고려 사항은 비록 reperfusion 인간 뇌졸중의 일반적인 발생 점입니다, 동부 표준시-1 유도 MCAO에 대한 가림의 기간은 밀접하게 인간 뇌졸중으로 많은 환자가 폐색 9에 따라 일 시간 동안 부분 reperfusion을 가지고있는 것을 모방해서는 안됩니다 10. 이 프로토콜은 상세 쥐의 허혈성 뇌졸중에 대한 동부 표준시-1 유도 MCAO 모델에 대해 설명합니다. 또한 절차를 통해 특별 고려 사항과 잠재적 인 단점에 관심을 끌기합니다.
Protocol
이 프로토콜은 플로리다 대학 기관 동물 케어 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되고 준수는 "케어에 대한 가이드 및 실험실 동물의 사용"(여덟째 판, 과학 국립 아카데미, 2011)되었다.
자료
- 동물 : 수술시 250~300그램 무게 여덟 주 된, 남성, Sprague Dawley 쥐 (찰스 강 (Charles River)의 농장, 윌 밍턴, 미국 MA,).
- 마취
- 흡입 마취 시스템 (VetEquip 주식회사, Pleasanton, CA, USA)
- Isoflurane 마취 (박스터의 조제, 디어 필드, IL, USA)
- Stereotaxic 시스템 (데이비드 Kopf 기기, Tujunga, CA, USA)
- 작은 동물 stereotaxic 시스템
- 쥐에 대한 비 파열 귀 바
- 쥐에 대한 가스 마취 헤드 홀더
- 온도 조절
- BAT-12 microprobe 온도계 (세계 정밀 계측기, 주식회사, 사라 소타, FL, USA)
- T / PUMP, TP600 열 담요 (Gaymar 산업 주식회사, 오차드 파크, NY, USA)
- 수술기구
- 메스 핸들과 # 11 블레이드 아이리스 포셉, Graefe 포셉, 드라이버 겸자의 견인기,, 26 게이지 바늘 beveled (세계 정밀 계측기, 주식회사, 사라 소타, FL, USA)을 갖춘 10 μl 주사기
- Micromotor 훈련과 stereotaxic 홀더, 전형적인 Stereotaxic 주입기 (Stoelting, 우드 데일, IL, USA)
- 1.0 mm 원형 드릴 버, 1.0 mm 역 콘 드릴 버 (Roboz 외과 인스트루먼트 (주), 주식회사, 게이스 버그, MD, USA)
- 외과 용품
- 2.4 mm 축 길이, 21 게이지 가이드 캐뉼라 [긴 받침대 아래에 4mm]와 캐뉼라 더미 (플라스틱 하나 로어 노크와 함께 나사에게 0-80 X 32분의 3 마운트, VA, USA)
- 제트 의치 아크릴, 액체 (랭 치과 제조 유한 주식회사, 휠링, IL, USA)
- 3.0 나일론 봉합 (오아시스 (Oasis), Mettawa, IL, USA)
- 면봉, Puralube 눈 연고 (피셔 과학, 피츠버그, PA, USA)
- 전기 헤어 가위 (Oster, 섭리, RI, USA)
- 화학 제품
- 엔도 테린-1 (미국 펩타이드, 서니 베일, CA, USA)
- Chlorhexidine 2% (Agrilabs, 세인트 조셉, MO, USA)
- Buprenorphine HCL (Hospira 주식회사, 레이크 포레스트, IL, USA)
- 시각화 장비
- 수술 현미경 (Seiler 악기 및 제조, 세인트 루이스, MO, USA)
- 광섬유 조명기 (TechniQuip 공사, 리버모어, CA, USA)
- 레이저 도플러 flowmetry 시스템 (ADInstruments 주식회사, 콜로라도 스프링스, CO, USA)
- 세인트andard 연필 프로브
- 프로브 홀더
- 혈액 유량계
- LabChart 7 Powerlab 30분의 4
- 경색 볼륨 측정
- 쥐 뇌 매트릭스 (Zivic - 밀러 연구실., 주식회사, 앨리슨 공원, PA, USA)
- 2,3,5 - triphenyltetrazolium 염화은 (시그마 - 알드리치 (주) 세인트 루이스, MO, USA) PBS에 0.05 %로 희석
- 평판 스캐너 (엡손 정보를 완벽 V30, 엡손 아메리카, 주식회사, 롱 비치, CA, USA)
- 이미지 J 소프트웨어 (ImageJ 1.42q 소프트웨어, 건강의 미국 국립 연구소, 베데스다, MA, USA)
1. 사전 수술 단계
- 수술에 앞서, 쥐가 물과 쥐 수유에 무료로 액세스 할 수있는 12시 12분 어두운 / 밝은주기에 따라 자리 잡고 있습니다.
