Summary
एक आनुवंशिक रूप से पूरे भीतर उपकला कोशिकाओं में हेरफेर करने की तकनीक
Protocol
प्रोटोकॉल के चार प्रमुख कदम, चित्रा 1 में चित्रित शामिल हैं. सभी चरणों को पूर्ण विस्तार में वर्णित हैं. Adenovirus निर्माण और वायरल शुद्धि dissected उपकला आरंभ की आनुवंशिक पारगमन में उपयोग के लिए अंग कटाई के अग्रिम में किया जाना चाहिए. Adenoviruses साथ काम कर रहे सभी मानक BSL-2 सुरक्षा सावधानियों का पालन किया जाना चाहिए.
1. माउस भ्रूणीय अवअधोहनुज ग्रंथि (SMG) संचयन और Microdissection
- समय गर्भवती महिला (outbred तनाव CD-1 या ICR) चूहों सीओ 2 निद्रावहन का उपयोग, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था और माउस भ्रूण की फसल तार भ्रूण 13 दिन में (E13, 3-5, उपकला कलियों) निम्न संस्थागत IACUC द्वारा अनुमोदित प्रक्रियाओं से पीछा euthanize समिति. योनि प्लग खोज के दिन E0 रूप में नामित है. लार ग्रंथियों और भी काटा जा सकता सुसंस्कृत E12 स्तर पर जब वहाँ एक प्राथमिक और clefts बस शुरू करने के साथ कली डंठल हैआरंभ करने के लिए. इस चरण से पहले SMGs यहाँ संकेत दिया उन लोगों की तुलना में अलग संस्कृति की स्थिति की आवश्यकता है.
- बाँझ 10 सेमी ऊतक संस्कृति / DMEM हाम 'F12 (F12) मध्यम phenol (जीवन टेक्नोलॉजीज) लाल और 100 यू / मिलीलीटर पेनिसिलिन के साथ पूरक, और 100 छ / मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन (कलम - strep कमी की 25 मिलीलीटर से भरा व्यंजन में भ्रूण तार स्थानांतरण, टेक्नोलॉजीज लाइफ).
- एक बाँझ (# 11 ब्लेड) स्केलपेल और संदंश (5, ललित विज्ञान उपकरण, 11252-20) का उपयोग करते हुए, थैलियों से एक अलग 10 सेमी DMEM/F12 + कलम strep की 25 मिलीलीटर युक्त डिश में भ्रूण को हटा दें.
- सिर्फ निचले जबड़े के नीचे एक angled कटौती के साथ भ्रूण सिर तोड़.
- प्रेषित प्रकाश (Nikon SMZ645 या समकक्ष) के आधार पर ऊपरी जबड़े के नीचे एक कट का उपयोग के साथ एक स्टीरियो विदारक माइक्रोस्कोप के तहत सिर से कम mandibles अलग. कांच के एक अतिरिक्त टुकड़ा के शीर्ष पर बजाय सीधे खुर्दबीन आधार के कांच घटक ऊतकों रखें.
- डीएम 3 मिलीलीटर में निचले mandibles लीजिएEM/F12 + एक बाँझ 35 मिमी ऊतक संस्कृति डिश में कलम strep.
- विदारक खुर्दबीन मंच पर एक जबड़ा टुकड़ा इतनी जगह है कि जीभ टुकड़ा के तल पर है, लेकिन 12:00 बजे की स्थिति की ओर इशारा करते हुए.
- एक scissoring गति में दो को पार कर संदंश एक तरफ हटा दें, और जबड़ा टुकड़ा का 1/3 कम तीसरी त्यागें.
- बारी टुकड़ा सही करने के लिए 90 ° (अगर सही हाथ) और संदंश के साथ एक scissoring कटौती का उपयोग करने के लिए, टुकड़ा में आधे रास्ते जबड़ा टुकड़ा (जीभ काटने के बिना) के शीर्ष भाग में कटौती.
