Summary
方法は新皮質の所定の機能、マイクロドメインにおける蛍光色素でニューロンを標識に記載されている。まず、内因性シグナル光学イメージング、機能マップを得るために使用されます。その後、2光子顕微鏡は、マップのミクロドメイン内でラベルとイメージニューロンに使用されます。
Abstract
非げっ歯類哺乳動物の一次視覚野では、ニューロンはそのような方向性1-4、方向5-7、眼優位8,9と両眼視差9として刺激特徴のための彼らの好みに応じてクラスタ化されます。方位選択性は最も広く研究されている機能であり、好ましい向きの準周期的なレイアウトの連続写像全体の一次視覚野10,11越えて存在している。これらの機能マップの刺激選択的応答につながるシナプス、細胞、ネットワークの貢献を統合することにより、ミリメートルの空間スケールにサブミクロンをまたぐイメージング技術のハイブリダイゼーションを必要とします。従来の内因性シグナル光学イメージングでは、視覚皮質の表面全体機能マップの全体的なレイアウトは、12を決定することができます。カルシウム感受性色素を用いたin vivoでの 2光子顕微鏡の開発は、SYNAPTを決定するために、1つを可能にICの入力は、個々の神経細胞体6,14の数百人から同時に個々の樹状突起棘13やレコード活動に到着。その結果、2光子顕微鏡のサブミクロンの空間分解能を有する結合内因性信号イメージングは、樹状細胞は、セグメントと新皮質内の機能マップのマイクロドメインに寄与するかを正確に決定する可能性を提供しています。ここでは、急速に皮質方位マップを取得し、非げっ歯類哺乳動物における蛍光色素で神経細胞を標識するためのこの機能マップ内の特定のマイクロドメインを標的とするため、高収率の方法を示しています。二光子イメージングに使用されるのと同じ顕微鏡を用いて、我々は最初の内因性シグナル光学イメージングを用いた方位マップを生成します。その後、我々はどちらかのラベルに染料を用いて神経細胞体またはラベルの樹状突起棘と軸索がに表示されていることをこのような単一ニューロンの人口を読み込まマイクロピペットを用いて目的のマイクロドメインをターゲットにする方法を示しています生体。以前の方法に比べて我々の改良が新皮質の機能的なアーキテクチャの枠組みの中で、サブ細胞レベルの分解能を持つニューロンの構造と機能の関係の検討を容易にする。
Protocol
1。手術の準備
- 麻酔を誘導し、連続的に心拍数を監視し、潮のCO 2、脳波、および温度を終了します。すべての手順は、サウスカロライナ医科大学の制度的動物実験委員会によって承認されたと我々は以前に9,15を公表したものに基づいていた。
- メスの刃で皮膚を切断することによって頭蓋骨の背側表面を露出させる。 Brudonのキュレットを用いて骨を覆う結合組織を解剖する。綿先端アプリケーターと綿ガーゼを使用して骨をきれいにしてください。小さな使者静脈を通って時折出血を止めるために、頭蓋骨に骨ワックスを（必要に応じ）を適用します。
- 黒の塗料（ 材料を参照してください）と混合歯科用セメントを用いて、頭蓋骨（開頭術が行われる関心領域の上の）にチタンまたはステンレス鋼ヘッドプレートを取り付けます。ヘッドプレートの中央に長方形の開口部は、開頭術および光学イメージングのためのアクセスを提供します。ヘッドプレートの上に金属のチャンバーを取り付けます。このチャンバは、水浸対物レンズと撮像のための流体貯水池として機能します。
- 金属ポストを使用してXYステージにヘッドプレートを固定します。
- 歯科用ドリルを使用してheadplateの長方形の開口部内に骨の大面積を薄く。間伐する面積が十分に計画された開頭術の境界を越えて拡張する必要があります。開頭部位で、骨の厚さは、カバーガラスと新皮質の表面との間にアガロースの厚さが決まりますので、高解像度の画像は、新皮質から取得されようとしている場合は、非げっ歯類哺乳動物の厚い頭蓋骨（下記参照）が薄くしなければなら。
- 開頭術のための骨の中に2×2 mm角のアウトラインをドリルで開けます。骨の破片を除去し、基礎となる皮質への放熱を最小限に抑えるために、新鮮な人工脳脊髄液（ACSF）で定期的にチャンバーを洗浄します。必要に応じて臨時の出血を止めるために、骨のワックスを適用します。
- LIFトン3位鉗子で骨弁。
- すべてが細かい鉗子（＃5CO）とVannas春のはさみを使用して硬膜の底層を削除します。非げっ歯類哺乳動物における硬膜は、厚さと不透明ですが、異なる層に除去することができる。出血はまれですが、穏やかに硬膜の残りの層鉗子を使用していて、ACSFですすぐから削除する必要がありゼルフォームと任意の血液の残基で停止させることができます。硬膜の最終層は透明であり、軟膜血管はそれを通してはっきりと見えるはずです。内因性信号イメージング中に硬膜のこの最終層は無傷のままにしておくと、（説明を参照）実験のその後の二光子イメージング相用蛍光カルシウム指示薬の一括読み込みの成功率が増加します。
- 暖かい2％アガロース（ACSFに溶解）のドロップを適用し、直ちに開頭の上にカバーガラスを配置します。呼吸器や心臓血管外科の脈動は解剖顕微鏡の接眼レンズ、または使用することによって最小限に抑えていることを保証するために開頭術をチェック2を明視野モードの光子顕微鏡。
2。内因性シグナル光イメージング
- 内因性信号イメージング時の乾燥からアガロースを防ぐためにカバーガラスの外側の周りACSFに浸したゲルフォームを追加します。