- 마취는 뒤쪽 동물의 발자국이 핀치에 인출 더 이상 쥐까지 유도 챔버 100 % O 2 기체 혼합물의 4% isoflurane으로 유도하고 있습니다.
- 발효 기술은 멸균 장갑, 멸균 수술 악기 및 살균 수술 드레이프 (11)의 사용을 포함하여이 절차를 수행하는 동안 유지되어야합니다.
- 머리의 왕관은 전기 헤어 가위로 면도 있습니다.
- 쥐가 온도 조절 운영면 (열 담요)에 누워 흡수 패드에서 발생하기 쉬운 위치에 배치됩니다.
- 머리는 가스 마취 얼굴 마스크의 위치로 시작 stereotactic 장치에 저장됩니다.
- 다음으로 귀 바는 삽입 강화하고 있습니다.
- 절차 마취 동안 백퍼센트 O 2 기체 혼합물에서 isoflurane 2퍼센트로 유지됩니다.
- 윤활유 안과 연고는 양쪽 눈에 적용되며, 눈꺼풀이 수술하는 동안 눈 건조를 방지하기 위해 폐쇄됩니다.
- 직장 온도 프로브는 ± 0.5은 ° C. 37 일정한 동물 코어 온도를 유지하기 위해 삽입
- stereotaxic에 단단히 개최 된 머리장치 외과 영역은 2 % chlorhexidine과 염분을 세 번 교대로 세안합니다.
2. 외과 단계
- 메스를 사용 중간 선 절개는 귀 (우수한 nuchal 라인) 사이에 눈의 가장 꼬리 부분 (nasion)에서 개관 놓인 피부에 이루어집니다.
- 피부는 3 다음 불독 겸자 측면 후퇴하고 있습니다.
- 결합 조직은 여러 구조는 명확하게 볼 수 있도록 건조 면봉을 사용하여 두개골에서 제거됩니다. 이러한 bregma, 코로나 봉합, 오른쪽 측면 두개골 능선 등이 있습니다. 면봉은 수술 현장에서 피를 제거하는 데 사용됩니다.
- 수술 현미경을 사용하여 bregma이 위치하고 있으며, 1.0 mm의 원형 드릴 버가 bregma에서 청산하고 나면 아무것도 남지 될 때까지 stereotaxic manipulators가 조정됩니다.
- 드릴 버 그 다음 1.6 mm 앞쪽과 bregma에 측면 5.2 mm로 이동합니다.
- 두개골을 관통 버 구멍이 cann에 교련입니다울라 배치 (그림 1). 초과 파편과 피가 지속적으로 면봉을 사용하여 지워집니다.
이 시점에서, 가이드 캐뉼라를 삽입 할 수 있습니다 (7 단계) 또는 버 구멍을 통해 직접 동부 표준시-1 주입은 (16 단계로 바로 진행합니다)을 수행 할 수 있습니다.
- 3 장착 나사에 대한 다음 버 구멍 1.0 mm 역 콘 드릴 버 (그림 1)를 사용하여 두개골의 부분적인 두께를 뚫고있다. 한 홀은 코로나 봉합과 시상 봉합에 측면 1-2mm에 앞 1-2밀리미터에 대해 각 정면 뼈에 구멍을 뚫었 있습니다. 한 홀은 코로나 봉합 및 가이드 캐뉼라 버 홀에 ipsilateral 시상 봉합에 측면 2-3mm에 뒤 2~3mm에 대해 정수리 뼈에 구멍을 뚫었 있습니다. 세 0-80 X 32분의 3 장착 나사는 이러한 버 구멍에 배치되어 캐뉼라에 쥐고 시멘트에 대한 지원을 제공합니다. 나사는 경질의 문제를 손상하지로 2 ~ 3 회전하므로 고급이어야합니다. 가이드 캐뉼라는 stereotaxic 캐뉼라 홀더에 배치되어 있으며 bregma이 자리 잡고 있습니다.