- पील दूर अतिरिक्त ऊतक और इसे दूर करने के लिए नीचे SMGs का खुलासा. वहाँ एक जीभ के आधार के पास प्रत्येक पक्ष पर होगा.
- संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करने के लिए नीचे जीभ से ऊतक पकड़, अन्य संदंश का उपयोग करने के लिए जीभ से SMG दूर चिढ़ाने के. दूसरी ग्रंथि के लिए दोहराएँ.
- 3 DMEM/F12 + कलम strep की मिलीलीटर में एक नया बाँझ 35 मिमी के ऊतकों में जमा microdissected लार ग्रंथियोंसंस्कृति डिश. नोट: बड़ा जुड़ाव छोटे sublingual ग्रंथि (1 कली) के साथ अवअधोहनुज ग्रंथियों (3-5 उपकला कलियों) चरण 4 लंघन और प्रदर्शन चरणों का 4.1, 4.3, और 4.4 से बरकरार संवर्धित कर सकते हैं, के रूप में पहले से वर्णित 2,8.
2. उपकला आरंभ पृथक्करण SMG
- 5 प्लेस (या अधिक) में एक गिलास-तली, 50 मिमी व्यास microwell (मटेक निगम, P50G - १.५-१४ - एफ) पकवान हांक संतुलित नमक समाधान के 200 μl (HbSS Ca कमी युक्त लार ग्रंथियों + + या मिलीग्राम + +, जीवन टेक्नोलॉजीज) 0.4% (v / v) युक्त dispase (जीवन टेक्नोलॉजीज, बिल्ली. नहीं. 17,105-041) और 37 पर 15 मिनट के लिए सेते हैं ° सी.
- ऊष्मायन के बाद, एक बाँझ 200 μl विंदुक टिप का उपयोग, सावधानी से ग्रंथियों को परेशान करने के बिना dispase समाधान निकालना. तुरंत युक्त DMEM/F12 5% (w / v) BSA (DMEM/F12-BSA, पूर्व एक 0.22 फिल्टर सुक्ष्ममापी के साथ निष्फल) dispase बेअसर करने के लिए मीडिया के 200 μl जोड़ें. <> एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत ली, ठीक सुझावों (# 5 Dumostar, ललित विज्ञान उपकरण, 11295-20) के साथ संदंश की एक जोड़ी का उपयोग, धीरे SMG उपकला कलियों और नलिकाओं के आसपास से ढीला mesenchyme अलग, देखभाल करने के लिए छोड़ उपकला बरकरार .
- पूर्व गीला बाँझ 200 DMEM/F12-BSA मीडिया के साथ μl विंदुक टिप और धीरे बाहर एक नए 50 मिमी व्यास microwell DMEM/F12 के 200 μl + कलम strep युक्त डिश में उपकला आरंभ विंदुक. एक चिकनी बढ़त के साथ एक उच्च गुणवत्ता 200 μl विंदुक टिप का उपयोग करें.
- Mesenchyme टुकड़े वाली डिश है कि, किसी भी गैर mesenchymal मांसल ग्रंथियां और किसी भी अलग अवअधोहनुज ग्रंथि कलियों सहित ऊतक त्यागें.
3. उपकला आरंभ की adenoviral संक्रमण
- ब्याज की DMEM/F12 + एक microcentrifuge ट्यूब में कलम strep इतना है कि जिसके परिणामस्वरूप समाधान के अनुमापांक 1x10 8 -10 9 PFUs में adenovirus कमजोर द्वारा वायरल संक्रमण मीडिया के 200 μl.इष्टतम अलग वायरस के लिए आवश्यक अनुमापांक भिन्न हो सकते हैं. यह सीज़ियम (CsCl) क्लोराइड शुद्ध इष्टतम तेज दक्षता के लिए वायरल तैयारी का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है.