- 二光子顕微鏡（ 図1）の上に標準のCマウントポートに固有信号イメージング、CCDカメラを取り付けます。 XYステージ（ 図1A）の近くにエアテーブル上の照明光源を配置します。位置と開頭とheadplate /チャンバー（ 図1B）上ライトガイドを固定します。内因性シグナルのために必要な反射した赤色光は、CCDカメラ（ 図1C-D）に開頭から直接渡すようにプライマリーダイクロとCマウントポートの下に鏡を収納してください。 4倍空気対物レンズ（NA 0.13、17ミリメートルWD）を使用して、ビューの2 x 2 mmのフィールドには、内因性信号イメージングのための利用可能です。
- リットルの熱フィルターを挿入加熱から皮質を防ぐためIGHTパス。 （546 nmの中心λ）が緑色の光を通過させるフィルタを使用して、皮質表面の血管のデジタル基準画像を記録します。
- 皮質表面下500μmにzのフォーカスを移動します。内因性シグナルを測定するために皮質を照らすために赤色フィルター（630nmの中心λ）を使用します。皮質表面を均一に照明されるように光導波路を配置します。視覚刺激の表示によって生成された光から開頭をシールドします。視覚刺激とレコード反射データの一連の画像を提示する。 10分以内方位マップを生成するには、8刺激（それぞれ向きを4方向、2方向）のシーケンスの4回の繰り返しに対応するデータを収集します。
- 偽色方向マップを生成するために本質的な信号データを分析します。マップ内のポイント-ニューロンの二光子標識、 例えば、風車の向き特異性のための潜在的なターゲット領域を選択すべての優先配向が（ 図2A）収束する。方位マップと皮質表面の脈管構造（ 図2B-C）の画像を重ね合わせる。大血管や動脈15に場所を避けて、ターゲットを選択する機能ドメインと大型水上艦艇の位置のレイアウトを使用します。
3。蛍光カルシウム指示薬のバルク·ロード
- 5μlのDMSO中に1グラムのプルロニックを追加することにより、20％プルロニック/ DMSOの溶液を調製します。完全プルロニックを溶解するために10分間60℃で混合物を加熱する。混合物を室温まで冷まします。蛍光カルシウム指示薬オレゴングリーン488 BAPTA-午前1時（午前OGB-1）50μgのバイアルにプルロニック/ DMSO混合物4μlを添加する。その後、赤色色素（Alexa Fluor 594の、2 mMのストック溶液）1μlとOGB-1はAM 1mMの最終濃度用ピペット溶液35μlを（ 資料を参照）を追加します。で半時間のためのソリューションを超音波処理冷水浴をした後、不純物を除去するために0.45μmのフィルターで遠心分離します。
- 2.0から2.5μmの外側先端径が長いテーパーピペットを引き抜きます。ピペットに染料混合物5μlをロードします。
- ピペットの挿入を容易にし、最高品質の二光子画像を得るために硬膜の最終層を削除します。
- ピペットは皮質層2月3日にその目標に到達するために配置する必要があることを皮質表面上の正確な位置を決定する。当社所定の皮質ターゲットは方位マップ（ 図2）風車特異点である。ピペットは、チャンバ壁と客観の間を通過するように30°の角度で皮質に駆動する必要があります。このように、200μmの皮質表面下の標的領域にラベルを付けるために、皮質表面にピペットエントリの位置が目標位置（ 図3-B）に横約350μm以下となります。
- （XYステージを移動する上で動物とpipetteのマニピュレーターは、センターの目的（ 図3C）の下で皮質表面のエントリの位置に）配置されています。ピペットを簡単に開頭術の壁に沿って客観的または骨に触れることなく、皮質を入力することを保証するために、少なくとも3mmの作動距離（WD）（ 資料を参照）で20倍または40倍の対物レンズを使用してください。エントリの位置は客観下中央に配置されたら、2ミリメートル（ 図3D）による客観のZ位置を上げる。緑の落射蛍光灯が直接皮質表面エントリ位置（上記の目的の下に（と集中）、その先端が中心になるまでピペットを移動するためにマイクロマニピュレータの斜めの軸を使用し、ピペットで赤色Alexa色素を可視化するためにオンにした状態で図3E）。
- 連続OCUを通してピペットの先端を見ながらピペットは、皮質表面（ 図3F）に達するまで、ピペットを垂直（Z軸方向）下げる顕微鏡のラース。明視野照明を使用して、皮質表面の血管や残りの髄膜（軟膜とクモ膜）はピペットは皮質表面に近づくにつれて簡単に見ることができます。ピペットは、目的のエントリの位置に到達しない場合は、ピペットを高め、皮質表面上の血管のランドマークに基づいて再キャリブレーションターゲット。
- 目標を外し、開頭術から過剰な脳脊髄液を芯と糸くずの出ない吸収槍を使用して、隣接する骨を乾燥させてください。開頭術（ 図3G）を通して見える皮質を安定させるために暖かい3％アガロース（ACSFに溶解）のドロップを適用します。非げっ歯類では、3％アガロースは、ニューロンによって蛍光色素の取り込みに成功した脈動を減衰させることが必要である。 2％アガロースとカバーガラスの組み合わせが必要な安定性を提供するので、内因性シグナル光学イメージングの場合のみ2％アガロースが必要とされている。ここでは、全くカバーガラスを3％アガロースので染料ローディングステップのためにされて使用されていません必要。アガロースが固化した後、40倍対物レンズ（0.8 NAは、3.3ミリメートルWD）とACSFで再充填チャンバーを挿入します。