- 가이드 캐뉼라는 bregma에서 청산하고 나면 아무것도 남지 될 때까지 stereotaxic manipulators가 조정됩니다. 캐뉼라는 1.6 mm 앞쪽과 bregma에 측면 5.2 mm에 위치한 버 구멍으로 이동됩니다.
- 마지막으로, 가이드 캐뉼라는 bregma에 복부 4.5 mm의 마지막 끝의 위치와 버 구멍으로 낮아합니다.
- 레이저 도플러 흐름 프로브 배치 (선택 사항)
- LDF를 사용하여 뇌성 혈액의 흐름을 모니터링하기 위해, 프로브 홀더는 치과 시멘트와 가이드 캐뉼라 affixing하기 전에 위치로 배치 할 수 있습니다.
- 프로브 홀더베이스는 작은 쐐기 모양 탭을 제외하고 받침대와 플러시 손질하고 있습니다.
- 프로브 홀더는 다음 가이드 캐뉼라를 뒤쪽과 medially 지향 탭 (그림 1)과 측면 두개골 능선 바로 안쪽에 위치해 있습니다.
- 프로브 홀더 및 guide 캐뉼라는 치과 시멘트를 사용하여 함께 부착되어 있습니다.
- 치과 시멘트 그런 다음 장소에서 캐뉼라를 확보하는 데 사용됩니다. 시멘트는 세 개의 나사와 접촉하고 캐뉼라의 전체 기반을 둘러싸고 있습니다.
- 시멘트 전에 캐뉼라 소유자의 제거에 완전히 건조해야합니다. 이 약 5 분 정도 소요됩니다.
다음 단계 후, 수술 절개를 폐쇄 할 수 있으며 캐뉼라 더미는 가이드 캐뉼라로 실수 할 수 있습니다. 또한, 동부 표준시-1 유도 MCAO는 캐뉼라 주입 수술에서 회복 기간 후 쥐에서 수행 할 수 있습니다. 이 방법의 경우, 단계 19 다음을 수행 할 수 있어야하며 단계 14-18은 나중에 수행 할 수 있습니다. 같은 수술하는 동안 가이드 캐뉼라 주입 및 ET-1 주사를 수행하려면 단계 14 다음 수행해야합니다.
- 주입 주사기는 동부 표준시 - 1로드 (PBS 80 μM로 희석) 한 후 stereotaxic 분사기에 장착되어 있습니다.
- 바늘 끝이 가이드 캐뉼라의 가장자리에 청산하고 나면 아무것도 남지 될 때까지 stereotaxic manipulators가 조정됩니다.
- 바늘 끝이 가이드 캐뉼라의 가장자리에 복부 17.2 mm의 위치에 가이드 캐뉼라를 통해 인하된다. 가이드 캐뉼라를 사용하지 않는 경우, 바늘 끝이 bregma에서 청산하고 나면 아무것도 남지과 bregma에 복부 위치 8.7 mm로 버 구멍을 통해 인하된다.
- 80 μM ET1 3 μl은 분 당 1 μl의 속도로 주입된다.
- 주입 천천히 제거 후 완전하고 후 주사기은 3 분 동안 자리에 남아 있습니다.
- 절개는 3.0 나일론 봉합사와 캐뉼라 더미가 캐뉼라로 엉망입니다과 함께 문을 닫습니다.
- 적절한 진통제의 복용 (0.05-0.1 밀리그램 / kg에서 즉, buprenorphine)은 복구 기간 동안 통증과 불편 함을 최소화하기 위해 수술 후에 사용되어야합니다.