- पकवान युक्त पाँच उपकला आरंभ से मीडिया निकालें. जल्दी संक्रमण मीडिया के 200 μl जोड़ने के लिए, सभी समय पर आरंभ गीला रखने. आवश्यक सावधानियों जब वायरस से निपटने और दूषित pipet सुझावों में से निपटान ले लो. 10% ब्लीच समाधान के साथ किसी भी वायरस दूषित सतहों कीटाणुरहित.
- उपकला आरंभ संदंश के साथ एक दूसरे से दूर करने के लिए उन्हें एक साथ चिपके से रोकने के लिए और उन्हें प्लेट के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति ले जाएँ. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए वायरल मीडिया में आरंभ सेते हैं. ऊष्मायन के दौरान आरंभ अलग, अगर वे करीब एक साथ चलते हैं. अत्यधिक कमाल या आंदोलन ग्रंथियों पेड़ों का झुरमुट एक साथ करने की अनुमति देगा.
- ऊष्मायन के बाद, धीरे वायरल युक्त मीडिया को दूर करने और उचित त्यागें, देखभाल करने के लिए r बाधित नहींudiments. DMEM/F12 + कलम strep के 200 μl जोड़ें. इस धोने में कम से कम दो बार दोहराएँ और DMEM/F12 + कलम strep मीडिया के 200 μl के साथ बदलें. इन washes कि दृढ़ता से उपकला से जुड़ा नहीं है किसी भी वायरस को हटाने और mesenchyme के संक्रमण को रोकने के लिए महत्वपूर्ण हैं.
- 2% DMEM/F12 की 200 मिलीलीटर युक्त उपकला आरंभ सेते (v / v) Matrigel (बी.डी. बायोसाइंसेज, +३५६२३१) 20 मिनट के लिए. हम पाते हैं कि Matrigel में इस छोटे ऊष्मायन संस्कृति प्रारंभिक अवधि के दौरान कम से कम मौजूदा clefts का प्रतिगमन, लेकिन इस कदम के साथ समाप्त किया जा सकता है अगर Matrigel के लिए जोखिम नहीं वांछित है.
4 recombined SMGs के पूर्व vivo संस्कृति
- प्रत्येक आरंभ, एक एक समय में, एक पूर्व गीला 200 μl विंदुक टिप एक नोकदार (छोटे से कट) के शीर्ष पर, का उपयोग कर रखें 13 मिमी, 0.1 ट्रैक नक़्क़ाशी Nuclepore झिल्ली (वाटमान) फिल्टर सुक्ष्ममापी संस्कृति मीडिया के 200 μl (पर तैरते 5 आरंभ / एक गिलास तली microwell प्लेट में फिल्टर). सम्वर्ध माध्यमहै: DMEM/F12 + कलम strep 50 ग्राम / मिलीलीटर transferrin और 150 ascorbic छ / मिलीलीटर एसिड, जैसा कि पहले 2,8 वर्णित युक्त. Transferrin के लिए अस्तित्व को प्रोत्साहित करने के लिए जाना जाता है और लार ग्रंथि और अन्य अंग explants 9 morphogenesis शाखाओं में बंटी. Ascorbic एसिड के अलावा करने के लिए SMG शाखाओं को प्रोत्साहित करने के लिए दिखाया गया है 10. यह चयापचय मार्ग (जैसे कोलेजन फाइबर के निर्माण के दौरान 11 प्रोलाइन hydroxylation के रूप में) के कई hydroxylation प्रतिक्रियाओं में एक cofactor के रूप में कार्य करने के लिए जाना जाता है और भी अन्य अंग explants में fibronectin और laminin उत्पादन को बढ़ावा देने 12.
- प्रत्येक उपकला आरंभ जोड़ने के बाद संभव के रूप में फिल्टर के शीर्ष पर ज्यादा मीडिया के रूप में निकालें. फिल्टर के शीर्ष पर बहुत ज्यादा मीडिया फिल्टर सिंक करने के लिए कारण है, जबकि कम मीडिया आरंभ की नियुक्ति करता है और बहुत आसान mesenchyme. अतिरिक्त मीडिया एक विंदुक टिप के साथ या संदंश का उपयोग करने के लिए सुझावों के बीच मीडिया को पकड़ के द्वारा भी हटाया जा सकता है.