- 明視野からの2光子観察に切り替えて、ピペットの先端の位置を確認します。その先端が皮質（ 図3H）で所望の深さに達するまで、マイクロマニピュレータの対角軸を使用して、ピペットを移動します。染料混合物（数PSI、各パルス0.1秒）の時折圧力吐出パフ目詰まりからピペットチップを防ぐことができます。 OGB-1は細胞のみに入る時に見えるようになるだから、赤色Alexa色素は、皮質内部のピペットチップの可視化のために重要である。
- ピペットチップの深さを確認し、先端がのレイアウトに基づいてターゲットの位置にあることを確実にするために皮質表面上に再注力目的、染料の完全な用量で2月3日皮質層のニューロンをロードしようとする前に表面の血管。ピペットは、レイヤ2/3になっている場合は、染料の混合物の小さなパフが点灯します外空間と暗い影のように円形の細胞体の密集アセンブリを明らかにする。
- 大脳皮質300から600μmの直径の球に神経細胞体をロードするために、30から90パルス、各パルス1.0秒、2月10日PSIを使用して細胞外空間に染料混合物を注入します。圧力のパルスは、組織が動くように強いてはいけません。注入が完了した後、数分待ってから、ピペットと目標を削除します。完全ニューロンによって巻き取られるようにAM OGB-1を可能にするために1時間待つ。
- 染料ロードに使用アガロースを外し、録音室をすすいでください。表面で2-3％のアガロースの小滴を入れて、すばやく開頭の上にカバーガラスを配置します。蛍光色素は光に敏感なので、明視野または落射蛍光灯に皮質をオーバー露出させないようにしてください。客観的なホルダーと再中心XYステージを用いて目的の下で標識された皮質領域に高NA（1.0）の20倍の対物レンズを挿入します。 EXから開頭術をシールドtraneous光源、 例えば 、視覚刺激の表示、遮光材料の複数の層を使用しています。
4。蛍光色素の単一セルのエレクトロ
- 樹枝状形態を研究するために、100μMのAlexa Fluor 594（2mMのAlexa Fluor 594の株式のACSFで1時20希釈）の溶液を調製します。樹状突起の機能的イメージングのためにOGB塩が16,17を使用することができる。
- 1μmの先端サイズが長いテーパーピペットを引き、ピペットに染料の5μlをロードします。機能ドメインを標的とする他のすべての手順は、バルク·ロードする方法（ 図1-3）と同じです。神経細胞体の膜に隣接したピペットチップを配置するには、電極インピーダンスの増加を監視し、細胞外空間を照らすと二光子イメージング中に影のように細胞体を見るために、染料の圧力パフを適用します。
- ピペットの先端は、神経細胞体膜に隣接している場合には、適用するAxoporator 800Aを使用1-3パルス（-8〜-10 V、10ミリ秒パルス）。染料とニューロンの即時充填は2光子顕微鏡で容易に可視化される。ピペットを取り出して、in vivoでの樹状突起と軸索の高解像度の画像を収集する。
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Representative Results
私たちの色素標識法の精度を説明するために、我々は、非げっ歯類の新皮質内の任意の既知の機能マップの最小のマイクロドメインを対象とした。まばらに一次視覚野における方位マップ全体中断特異点である。これらは、すべての優先方位が配向性の偽カラーマップ、 "風車"（ 図2A-B）のような特異点を見て周りの地域ではそのような収束するポイントで発生します。開頭当たり一風車は、特定の15大血管や動脈を避けるために確認してから、色素標識（ 図2Cに緑色の円）に選択されます。 OGB-1 AMのバルクロード機能により、指向格子視覚刺激の配列に蛍光ニューロンのカルシウム指示薬の変化を追跡することは風車の特異点の周りの単一セルの解像度機能マップ（ 図4）を明らかにする。単一セルのエレクトロポレーションを使用すると、樹状突起と軸索の空間的な組織としての風車の特異点に位置イングルニューロンを in vivo（ 図5） で決定される。
図1。内因性シグナル光学イメージングセットアップ（A）動物は、XYステージと内因性シグナルイメージング上に配置され、2光子顕微鏡に搭載されたCCDカメラを介して行われます。イメージングセッションを制御するために使用される光源とコンピュータが本質的なイメージングのためのセットアップに引き渡され、実験が始まるの二光子イメージングフェーズの前に先に移動されます。 （B）の4倍対物レンズと液体ライトガイドを通して630nmの照明のビューを閉じます。どちらかのライトガイドは、金属ポスト（左）に接続されているか、直接目的（右）に接続された単一の照明リングを使用することができます。に使用される。遮光材料照明の外部ソースから客観的には、 例えば 、視覚刺激のディスプレイ、光学イメージングセッション中に、表示されませんを遮蔽する。従来の二光子イメージング構成で顕微鏡と光路（C）の模式図。補足図を参照してください。 Shen らの20。2012年15完全な二光子光路の説明。リトラクタブルミラーは、ダイクロイックを通して、大脳皮質にレーザからの光を偏向するように配置されている。