- 쥐가 수술 방에서 제거하고 부드러운 음식과 물을 무료로, 쉽게 접근 저체온증을 방지하기 위해 따뜻한, 드라이 복구 영역에 배치됩니다. 리>
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Representative Results
1. 포스트 사설 신경 평가
동물이 의식을 회복 한 후 테스트 다양한 종류의 균형, 그립 강도, 동물의 발자국 배치, 자세가 비대칭과 등산 계단 등의 신경 결손을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 해바라기 씨 작업은 모터와 경색 볼륨 7, 12 중요한 상관 관계가 감각 기능의 총 평가입니다. 열기와 5 해바라기 씨 소모하는 동안이 작업에는 쥐가 시간이 초과되어 있습니다. 다섯 씨는 비어있는, 건조, 플라스틱 케이지 중 하나를 코너에 배치되어 씨앗을 조작 소요 시간이 기록됩니다. 또한, 모든 씨앗이 열리고 소비 한 후 케이지에서 쉘 조각의 번호가 기록됩니다. 더 신경 적자와 쥐가 씨앗을 열고 소비하는 데 시간이 오래 걸릴 더 많은 조각으로 껍질을 깰 수 있습니다. 이 작업을하지 공식적인 부분이지만, 자주 mishandling와 해바라기 씨의 하락을 관찰하기 쉽다실험 뇌졸중 후 쥐가 s입니다. 이 열 시도하는 동안 껍질 물고 주로 한 앞발, 그리고 효과의 사용이 포함되어 있습니다.
2. 착색 및 뇌 경색 볼륨의 양적 측정
과도 대뇌 국소 빈혈을 수립 할 수있는 MCA의 가림과 reperfusion 후, 동물은 euthanized하고 자신의 coronally sectioned 뇌는 당사 이전 출판물에서 논의 된 경색 볼륨 (그림 2)을 평가하는 2,3,5-triphenyltetrazolium 염화 (TTC)에 묻은 7, 13.
1 그림. 쥐 두개골의 등쪽보기 하드웨어 배치를 묘사. 왼쪽 앞 방향으로 쥐 두개골의이 등쪽보기 삭제 결합 후 시각화 할 수 있습니다 봉합과 관련하여 bregma와 람다의 위치를 보여줍니다두개골 표면에서 조직. 측면 두개골 능선, 가이드 캐뉼라, LDF 프로브 홀더, 그리고 고정 나사는 두개골 토지 마크 및 서로에 대해 관계가 다이어그램에 표시됩니다.
그림 2. 쥐에서 TTC-스테인드 시리얼 코로나 뇌 섹션 (2mm)는 동부 표준시-1 유도 MCAO를 받게. 동부 표준시-1 유도 MCAO 후 쥐의 대표 두뇌가 표시됩니다. 이 뇌는 후각 전구에 불과 꼬리 시작 2mm 두께 섹션에 coronally sectioned 것 이전에 얼음 차가운 PBS에서 제거하고 헹구어되었습니다. 조각은 후 0.05 %에 incubated되었습니다 37 PBS에 희석 TTC ° C 사전 PBS에 침묵하는과 후 포르말린에 간단히 해결되었습니다. TTC에 노출이 가능한 회색 물질을 나타냅니다 후 조직 빨간색를 더럽 혔다. 동부 표준시-1 주입에 ipsilateral 남반구 가능한 회색 문제는 회색 m에 비교 될 수대뇌 경색의 면적을 계산하는 contralateral 반구의 atter.
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Discussion
동부 표준시-1 유도 MCAO는 정기적으로 여러 쥐 종자에 사용되는 실험 허혈성 뇌졸중의 오래된 모델입니다. 이 모델 5, 14을 사용하면 이러한 쥐 변형, 동물 연령, 체온, 마취 방법, 그리고 연산자 전문 등 많은 변수가 경색 권 증가 다양성 될 수 있습니다. 그러나, 몇 가지 조사는이 모델의 장점은 상대적으로 비 침습적 방식, 동부 표준시 - 1 뇌성 혈액 흐름의 선량 반응, 그리고 의식 쥐 14, 15 동부 표준시-1의 주입에 의해 모두 마취를 방지 할 수있는 능력을 포함하는 것으로 나타났습니다. 그것은 문학에서 사용 쥐 변형 및 나이에 많은 차이가 있다는 것을 주목할이며 다른 stereotaxic 좌표가이 변수에 따라보고되는 놀라운 일이 아닙니다. 우리 프로토콜에 사용되는 좌표는 팔주 세의 남자 Sprague Dawley 쥐에 최적화되어 있습니다. 이 변형, 성별, 또는 연령에서 조금이라도 벗어나면 가능성이 intracerebral이 주입 필요합니다염료 이온이 절차의 유효 기간 좌표를 확인하기 위해 검시이 나타납니다. 또한, 대뇌 혈액의 흐름에 동부 표준시-1 유도 감소 복용에 의존한다. 이 방법의 선량 사용은 실험 7, 16에서 4-5 % 정도의 평균의 표준 오류가있는 분사에 ipsilateral 남반구에있는 회색 물질의 약 30-40%의 경색이 발생합니다. MCA의 근위 부분의 직접 시각화은 약 30 분 7시 기준으로 3 분 반환에서 기본 0 %로가는 luminal 직경을 드러내고있다. LDF 사용하여, 최대 흐름 (16) 중지 된 모니터링 1 시간 이후 기준의 60 %까지 점차적으로 수익을 5-7 분에 기본 흐름의 약 10 %로 감소 표시했습니다.