- प्लेस mesenchyme टुकड़े fro व्युत्पन्नमीटर ऊपर और / या प्रत्येक उपकला आरंभ के आसपास तीन से चार ग्रंथियों. किसी भी अतिरिक्त मीडिया निकालें कि ग्रंथियों के आसपास है mesenchyme के आंदोलन से बचने के आरंभ से दूर. अधिक ग्रंथियों से प्राप्त mesenchyme के लिए फायदेमंद नहीं है, लेकिन कम उपकला आरंभ विकास के लिए हानिकारक हो सकता है.
- एक humidified इनक्यूबेटर (95% हवा / 5% सीओ 2) में recombined SMGs 37 डिग्री सेल्सियस पर 48 -72 घंटे के लिए सेते हैं, के रूप में वांछित.
- Brightfield और / या 0 घंटा में रहते ग्रंथियों के चित्र फ्लोरोसेंट (यदि वांछित), पुनर्संयोजन के बाद 2 घंटा और एक औंधा, ईमानदार, या स्टीरियो प्रकाश माइक्रोस्कोप एक डिजिटल कैमरे का उपयोग कर एक 4X या 5X बढ़ाई उद्देश्य के साथ फिट पर हर 24 घंटा तत्पश्चात मोल देखने का एक भी फ्रेम में पूरे recombined ग्रंथि पर कब्जा. लार ग्रंथि की छवियों या तो brightfield सेटिंग या उचित चरण अंगूठी प्रकाश पथ (जो पूरी तरह से स्वचालित सूक्ष्मदर्शी पर संभव नहीं है) में भाग रास्ता रखा का उपयोग विपरीत दिखाते हैं. मानक चरण के विपरीत नहीं हैआवश्यक टी के बाद से ग्रंथि मोटी है और इसके विपरीत बनाता है.
- वांछित समय अंक, recombined SMGs 1X पीबीएस में 2% paraformaldehyde (पीएफए) 5 (w / v)% sucrose (बेहतर में कोशिकाओं रखने के द्वारा आंतरिक सेलुलर संरचना की रक्षा युक्त बनाया लगानेवाला समाधान के साथ 20 मिनट के लिए निर्धारित किया जा सकता है एक isosmotic राज्य). विपरीत 4% पीएफए, 2% पीएफए GFP संकेत की एक महत्वपूर्ण राशि की रक्षा अगर लगानेवाला निर्धारण के बाद पूरी तरह से हटा दिया जाता है. ग्रंथियों अप करने के लिए 1 सप्ताह संग्रहित किया जा सकता है 4 में अंधेरे में 1X पीबीएस में डिग्री सेल्सियस तक पूरे माउंट immunocytochemistry और confocal इमेजिंग प्रदर्शन किया है, के रूप में पहले से सूचना दी 3,6,13-15. आदर्श रूप में, immunocytochemistry और इमेजिंग निर्धारण के बाद जल्द ही किया जाना चाहिए करने के लिए बेहतरीन गुणवत्ता के चित्र प्राप्त कर सकते हैं. ग्रंथियों भी पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण द्वारा पीछा एसडीएस पृष्ठ के लिए RIPA बफर में lysed जा सकता है.