レーザービームを通過して、PMTのに皮質から放出された光を反射するダイクロイック一次は、フィルターターレットを回転させることによって光路に移動されます。 （D）の本質的なイメージングのためにミラーが収納さとフィルターターレットは、CCDカメラに皮質からの直接光パスを提供し、道の主要なダイクロイックを移動するためになっています。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2。蛍光色素を用いた神経細胞を標識するためのマイクロドメインを選択する内因性信号イメージングで得られた機能マップを使用して。ネコ一次視覚野から（A）のオリエンテーション·マップは、内因性シグナル光学イメージングを介して取得した。各ピクセルの色は、その場所での好ましい向きを表す。蛍光色素で神経細胞を標識するための適当な電位方向風車特異点を黒丸内に表示されます。 （B）は方位マップと重ね皮質表面の血管のマップ。 （C）の赤丸内の風車は大きな血管や動脈の近くにあるので、緑の円内風車サイトは、色素標識のためのターゲットとして選択されます。破線の矩形は、図3Bに示す領域に対応する。 ·（A）は500のスケールバームー;メートル。
図3。記録室の蛍光色素でニューロンをロードするためのピペット配置を最適化する。（）概略側面図は、視覚皮質（赤と白の牛の目）で標的とされる色素ローディングサイトは〜200μmの皮質下にあることを示しています表面。ターゲットのxy座標は、内因性信号イメージングから決定オリエンテーション風車特異点の位置に対応しています。ピペットは、30°の角度で皮質に入ります。皮質表面は、XYステージ面に平行である場合は、ピペットチップは、風車の特異点に到達する前に、横方向に約350μmを移動します。 （B）は記録室の上面図は皮質表面の血管系およびピペットエントリの位置（赤い星）番目を示していますでは風車の特異点から350μmである。 （C）は、XYステージの位置は、ピペットのエントリの位置は20倍または40倍対物レンズ（3.3〜3.5ミリメートルWD）の下の中央になるように調整されます。 （D）の目的は〜2mmを向上させています。 （E）のピペットは開頭の上にもたらされ、その先端が直接緑落射蛍光灯を用いた皮質表面上のエントリの位置の上方に位置している。皮質表面の血管がはっきり見えるようになるまで、（F）をピペットで客観的に明視野照明を使用して並行して低下している。 （G）は、客観的かつACSFは削除され、3％アガロースのドロップは開頭の上に適用される。 40倍（0.8 NAは、3.3ミリメートルWD）を目的とした（H）二光子可視化は、選択された皮質の深さまでピペットを下にたどると色素を注入するために使用されています。 および z系列データ-ニューロンが正常に20倍対物レンズ（NA 1.0、2.0ミリメートルWD）NA一般的に、より高い蛍光色素で標識されていることを確認した後、二光子トンを収集するために使用されています。概略図 sが示すように、CHが縮尺で描かれていない。
図4。二光子と内因性シグナルのイメージング機能マップで方位優先の対応。（）OGB-1で標識された細胞体を示す二光子画像化された領域には、視覚皮質層2月3日の午前。 （B）は、同じサイトから個々の神経細胞体の向きの優先順位は、（A）に示す。撮像された領域の中央に配置された風車の特異点の周り優先刺激の向きの組織化マップです。 （C）は方位マップは内因性シグナルのイメージングを用いて得られた。黒い四角（B）に示す領域に対応する。これらのデータは、 図2A-Cおよび3Bに示すように同一の実験から得られた。中のスケールバー（AB）が100μmと（C）は500μm。
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図5オリエンテーション風車特異点での単一ニューロンの in vivoでの形態において 、（A）は、単一のニューロンの樹状突起と細胞体は、同じ視覚野サイトからの方位マップを重ねて。ニューロンが二光子指導の下のAlexa Fluor 594でエレクトロポレートした、zスタックは、 インビボで採取し、樹状突起はNeurolucidaソフトウェアを使用してオフラインで追跡した。方位マップは単一セル、エレクトロポレーション前に内因性シグナルのイメージングを用いて得た。 （B）は皮質層1から平均強度10μmのZ-投影は先端樹状突起を示しています。皮質のレイヤ2/3のショー基底樹状突起と軸索から（CD）の平均強度10μmのZ-予測。赤い矢印は、個々の軸索に樹状突起と白い矢印のポイントに沿って棘を示しています。でスケールバー（AD）は100μmである。
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Discussion
我々は、新皮質の所定の機能、マイクロドメインにおける神経細胞体（または樹状突起と軸索）の標識を対象とする方法を提案する。二光子顕微鏡によるマージ固有信号光イメージングは、ニューロンの選択が機能してマップ内のニューロンの位置、および神経回路部品と相関するかどうかを、シナプス、細胞は任意の機能マップのマイクロドメインに寄与するかを決定する可能性を提供視覚経験7または臨床的に治療薬18のアプリケーションとその変化。
