Summary
הדגמה של שיטות עיקריות למדידה עלתה תפוקה גבוהה. שיטות אלה יכולים לשמש כדי להאיץ phenotyping עלה כאשר לומדים הרבה מוטנטים צמחיים או אחר על ידי צמחי הקרנה פנוטיפ עלה.
Abstract
phenotyping תפוקה הגבוהה (Phenomics) הוא כלי רב עצמה לקישור גנים לתפקידם (ראה 1 ביקורת והדוגמות אחרונות 2-4). עלים הם איבר הפוטוסינתזה הראשוני, והגודל וצורתם משתנים התפתחותית והסביבה בתוך מפעל. מסיבות אלה מחקרים על מורפולוגיה עלה דורשים מדידה של מספר פרמטרים מעלים רבים, שנעשה על ידי מיטב כלים אוטומטיים למחצה Phenomics 5,6. צל חופה הוא רמז סביבתי חשוב שמשפיע על אדריכלות מפעל ותולדות חיים; החבילה של תגובות נקראת באופן קולקטיבי תסמונת הימנעות הצל (SAS) 7. בין תגובות SAS, התארכות צל מושרה עלה פטוטרת ושינויים באזור הלהב הם שימושיים במיוחד כמדדי 8. נכון להיום, תוכניות צורת עלים (למשל SHAPE 9, Lamina 10, 11 LeafAnalyzer, LEAFPROCESSOR 12) יכולות למדוד את קווי מתאר עלים ולמיין צורות עלים, אבל לא יכול פלט אורך פטוטרת. חוסר מערכות מדידה בקנה מידה הגדולה של פטוטרות עלה יש עכבות גישות Phenomics לSAS מחקר. במאמר זה, אנו מתארים תוסף חדש שפותח ImageJ, נקרא LeafJ, שמהירות יכול למדוד אורך פטוטרת ופרמטרי להב עלה של צמח המודל ארבידופסיס thaliana. לעלה מזדמן שתיקון ידני הנדרש של גבול להב הפטוטרת / עלה הייתי לוח עם מסך מגע. יתר על כן, צורת תא עלה ומספרים סלולריים עלים הם גורמים חשובים בגודל העלה 13. נפרד מLeafJ אנחנו גם מציגים פרוטוקול לשימוש במחשב לוח עם מסך מגע למדידת צורת תא, שטח וגודל. מערכת מדידת תכונת עלנו אינה מוגבלת למחקר צל, הימנעות ותאיץ phenotyping עלה של מוטציות רבות וצמחים על ידי הקרנת phenotyping עלה.
Protocol
1. חומרים צמחיים
שים לב שפרוטוקול גידול צמחים שזה מכוון לאיתור תגובת הימנעות צל. ניתן לגדל צמחים בתנאים המועדפים עליך.
- מפזרי זרעי thaliana ארבידופסיס על מים ספוגים ניירות סינון ב 9 מנות סנטימטר הפטר וחנויות (רבד) ב 4 ° C במשך ארבעה ימים בחושך.
- להעביר צלחות פטרי אלה לתנאי יום ראשון מדומים: μE קרינת 80-100 photosynthetically פעילה (PAR) ותוספת מרחיקה אדומה להביא R: יחס FR ל1.86. השתמש בתנאי יום ארוכים (16 שעות אור / שעה אפלה 8) וטמפרטורה קבועה של 22 ° C. דגירה במצב זה במשך שלושה ימים על מנת לאפשר לזרעים לנבוט.
- העברת הזרעים מונבטים לאדמה ולשמור על צמחים בתנאי יום ראשון לניסויים בקנה מידה גדול, אנו ממליצים להכין תגים קטנים לתיוג כל צמחים באמצעות מיזוג נתוני מנהל ב-Microsoft Word 2004 (או מאוחר יותר) להדפסת תוויות.
- עשרה ימים לאחר transfer לאדמה, להעביר מחצית מהצמחים לתנאי צל: כמו שמש אבל עם אור משלים מרחיקה אדומה כדי להביא את יחס R / FR ל0.52.
- לאחר 12 ימים נוספים, הצמחים מוכנים להדמית עלה. בשלב זה את העלים המבוגרים הבשילו באופן מלא ואילו עלים צעירים עדיין מתרחבים, כך שאתה ללכוד תמונת מצב של פיתוח. ייתכן שתרצה לבחור זמן התפתחותי שונה בהתאם לצרכימים שלך.