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Representative Results
प्रमुख प्रयोगात्मक कदम का प्रवाह चित्र 1 में उल्लिखित है. एक अक्षुण्ण SMG, एक अलग उपकला आरंभ, और अपनी इसी mesenchyme का एक उदाहरण चित्रा 2 में दिखाया जाता है. Recombined SMGs, जो morphogenesis शाखाओं में बंटी जब संकेत समय के लिए संवर्धित पूर्व vivo, 3 चित्र में दिखाया जाता है गुजरना जारी की Brightfield छवियों recombined उपकला GFP व्यक्त 48 घंटा के लिए हो ग्रंथियों 4 चित्र में दिखाया जाता है. Recombined SMGs के confocal छवियों और तय imaged संस्कृति में 72 घंटा immunocytochemistry द्वारा पीछा के बाद, चित्रा 5 में दिखाया जाता है. उपकला मार्कर, ई cadherin, GFP-व्यक्त आसपास mesenchyme उपकला सेल आबादी demarcates. तहखाने झिल्ली प्रोटीन, perlecan, उपकला की परिधि में स्थानीय की जांच recombined ग्रंथियों में तहखाने झिल्ली के कम से कम आंशिक पुनर्गठन दर्शाता एफ.6 igure. सहानुकंपी अवअधोहनुज ganglia neurite परिणाम से गुजरना और पुनर्संयोजन संस्कृतियों में ग्रंथियों के रूप में पहले दिखा अंदर आना 19.
चित्रा 1 (ए) फ़्लोचार्ट और (बी) योजनाबद्ध प्रमुख प्रयोगात्मक कदम चित्रण.
चित्रा 2. Brightfield की छवियों (ए) एक पूरी भ्रूण 13 दिन (E13) लार ग्रंथि sublingual ग्रंथि (SL महामारी) उपकला और अवअधोहनुज ग्रंथि (SMG महामारी) उपकला mesenchyme (एमईएस) से घिरा हुआ दिखा. (बी) पृथक उपकला आरंभ, और (सी) mesenchyme से अलग है. स्केल सलाखों = 100 सुक्ष्ममापी.
पृष्ठ> = "हमेशा" 
चित्रा 3. Brightfield उपकला आरंभ की छवियों (सफेद धराशायी लाइनों द्वारा उल्लिखित) mesenchyme संकेत समय के लिए पूर्व vivo संस्कृति में हो टुकड़े से घिरा हुआ है. उपकला कोशिकाओं morphogenesis शाखाओं में बंटी से गुजरना और mesenchymal संक्षेपण संस्कृति में 24 घंटे के रूप में जल्दी के रूप में स्पष्ट है. स्केल सलाखों = 100 सुक्ष्ममापी
चित्रा 4. Brightfield (A), (बी) फ्लोरोसेंट और recombined SMGs जिसमें केवल उपकला कोशिकाओं (सफेद धराशायी लाइनों में उल्लिखित) GFP-व्यक्त करने और 48 घंटे के लिए सुसंस्कृत पूर्व vivo adenovirus से संक्रमित थे मढ़ा छवियों (सी). स्केल सलाखों = 100 सुक्ष्ममापी.
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चित्रा 5 Confocal recombined (ए) नाभिक (DAPI, नीले), adenoviral GFP (हरा), उपकला मार्कर के साथ लेबल SMGs या छवियों brightfield छवियों (बीएफ). ई cadherin (लाल), पैमाने सलाखों = 250 सुक्ष्ममापी, या, (बी) के नाभिक (DAPI, नीले) (, adenoviral (हरा) GFP, उपकला मार्कर, ई cadherin (लाल), और तहखाने झिल्ली मार्कर, Perlecan सियान), पैमाने सलाखों = 50 सुक्ष्ममापी. सफेद लाइनें रूपरेखा उपकला डैश्ड. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 6 सहानुकंपी अवअधोहनुज ganglia neurite परिणाम से गुजरना और पुनर्संयोजन संस्कृतियों, पैमाने बार = 250 सुक्ष्ममापी में ग्रंथियों अंदर आना.