刺激の向き、方向、眼球優位性や、両眼視差のためのマップは成体野生型げっ歯6,19-21の視覚野に報告されていません。しかし、蛍光色素を用いた神経細胞をロードおよびマウスに使用できる強力な遺伝学的ツールとともに、イメージング·安定性を達成するための容易さは、研究の大部分をもたらしたげっ歯類の代わりに、フェレット、ネコ、サルで行われている大脳皮質の二光子イメージングを用いた。
非げっ歯類哺乳動物の神経細胞の高分解能2光子イメージングが長いため、手術時間、厚い骨と硬膜、最小15に脳の呼吸と心臓血管媒介脈動を保つために必要な追加のステップは非常に困難なことができます。手術からの内因性信号イメージングと二光子イメージングに固有への遷移は、試薬、染料およびマイクロ外科プロシージャの実行のタイムリーな準備を必要とし、効率的にする必要があります。内因性信号イメージングのための2光子顕微鏡を使用すると、従来の22内因性シグナル光学イメージングリグで使用される機器の多くのための必要性を取り除き、後続の二光子イメージングに本質的なイメージングと遷移を設定するために必要な時間を短縮できます。
我々のアプローチは、特に高解像度の2-フォーを提供するように設計され予め決められた機能ドメインでトンイメージング。これは、神経細胞体との間の機能の信号の最小のクロストークを提供し、個々の樹状突起棘と軸索は、 生体内で解決することができます。高開口数（NA = 1.0）の対物レンズを使用してとビーム拡大光学系と、対物レンズの背面開口部を充填（補足図を参照してください。20 Shen らインチ 、2012 15）高分解能イメージングのために重要です。 XYおよび/またはZにおけるイメージングの速度に応じて、呼吸器や心臓血管の脈動は、NAと光の光路がどのように良い関係なく、効果的なイメージングの解像度を減らすことはできない。カバーガラス、アガロースの比較的高い濃度を用いて、必要なときに15気胸と腰椎サスペンションを行い、2×2 mmの非げっ歯類における開頭サイズを制限することによって、脳の脈動は1-2μmに制限されています。バルク中に1から2μmに新皮質の呼吸と心血管誘発脈動を最小限に抑えるカルシウム指示薬の負荷も皮質が挿入ピペット周りと全く色素が皮質表面にピペットの軸に沿って追跡していませんそのタイトなシールを形成することを保証します。比較的高速な感覚誘発充血（血行動態）アーティファクトが15除外されるため、大規模な動脈から離れ染料注入およびイメージングのサイトを選択することによっても、高品質の機能イメージングのために重要である。
開頭部位で、内因性シグナルのイメージングと蛍光色素の準備段階を通じて硬膜の最終層はそのままにして - このように色素ローディングのために皮質にピペット挿入前にそれを削除する - 次のニューロン標識の成功率と品質を向上方法：（1）クリーン皮質表面を保持し、及び/又はピペットの先端が詰まる可能性が低いと組織の透明性が維持されている、（2）アガロースが真性イメージング·タッチのために使用がなくなりますように、硬組織再生を防ぎますコートアガロースが削除されたときに損傷を受ける可能性がiCalの表面の血管、（3）は開頭術のエッジの周りの頭蓋骨の下硬膜と皮質の間に入ることから本質的なイメージング中に使用されるアガロースを防ぎます。これらの地域ではアガロースがピペットの挿入が難しくなりカバーガラスと皮質表面の間の距離を増加させ、皮質組織の圧縮につながり、イメージングのための透明性を低減します。
古いプルロニックDMSO /消光蛍光 - バルク·ロードにAM蛍光色素を準備するとき、20％プルロニック/ DMSOの混合物は、その最初の準備から1週間を超えて使用されるべきではありません。機能的な指標、 例えば 、OGB-1、AMを持つ多くの隣接細胞体の最適なバルク·ロードのために、染料混合物は、氷の上に格納され、必要に応じてピペット内にロードされますが、常にその準備の2時間以内で脳に注入。
のバルク·ロード·フェーズで1秒圧のパルスではなく、1分の連続注入を繰り返した実験では、過剰な色素または圧力が印加されないように、吐出パラメータのキャリブレーションを反復することができます。なぜなら、多くの注射のようなシリーズからプルロニック/ DMSOの大量の組織と潜在的な毒性の非常に大きな領域にラベルを付けるために必要な複数のピペットの挿入からの潜在的な組織損傷の、我々は、2×2あたり1 300から600ミクロン染料注射部位を好むミリメートル開頭。血管、ラミナの位置を決定するために、神経細胞体の負のコントラストの使用は、周りのブラインド注射14、二光子視覚的に導かナビゲーションに比べるとなり、細胞の容積の指標として圧力排出時に染料の拡散を測るOGB-1、AMで標識し、非げっ歯類の製剤中の色素ローディングの品質が向上します。
私たちがここで説明するプロトコルは、tarで蛍光色素で標識ニューロンの成功につながるすべての動物でgetedマイクロドメインは、しようとしました。午前OGB-1を使用するバルク·ロードのために、私たちは一貫して同時に撮像ニューロン9,15の75〜100％で視覚誘発反応を得て、技術は生体 23,24 内の単一活動電位の検出に敏感です。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