2. לכידת תמונות עלים גזורים
- הכן גיליונות שקפים שכותרתו עם גנוטיפ צמח ומצב צמיחה עם חמש מסגרות מלבניות. מסגרת אחת מתאימה לעלים מצמח אחד. Microsoft Excel יכול לשמש להדפסת רשת בקנה אחד עם תוויות.
- לנתח עלים של צמחים ישנים 26 יום.
- הסריקה יוצאת ב600 dpi בסורק שטוח מיטה. שים לב שיוצא ממפעל אחד צריך להיות ממוקם אנכי בתוך חלון שחור בכריך של יריעות שקופות. הימנע מעלים נוגעיםלמסגרת שחורה חלון ועלים חופפים, אשר תיתנה לי טעויות בהליכים הבאים.
3. ניתוח תמונת עלה ידי LeafJ
- ההורדה ImageJ גרור את קובץ LeafJ.jar לתוך תיקיית plugins של ImageJ.
- פתח קובץ תמונה בImageJ 1.45s או במאוחר 14.
- לפצל את התמונה לאפיקים השלושה צבעים (אדום, ירוק וכחול) על ידי "תמונת צבע>> ערוצי Split" ולהחיל סף לתמונה בערוץ הכחול.
- בחר את כל העלים מצמח אחד על ידי כלי מלבן (איור 1 א).
- בחר "LeafJ" מתפריט התוסף.
- בחר מידע ליאור הצמח הזה מתיבת הדו השיח שמופיעה. אתה יכוללערוך את ערכי ברירת המחדל שמופיעים כאן על ידי לחיצה על "ערוך אפשרויות אלה".
- לאחר הפעלת תוסף LeafJ ולפני הלחיצה על כפתור "אישור", לערוך לייחס קווים מאזור חלון עניין (ROI) מנהל (במידת צורך; 1B איור). לוח עם מסך מגע (כמו האייפד) שימושי להליך זה. אייפדים יכולים להיות מחוברים למחשב כצג חיצוני באמצעות תוכנת תצוגת אוויר.
- יצוא תוצאות מדידה ומידע משויך (שמות קבצים, זמן פריחה, משופע ב, שנמדד על ידי, וכו ') ל-Microsoft Excel או תוכנה מקבילה.
4. ניתוח תמונת תא עלה בImageJ
- התקן גזור משאיר כמתואר ב15 התייחסות לאחר הסריקה (שלב 2). עלים קבועים FAA יכולים להיות כל זמן ב4 מעלות צלזיוס למשך 6 חודשים לפחות.
- נקה את העלים על ידי שינוי מקבע-FAA לפתרון כלורל ועלי אינקובטורים ל1 ~ 2 שעות לפני התצפית מיקרוסקופית 15.
- ההר משאיר במיילcroscope מחליק עם trichomes פונה כלפי מעלה. באמצעות הגדלת 40X במתחם מיקרוסקופ, תמונת שכבת mesophyll של מרכז כל עלה משני צדדיו של הווריד הראשי, הימנעות מתאים הסמוכים trichomes או ורידים.
- תא עלה עקבות מתאר ידי כלי מנהל ROI ImageJ עם סיוע של לוח עם מסך מגע וסטיילוס (כמתואר בשלב 3). ניתוח תמונת תא משתמש בתכונות המוכללות של ImageJ אך אינו מחייב LeafJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1. תמונות עלים מציגים אומדני הפטוטרת וגבול להב עלה, ועל חלון המדידה שלהם
אחת התכונות השימושיות ביותר של LeafJ הוא זיהוי אוטומטי של גבול להב / פטוטרת עלה (איור 1). אלגוריתם LeafJ עובד כדלקמן: הפונקציונליות המובנית ParticleAnalyzer ImageJ משמש כדי למצוא ולקבוע את הכיוון של העלים הפנימיים של בחירת המשתמש. לכל עלה הרוחב של העלה נקבע לאורך כל הציר של העלה. ואז השינוי ברוחב בכל עמדה על הציר נקבע באמצעות חלון הפעלה (הרוחב הממוצע לשבע העמדות הפרוקסימלי לעמדת המוקד נגרע מהרוחב הממוצע של השבע עמדות דיסטלי למיקום המוקד). גבול הפטוטרת / להב מוגדר כמיקום הראשון מעבר לבסיס העלה שבו השינוי ברוחב גדול מ 90% מכל הבדלי הרוחב מחושבים. LeafJ עושה בדיקות נוספות כדי להגדיל reliability הקריאה הזו; במיוחד LeafJ גם דורש ש1) הרוחב חורג 5% הצרים של תפקידים באורך (זה מונע שיחות חריגות בבסיס הפטוטרת), 2) באזור הפרוקסימלי לעמדת המוקד אין שינוי משמעותי ברוחב; ו3) הרוחב של 20% עלה דיסטלי למיקום המוקד הוא לפחות 150% יותר מאשר במיקום המוקד (אמיתי אם עמדת המוקד היא הגבול, כי 20% הפרוקסימלי לגבול צריכים להיות להב ולכן הרבה יותר רחב).