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Discussion
पूर्व vivo उपकला-mesenchymal पुनर्संयोजन तकनीक पहली बार 16 1981 में अवअधोहनुज लार ग्रंथियों के लिए प्रकाशित किया गया था. इस प्रोटोकॉल में, हम मूल विधि पर विस्तार, adenoviral संक्रमण का उपयोग करने के लिए एक recombined ग्रंथि के संदर्भ में उपकला सेल जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर. हम बताते हैं कि उपकला कोशिकाओं के एक प्रतिशत adenovirus से संक्रमित हैं, जबकि कोशिकाओं है कि संक्रमित प्रतिशत वायरल प्रमोटर के गुण, वायरल titer, और वायरल शुद्धता पर निर्भर करता है. हमने पाया है कि यह कुशल उपकला पारगमन, जो यहाँ नहीं वर्णित है शुद्धि के लिए CsCl ढाल शुद्ध वायरस का उपयोग करने के लिए आवश्यक है. चूंकि हम भी पुनर्संयोजन (नहीं दिखाया डेटा) पहले mesenchyme कोशिकाओं को संक्रमित कर दिया गया है, mesenchymal जनसंख्या का स्वतंत्र आनुवंशिक हेरफेर भी संभव है. हमने हाल ही में इस adenoviral पुनर्संयोजन / अभिकर्मक ऊतक विधि का इस्तेमाल करने के लिए एक भूमिका की पहचानpolarity प्रोटीन, par-1b के लिए, लार ग्रंथियों के विकास में उपकला तहखाने झिल्ली के स्थान के नियंत्रण में है. Kinase मृत adenovirus par-1b और जंगली प्रकार adenovirus बराबर 1b दोनों इस अध्ययन में 13 इस्तेमाल किया गया उपकला आरंभ संक्रमित और E13 mesenchymes साथ recombined. उत्परिवर्ती वायरस का उपयोग करने के लिए विशेष के अणुओं के कार्यों की पूछताछ करने की क्षमता बहुत इस पद्धति की उपयोगिता को बढ़ाता है.
वर्तमान में प्रभावी औजार के एक कमी mesenchymal डिब्बे को प्रभावित किए बिना बरकरार भ्रूण लार ग्रंथियों में उपकला सेल आबादी के भीतर विशिष्ट अणु लक्ष्य है. हालांकि कई अध्ययनों औषधीय inhibitors का इस्तेमाल किया है बरकरार अंग संस्कृतियों में संकेत पारगमन में हेरफेर करने के लिए, इन inhibitors दोनों उपकला और mesenchyme को प्रभावित करते हैं. सीधे उपकला पर inhibitors के प्रभाव का आकलन करने के लिए, या तो Matrigel ओ में उपकला आरंभ mesenchyme के अभाव में संवर्धित किया जाना चाहिएr laminin 111 6,7 जैल. लघु निरोधात्मक RNAs (siRNAs) उपकला जीन की अभिव्यक्ति नीचे विनियमित के बाद siRNAs preferentially उपकला कोशिकाओं द्वारा कर रहे हैं सबसे लिपिड 13,14,17,18 वाहक की उपस्थिति में लिया करने के लिए एक प्रभावी तरीका है. लेकिन, न तो प्रोटीन का स्तर या समारोह के साथ हस्तक्षेप करने के लिए इन तरीकों में से एक जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती जीन की overexpression की अनुमति देते हैं. कि केवल उपकला कोशिकाओं की एक छोटी संख्या (एमएल, अप्रकाशित डेटा) लक्षित किया जा सकता भ्रूण पूरे SMG संस्कृतियों के पारंपरिक (गैर वायरल) अभिकर्मक पर प्रयास सीमित सफलता के साथ मिले हैं. इसकी तुलना में, adenoviral पारगमन विशेष रूप से लार उपकला कोशिकाओं transfecting के लिए एक प्रभावी तरीका का प्रतिनिधित्व करता है.