図5Aに示すように樹状突起をトレースするためのグレース·ディオン;、この作品は、我々はまた、外科的処置の支援についてはマシューペトレルラに感謝国立眼研究所R01EY017925とR21EY020985とダナ·ホワイトホール財団からPKへの資金からの補助金によって支えられているとPratik氏Chhatbar用原稿についてのコメント。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||
| 1. Life support/experiment prep | |||||||||
| Isoflurane | Webster Vet | NDC 57319-474-05 | |||||||
| Isoflurane vaporizer | Midmark | VIP 3000 | |||||||
| Feedback regulated heating blanket | Harvard Apparatus | 50-7079F | |||||||
| ECG monitor | Digicare Biomedical | LifeWindow Lite | |||||||
| EEG amplifier | A-M Systems | 1800 | |||||||
| EEG display monitor | Hewlett Packard | 78304A | |||||||
| End tidal CO2 monitor | Respironics | Novametrix Capnoguard 1265 | Optimize ventilation | ||||||
| Carbide drill burrs for drilling bone | Henry Schein | fine (0.5 mm tip) and coarse (1.25 mm tip) | |||||||
| Cement for headplate/chamber | Dentsply | 675571, 675572 | |||||||
| Black Powder Tempera Paint | Sargent Art Inc. | 22-7185 | Add to cement to improve light shielding and reduce reflections | ||||||
| Agarose - Type III-A | Sigma | A9793 | For minimizing pulsations during intrinsic signal and two-photon imaging | ||||||
| Coverglass: 5 or 8 mm diameter, 0.17 mm thickness | World Precision Instruments | 502040, 502041 | For minimizing pulsations during imaging, the coverglass may be cut as needed | ||||||
| Brudon curettes | George Tiemann | 105-715-0, 105-715-3 | Cleaning skull surface | ||||||
| Bone wax | Ethicon | W31G | Quickly stop bleeding | ||||||
| Cotton Tipped Applicator | Electron Microscopy Sciences | 72308-05 | Clean and dry bone surface | ||||||
| Dumont #5CO Forceps | Fine Science Tools | 11295-20 | Grab individual layers of dura or pia | ||||||
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | Cut dura | ||||||
| Gelfoam | Pfizer | 09-0396-05 | To stop bleeding on the dura | ||||||
| Absorption spears | Fine Science Tools | 18105-01 | Ultra-fast and lint-free wicking of CSF | ||||||
| Blackout material | Thorlabs | BK5 | Shield craniotomy | ||||||
| 2. Dye preparation / injection | |||||||||
| Dimethyl Sulphoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |||||||
| Pluronic | Sigma | P2443 | |||||||
| Oregon Green 488 Bapta-1 AM | Invitrogen | O6807 | Calcium indicator | ||||||
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A10438 | |||||||
| Centrifugal filter (0.45 μm pore size) | Millipore | UFC30HV00 | To remove impurities before injection | ||||||