ברגע LeafJ הגדיר את גבול הפטוטרת / להב, מובנהיות בכיתות ImageJ ושיטות המשמשות לקביעת אזור להב, היקף ומעגלי. Built-in שיטות ImageJ משמשים גם כדי להתאים לאליפסת הלהב וכדי לחשב את הצירים הראשיים ומהשניות של שהאליפסה (אז שמש כאורך להב ורוחב). אורך פטוטרת נקבע על ידי קו שעוקב לאורך מרכז אזור הפטוטרת.
2. איתור של התארכות פטוטרת צל מושרה </ P>
כדי לשאול אם מדידות LeafJ היו שימושיות בassaying הימנעות צל, השתמש במודל השפעות מעורב בטיפול ומספר עלה כאפקטים ולשכפל קבועים כתופעה אקראית. מצאנו כי אורך פטוטרת, אזור להב, אורך להב, רוחב להב, ויחס אורך / להב פטוטרת אורך הושפעו באופן משמעותי על ידי טיפול צל, ואילו המעגליות להב ויחס האורך / רוחב להב להב לא היו (p <0.05). הנתונים שלנו מראים כי תוסף LeafJ שימושי למחקרים על תגובות הימנעות צל עלה (איור 2).
3. דיוק ומהירות של תוסף LeafJ
כדי לקבוע את הביצועים של תוסף LeafJ בנתונים גדולים יותר קובע השווינו זמן ניתוח ודיוק בין ידני ומדידות plugin. למדידות ידניות שהגדרנו את גבול הפטוטרת / להב כמקום שבו רוחב העלה הופיע במהירות כדי להגדיל. זה לקח חוקר מנוסה ממוצע של 1 9 דקות 3 שניות למדוד שקיפות אחד עם חמישה מפעלים (כ 50 עלים) על ידי מדידה ידנית, ואילו עם LeafJ זה לקח רק 3 דקות 20 שניות. ממוצע על פני 5 שקפים, במדידה באמצעות התוסף היה 5.7 פעמים מהר יותר מאשר מדידה ידנית. המדידה הידנית נעשתה על ידי חוקר בעל ניסיון רבות בביצוע מדידות ידניות; מתחילים יהיו איטיים יותר במידה ניכרת במדידה ידנית, וכתוצאה מכך יתרון גדול עוד יותר של LeafJ. החוקרים העריכו את הדיוק על ידי השוואת נתונים משתי השיטות; הנתונים היו קורלציה גבוהה לכל פרמטרי העלים (איור 3). של 3,532 נקודתי הנתונים היו 172 (4.9%) שהראו הבדלים משמעותיים בין השיטות (שמעיד להיות חריגים בחלקות המתאם). נתחנו את הסיבה לחריגות אלה. מתוך 172 חריגות, 29 היו בגלל טעויות במדידת תוסף LeafJ ו143 היו בגלל טעויות במדידה ידנית. ניתוח שגיאה זו גם הראה דיוק של מדידת תוסף.
jove_step "> 4. גודל תא ומדידת המספר סלולריעצמאי של LeafJ אנחנו גם פתחנו זרימת עבודה יעילה למדידת מספר תא וגודל. מספר התא באופן תיאורטי וגודל יכולים לשמש כדי לסווג צמחים מוטנטים לתשע קטגוריות בהשוואה לסוג פראי; (1) גודל קטן יותר תאים עם מספרים סלולריים קטנו, (2) תאים קטנים יותר עם מספר סלולרי רגיל, (3) תאים קטנים עם תא מוגבר מספרים, (4) גודל תא נורמלי עם מספרים סלולריים קטנו, (5) גודל תא רגיל עם מספרים סלולריים רגילים, (6) גודל תא רגיל עם מספרים סלולריים קטנו, (7) גודל תא גדול יותר עם מספרים סלולריים קטנו, (8) גדולים יותר גודל תא עם מספרים סלולריים רגילים, (9) גודל תא גדול יותר עם מספר תאי גידול 15,16. מדדנו פרמטרים סלולריים עלים ב67 גנוטיפים של thaliana ארבידופסיס באמצעות הגודל שלנו לוח מבוסס התא ושיטת מדידת מספר תא. אנחנו מדדנו את גודל תא של תאים מ8629 877 224 עלים של צמחים. הכפלה ב צפיפות תאיםy עלה האזור (שנמדד על ידי LeafJ), העריך נתונים כלל עלי תא מספר 438 של 219 עלים מצמחים. הניתוח שלנו להציב גנוטיפים אלה לשישה מתוך תשע הקטגוריות האפשריות (F ig. 4). הקטגוריה הגדולה ביותר הייתה (5): גודל תא רגיל ומספר; שני בגודלו היה (8): גודל תא גדול יותר עם מספר תאים נורמלים. למרות עבודת מעקב יש צורך, זה מצביע על כך שהשיטה המבוססת על לוח שלנו יכולה לשמש כדי לסווג מוטציות המבוססות על גודל ומספר תאי העלה.