सहानुकंपी तंत्रिकाओं को हाल ही में एक केरातिन पूर्वज 5 सकारात्मक सेल 19 जनसंख्या को बनाए रखने के द्वारा सामान्य लार ग्रंथि शाखाओं में बंटी के लिए महत्वपूर्ण हो दिखाया गया है. एमईएस पर इस ऊतक पुनर्संयोजन विधि का एक फायदा यहenchyme मुक्त उपकला आरंभ संस्कृति विधि है कि parasympathetic नाड़ीग्रन्थि पुनर्संयोजन संस्कृति प्रणाली में बनाए रखा जा सकता है. Parasympathetic नाड़ीग्रन्थि है, जो प्राथमिक उपकला वाहिनी 19 सटे mesenchyme में स्थित है के अनुमानित स्थान के सावधान ट्रैक रखने, यह संभव है कि यह सुनिश्चित करें कि प्रत्येक आरंभ एक नाड़ीग्रन्थि साथ जुड़े किया जा रहा समाप्त होता है. हालांकि, हम पाते हैं कि 3-4 हर उपकला आरंभ के साथ mesenchymes के लायक ग्रंथियों के संयोजन से, प्रत्येक आरंभ करने के लिए कुछ हद तक (6 चित्रा) कलियों अंदर आना पर्याप्त नाड़ीग्रन्थि के साथ जुड़ा हुआ है, हालांकि नहीं हमेशा बरकरार असंशोधित में के रूप में एक ही है, ग्रंथियों.
बरकरार ग्रंथि के संदर्भ में उपकला संक्रमण के लिए वैकल्पिक तरीके हैं. हम पहले की रिपोर्ट है कि microinjection उपकला कोशिकाओं में बरकरार 20,21 ग्रंथियों में adenovirus लागू करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, microinjection contr मुश्किल हैराजभाषा, शारीरिक ग्रंथियों को नुकसान पहुंचा सकता है और आम तौर पर केवल 20 कोशिकाओं के एक स्थानीय सबसेट के संक्रमण की ओर जाता है. एडिनो - जुड़े वायरस (AAV) बरकरार SMG अंग explants 22 के संदर्भ में अलग सेल आबादी के अभिकर्मक के लिए उपयोगी होना दिखाया गया है. सीरोटाइप scAAV2 अन्य पुनः संयोजक AAV वैक्टर 23 पर बरकरार SMGs के उपकला के विशिष्ट पारगमन में काफी अधिक कुशल होना दिखाया गया था. चूंकि AAVs व्यापक रूप से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं और न ही विशेषज्ञता AAV मौजूद ज्यादातर प्रयोगशालाओं में तैयार करने के लिए करता है, adenoviral पारगमन और ऊतक पुनर्संयोजन प्रोटोकॉल यहाँ प्रदान की है और आम तौर पर ज्यादातर प्रयोगशालाओं को सुलभ से AAV वैक्टर का उपयोग है.
कुछ हद तक इस ऊतक पुनर्संयोजन विधि recapitulates बातचीत उपकला-mesenchymal हालांकि, यह भी संभव है adenovirus साथ उपकला संक्रमित हैं और फिर अपने मूल संदर्भ के बाहर उपकला बढ़ने.जैसा कि पहले उल्लेख किया है, हम adenovirus के साथ बरकरार लार उपकला आरंभ संक्रमित और फिर exogenously जोडी विकास 17,20,21 कारकों के साथ Matrigel में संस्कृतियों बढ़ी. लार ग्रंथि अंग explants भी nanofiber scaffolds पर संवर्धित किया जा सकता है, हालांकि इन scaffolds उनके वर्तमान रूप में 15 mesenchyme का पूरा समारोह नहीं पुनरावृत्ति करना. जबकि इन तरीकों देशी mesenchyme recapitulates की न तो, इस तरह के तरीकों पूर्व vivo संस्कृति में mesenchyme के विशिष्ट गुणों की नकल के लिए अनुमति देते हैं.