| Glass pipette puller | Sutter Instruments | P97 | |||||||
| Borosilicate glass filamented capillary (1.5 mm outer diameter) | World Precision Instruments | 1B150F-4 | Dye ejection pipette | ||||||
| Microloader | Eppendorf | 5242 956 003 | For loading dye into pipette | ||||||
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | To position pipette | ||||||
| Pressure pulse controller | Parker Hannifin | PicoSpritzer III | For pressure injection of the dye | ||||||
| Single-cell electroporator | Molecular Devices | Axoporator 800A | For electroporation of the dye | ||||||
| 3. Intrinsic imaging | |||||||||
| 4x Objective (0.13 NA, 17 mm WD) | Olympus | UPLFLN4X | |||||||
| Intrinsic hardware / software | Optical Imaging Inc. | Imager 3001 / VDAQ | VDAQ software is used for episodic imaging | ||||||
| CCD Camera | Adimec | Adimec-1000 | |||||||
| Light source power supply | KEPCO | ATE 15-15M | |||||||
| Light source | Optical Imaging Inc. | HAL 100 | Light intensity at the cortical surface is 3-5 mW | ||||||
| Green filter (for vascular image) | Optical Imaging Inc. | λ = 546 nm (bandpass 30 nm) | For reference image of surface vasculature | ||||||
| Red filter (for intrinsic signal) | Optical Imaging Inc. | λ = 630 nm (bandpass 30 nm) | To collect intrinsic signals | ||||||
| Heat filter | Optical Imaging Inc. | KG-1 | |||||||
| 4. Two-photon rig/imaging | |||||||||
| Two-photon microscope and software | Prairie Technologies | See Shen et al. 2012 for light path, filters and laser power | |||||||
| Ti:Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai XF | |||||||
| 20x (0.5 NA; 3.5 mm WD) | Olympus | UMPLFLN20X | 0.5 NA objective is used only for aligning pipette over the craniotomy (not for two photon imaging) | ||||||
| 20x (1.0 NA; 2.0 mm WD) | Olympus | XLUMPLFLN20X | |||||||
| 40x (0.8 NA; 3.3 mm WD) | Olympus | LUMPLFLN40X/IR | |||||||
| Air table | Newport | ST-200 | Isolates preparation from external vibrations | ||||||
| xy stage | Mike’s Machine Co. (Attleboro, MA) | Experimental subject and Sutter micromanipulator placed on xy stage | |||||||
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References
- Blasdel, G. G., Salama, G. Voltage-sensitive dyes reveal a modular organization in monkey striate cortex. Nature. 321, 579-585 (1986).
- Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals. Nature. 324, 361-364 (1986).
- Bonhoeffer, T., Grinvald, A. Iso-orientation domains in cat visual cortex are arranged in pinwheel-like patterns. Nature. 353, 429-431 (1991).
- Ohki, K., et al. Highly ordered arrangement of single neurons in orientation pinwheels. Nature. 442, 925-928 (2006).
- Shmuel, A., Grinvald, A. Functional organization for direction of motion and its relationship to orientation maps in cat area 18. J. Neurosci. 16, 6945-6964 (1996).
- Ohki, K., Chung, S., Ch'ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex. Nature. 433, 597-603 (2005).
- Li, Y., Van Hooser, S. D., Mazurek, M., White, L. E., Fitzpatrick, D. Experience with moving visual stimuli drives the early development of cortical direction selectivity. Nature. 456, 952-956 (2008).
- Bonhoeffer, T., Kim, D. S., Malonek, D., Shoham, D., Grinvald, A. Optical imaging of the layout of functional domains in area 17 and across the area 17/18 border in cat visual cortex. Eur. J. Neurosci. 7, 1973-1988 (1995).
- Kara, P., Boyd, J. D. A micro-architecture for binocular disparity and ocular dominance in visual cortex. Nature. 458, 627-631 (2009).
- da Costa, N. M., Martin, K. A. Whose Cortical Column Would that Be. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 16 (2010).
- Kaschube, M., et al. Universality in the evolution of orientation columns in the visual cortex. Science. 330, 1113-1116 (2010).
- Villeneuve, M. Y., Vanni, M. P., Casanova, C. Modular organization in area 21a of the cat revealed by optical imaging: comparison with the primary visual cortex. Neuroscience. 164, 1320-1333 (2009).
- Chen, X., Leischner, U., Rochefort, N. L., Nelken, I., Konnerth, A. Functional mapping of single spines in cortical neurons in vivo. Nature. 475, 501-505 (2011).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).
- Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat. Methods. 9, 273-276 (2012).
- Nevian, T., Helmchen, F. Calcium indicator loading of neurons using single-cell electroporation. Pflugers Archiv. 454, 675-688 (2007).
- Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. Targeted patch-clamp recordings and single-cell electroporation of unlabeled neurons in vivo. Nat. Methods. 5, 61-67 (2008).
- Pohl-Guimaraes, F., Krahe, T. E., Medina, A. E. Early valproic acid exposure alters functional organization in the primary visual cortex. Exp. Neurol. 228, 138-148 (2011).
- Bock, D. D., et al. Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons. Nature. 471, 177-182 (2011).
- Rochefort, N. L., et al. Development of direction selectivity in mouse cortical neurons. Neuron. 71, 425-432 (2011).
- Mrsic-Flogel, T. D., et al. Homeostatic regulation of eye-specific responses in visual cortex during ocular dominance plasticity. Neuron. 54, 961-972 (2007).
- Bonhoeffer, T., Grinvald, A. Optical Imaging Based on Intrinsic Signals. Brain mapping: The Methods. Toga, A. W., Mazziotta, J. C. , Academic Press. San Diego. 55-97 (1996).
- Kerr, J. N., Greenberg, D., Helmchen, F. Imaging input and output of neocortical networks in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14063-14068 (2005).
- Hofer, S. B., et al. Differential connectivity and response dynamics of excitatory and inhibitory neurons in visual cortex. Nat. Neurosci. 14, 1045-1052 (2011).