איור 1. דוגמה לזיהוי פטוטרת / עלה להב גבול ואת ממשק משתמש. שים לב שLeafJ הוא מסוגלת להגדיר גבול להב פטוטרת / עלה אוטומטי (1B איור). לחץ כאן לצפיית figu הגדולמחדש.
איור 2. תוסף LeafJ יכול לזהות תגובות הימנעות צל בפרמטרי עלים שונים. עלה 3-6 עלה משבעה מפעלים מסוג בר (thaliana ארבידופסיס קולומביה ecotype) תחת כל תנאי (שמש וצל) נבדקו. מהפינה השמאלית העליונה לפינה ימנית תחתונה, יחידות ציר ה-Y הן, מ"מ, מ"מ, 2, יחס של אורך פטוטרת לאורך להב, ויחס בין אורך להב לרוחב להב. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 3. תוסף LeafJ הוא מאוד מדויק. גorrelation של נתונים ממדידה ידנית ומדידת תוסף LeafJ מ3,532 נקודתי נתונים. כל נקודה מייצגת עלתה אחד. נקודות ירוקות מציינות את 170 חריגות בגרף זה. צירים של האזור עלה הם מ"מ 2 כל האחרים הם מ"מ. מספרים בחזית של כל פרמטר מייצג עמדת עלה (כלומר "3" הם העלה השלישי).
איור 4. עלילת פיזור של אזור עלה תא ותא מספר עלה בקרב 67 גנוטיפים של thaliana ארבידופסיס. כל נקודה מייצגת את הפנוטיפים של כל גנוטיפ גדל בתנאי צל. צמחים סווגו לתשע קטגוריות המבוססות על ההבדל ביניהם לבין סוג פרא (קולונל), כפי שנקבע על ידי מודל ליניארי מעורב לוואי ומבחנים מרובים תקן P-ערכים: התא (1) תא גודל קטן יותר עם מספר תאי ירד, (2) קטן יותר גודל עם נורמהמספר תא אל, (3) גודל קטן יותר עם מספר תאי תא גדל, (4) גודל תא רגיל עם מספר תא ירד, (5) גודל תא רגיל עם מספר סלולרי רגיל, (6) גודל תא רגיל עם מספר תא ירד, (7 ) גודל תא גדול יותר עם מספר מופחת של תאים, (8) גודל תא גדול יותר עם מספר תאים נורמלים, (9) גודל תא גדול יותר עם מספר תא מוגבר. "*" מציין את הפנוטיפ של זן בר (קולונל).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
התוסף שלנו "LeafJ" מאפשר מדידת אורך פטוטרת חצי אוטומטית, הגדלת תפוקה כמעט 6 פעמים במדידה ידנית. אורך פטוטרת הוא מדד חשוב של SAS וגם לציון דרך של תופעות אחרות, כגון התנגדות שקיעה וצמיחת hyponastic 17. לכן תוסף זה יכול להיות שימושי למגוון רחב של חוקרי צמחים.
התוסף שלנו מיושם בתוכנה מבוססת היטב מבוססת ג'אווה חופשיה, ImageJ. זה מאפשר התקנה קלה בפלטפורמות. קלות השינוי של התכנית היא גם יתרון של תוסף LeafJ בגלל ImageJ כבר יש ספרייה גדולה של תוספים שנכתבו על ידי שפות מאקרו ImageJ (Java וhttp://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=tutorial : להתחיל). כרגע בדקנו רק עלי ארבידופסיס, אבל האלגוריתם של זיהוי גבול להב פטוטרת / עלנו יכול ליישם tdicotyledonous האחר o משאיר אחרי שינוי חלק מהתוסף.