प्रत्येक पूर्व vivo संस्कृति विधि के अपने फायदे और नुकसान है, लेकिन विशिष्ट वैज्ञानिक सवालों को संबोधित करने के लिए लागू है. जबकि recombined ग्रंथियों के रूप में ज्यादा morphogenesis शाखाओं में बंटी के रूप में बरकरार लार ग्रंथि अंग explants, सामान्य रूप में अंग explants, गुजरना नहीं है, केवल कुछ दिनों के लिए vivo morphogenesis शाखाओं में बंटी में पुनरावृत्ति करना. पाठ्यक्रम के रचनात्मक करने के लिए इस समस्या का एक समाधान हैट्रांसजेनिक उपकला डिब्बे के भीतर लक्षित जीन अभिव्यक्ति युक्त जानवरों खाया. के बाद से वहाँ कि जल्दी SMG उपकला के विकास में विशेष रूप से सक्रिय कर रहे हैं, और ट्रांसजेनिक प्रौद्योगिकी काफी अधिक वर्णित तरीकों की तुलना में महंगा रहता ज्ञात प्रमोटरों की एक कमी है, ऊतक पुनर्संयोजन यहाँ वर्णित प्रयोगों एक व्यवहार्य मॉडल प्रणाली का गठन करने के लिए दोनों उपकला और mesenchymal सेल अध्ययन में संकेत जल्दी उनके ऊतक संदर्भ के भीतर लार ग्रंथि कोशिकाओं के विकास.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों के लिए उपयोगी टिप्पणी के लिए और पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए डॉ. डायड्री नेल्सन का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. इस काम NIH DE019244 अनुदान, DE019197, और DE021841 एमएल, F32DE02098001 SJS को, और Albany पर विश्वविद्यालय, SUNY RR015464 C06 द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/Ham's F12 Medium without phenol red | Life Technologies | 21041-025 | |
| Penicillin and Streptomycin | Life Technologies | 15070-163 | 10X stock |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | Freeze single use aliquots at -20C |
| BSA | Sigma | A2934-100G | Fraction V, low endotoxin |
| Adeno-X-GFP | BD Biosciences | 8138-1 | Should be high titer (1x1010 pfu/ml). CsCl purified viruses are more effective than column-purified viruses in this assay. |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 2% in PBS with 5% sucrose (w/v) |
| 1X Phosphate-buffered saline (PBS) | Life Technologies | 70011-044 | Prepared from 10X stock |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14175095 | no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red |
| Transferrin | Sigma | T8158 | 25 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media. Freeze single-use aliquots at -20C |
| L- Ascorbic acid (Vitamin C) | Sigma | A4403 | 75 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media.Freeze single-use aliquots at -20C |
| Table 1. List of reagents required for SMG recombination protocol. | |||
| 10 cm sterile plastic dishes | Corning | 430167 | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| Stereo dissecting microscope with transmitted light base | Nikon | SMZ645 | Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base. |
| 35 mm tissue culture dishes | Falcon | 353001 | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| 50 mm diameter microwell dishes | MatTek Corporation | P50-G-1.5-14F | |
| Nuclepore Track-Etch membrane filters | Whatman | 110405 | 13 mm diameter, 0.1 mm pore size |
| Widefield fluorescence microscope | Carl Zeiss, USA | Axio Observer Z1 | Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera. |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used. |
| Timed-pregnant female mice, strain CD-1 or ICR | Charles River Labs | Embryos are harvested on day 13 (with day of plug discovery designated as day 0). | |
| Scalpel blade #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Dumont #5 forceps inox alloy, 0.05mm X 0.02mm | Fine Science Tools | 11252-20 | Ideal for harvesting glands from embryos |
| Dumont #5 forceps dumostar alloy, 0.05mm X 0.01mm | Fine Science Tools | 11295-20 | Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used. |
| Table 2. Equipment used in SMG recombination protocol. | |||
References
- Tucker, A. S.
- Sakai, T., Onodera, T.
- Patel, V. N., Rebustini, I. T., Hoffman, M. P.
- Sequeira, S. J., Larsen, M., DeVine, T. Extracellular matrix and growth factors in salivary gland development. Frontiers of oral biology. 14, 48-77 (2010).
- Zheng, C., et al. Transient detection of E1-containing adenovirus in saliva after the delivery of a first-generation adenoviral vector to human parotid gland. J. Gene Med. 12, 3-10 (2010).
- Larsen, M., et al. Role of PI 3-kinase and PIP3 in submandibular gland branching morphogenesis. Developmental biology. 255, 178-191 (2003).
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