영장 언급이 아래에 나열되어 다른 특정 기술 세부 정보 :
- 제대로 위치와 bregma에서 stereotaxic 장비 (미세지도 이하) 제로화하는 것은 induci에 매우 중요합니다NG 성공적으로 뇌졸중. 동부 표준시-1 주입에 대한 stereotaxic 좌표는 이전 실험에 특정 실험 장비와 쥐의 변형에 대해 확인해야합니다. 이 주입은 MCA 6 0.5 mm 내에하지 않을 경우 어떤 병변이 발생하지 않습니다 가능성이 높습니다.
- 가이드 캐뉼라의 초기 버 구멍을 뚫는 때 뇌에 손상을 줄 않도록주의보십시오. 그것은 느린 드릴링 속도가 뇌에 침투 가능성을 최소화 할 수 있도록 끝 부분에 다시 버 홀을 시작하고 사용하는 것이 좋습니다.
- 장착 나사에 버 구멍을 뚫는 경우, 부분적으로 만 두개골을 관통 버 구멍을 만듭니다 역 원뿔 드릴 버를 사용합니다. 만 깊은 충분한 나사가 안정되도록 이동합니다.
- 장소에 캐뉼라을 확고히 할 때하면 피부 명확 시멘트뿐만 아니라 stereotaxic 팔을 유지해야합니다. 시멘트는 면봉을 사용하여 건조하기 전에 조작 할 수 있습니다.
- 시멘트가 완전히 닥터 있는지 확인합니다y 및 캐뉼라 전에 캐뉼라 소유자의 제거에 안정적입니다. 그것은 캐뉼라 전에 동부 표준시-1 사출로 이동하지 않는 것이 중요합니다.
- 우리의 경험에서 동부 표준시-1 스트로크 모델은 수술로 인해 약 20 %의 사망률이 있습니다. 그렇게 충분한 샘플 크기는 신경 및 조직 학적 끝점에 사용되도록 치료 그룹과도 계획 실험을 사이에 사망률을 비교하는 것이 중요합니다.
- 급성 뇌졸중 치료를위한 잠복기 시험에 대한 가이드 라인 실험 17 동안 변화를 줄이기 위해 뇌성 혈액의 흐름 모니터링 및 혈압의 생리 모니터링, 온도, 포도당 및 혈액 가스를 사용하는 것이 좋습니다. LDF는 달성 된 흐름 감소가 미리 결정된 임계 값을 확인하기 위해 다양한 해부학 지역에서 혈액 흐름의 실시간 모니터링을 위해 사용할 수있는 방법입니다.
- 주사 사이의 에탄올과 식염수 주입 주사기와 바늘을 청소해야하고, 이전에 에탄올저장. 이 절차는 일관성 인출 및 운영시 동부 표준시 - 1without 기포 또는 폐색의 주입을 제공합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 미국 심장 협회 상급 동남아 계열 (09GRNT2060421), 미국 의학 협회에서와 플로리다 임상 병진 과학 연구소의 대학에서 보조금에 의해 지원되었다. 아담 메카는 NIH / NINDS, NRSA predoctoral 동료 (F30 NS-060335)입니다. 로버트 Regenhardt은 고혈압의 플로리다 종합 교육 프로그램의 대학 (T32 HL-083810)에서 predoctoral 교제 지원을 받았습니다.
Materials
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References
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