במהלך בדיקת תוסף LeafJ, מצאו את רוב 14 השגיאות הגיעו מטעויות אנושות כגון טעות במיקום תוצאות שהועתקו על גיליונות נתונים ו / או אבחון לא נכון גנוטיפים של צמח. במקרים נדירים גבול להב הפטוטרת / עלה נקרא באופן שגוי, דבר מחייב תיקון ידני ויצירת סיכון נוסף של טעויות העתקה והדבקה. אנו יכולים לזהות טעויות כאלה אחרי שחפשו ובנתונים (א) על ידי ערכי ערכי סף (למשל פטוטרות ארוכות יותר מאורך עלה) (ב) על ידי מציאת מצב משוכפל מדגם (למשל, "שמש" או "צל"), גנוטיפ, או עמדה של עלים.
שיטת הלוח עם מסך מגע שלנו אפשרה דיוק ומהירות של מדידה. מגבלה של השיטה שלנו היא שתקשורת בין המחשב המרכזי ולוח מסך מגע מסתמכת על המהירות של הרשת האלחוטית המקומית (LAN).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
LeafJ נכתב על ידי תל"י בזמן שהוא היה בשנת השבתון במעבדתו של ד"ר קתרין פולארד במכון גלדסטון.
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהקרן הלאומי למדע (מענק מספר IOS-0923752).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| far-red light LED | Orbitec | custom made | |
| transparency | IKON | HSCA/5 | |
| scanner | Epson | Epson Perfection V700 PHOTO | |
| Image J | NIH | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
| LeafJ | custom | http://www.openwetware.org/wiki/Maloof_Lab | |
| Air Display | Avatron Software Inc. | http://avatron.com/ | |
| iPad2 | Apple Inc. | http://www.apple.com/ |
References
- Furbank, R. T., Tester, M. Phenomics--technologies to relieve the phenotyping bottleneck. Trends Plant Sci. 16, 635-644 (2011).
- Berger, B., Parent, B., Tester, M. High-throughput shoot imaging to study drought responses. J. Exp. Bot. 61, 3519-3528 (2010).
- Borevitz, J. O. Natural genetic variation for growth and development revealed by high-throughput phenotyping in Arabidopsis thaliana. G3 (Bethesda). 2, 29-34 (2012).
- Albrecht, D. R., Bargmann, C. I. High-content behavioral analysis of Caenorhabditis elegans in precise spatiotemporal chemical environments. Nat. Methods. 8, 599-605 (2011).
- Chitwood, D. H., et al. Native environment modulates leaf size and response to simulated foliar shade across wild tomato species. PLoS ONE. 7, e29570 (2012).
- Chitwood, D. H., et al. The developmental trajectory of leaflet morphology in wild tomato species. Plant Physiol. 158, 1230-1240 (2012).
- Casal, J. J. Shade Avoidance. The Arabidopsis Book. , e0157 (2012).
- Smith, H. Photomorphogenesis in Plants. Kendrick, R. E., Kronenberg, G. H. M. , Kluwer Academic Publishers. 377-416 (1994).
- Iwata, H., Ukai, Y. SHAPE: a computer program package for quantitative evaluation of biological shapes based on elliptic Fourier descriptors. J. Hered. 93, 384-385 (2002).
- Bylesjo, M., et al. LAMINA: a tool for rapid quantification of leaf size and shape parameters. BMC Plant Biol. 8, 82 (2008).
- Weight, C., Parnham, D., Waites, R. LeafAnalyser: a computational method for rapid and large-scale analyses of leaf shape variation. Plant J. 53, 578-586 (2008).
- Backhaus, A., et al. LEAFPROCESSOR: a new leaf phenotyping tool using contour bending energy and shape cluster analysis. New Phytol. 187, 251-261 (2010).
- Tsukaya, H. Mechanisms of Leaf-shape determination. Annual Review of Plant Biology. 57, 477-496 (2006).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Horiguchi, G., Fujikura, U., Ferjani, A., Ishikawa, N., Tsukaya, H. Large-scale histological analysis of leaf mutants using two simple leaf observation methods: identification of novel genetic pathways governing the size and shape of leaves. Plant. J. 48, 638-644 (2006).
- Horiguchi, G., Ferjani, A., Fujikura, U., Tsukaya, H. Coordination of cell proliferation and cell expansion in the control of leaf size in Arabidopsis thaliana. J. Plant. Res. 119, 37-42 (2006).
- Pierik, R., de Wit, M., Voesenek, L. A. C. J. Growth-mediated stress escape: convergence of signal transduction pathways activated upon exposure to two different environmental stresses. New. Phytol. 189, 122-134 (2011).
