Summary
Техника генетически манипулировать эпителиальных клеток в целом
Protocol
Протокол содержит четыре основных шага, как показано на рисунке 1. Все действия описаны во всех подробностях. Строительство аденовирус и вирусных очистки должны быть выполнены до начала извлечения органов для использования в генетической трансдукции расчлененный эпителиальные зачатки. Все стандартные BSL-2 Меры предосторожности следует соблюдать при работе с аденовирусов.
1. Мышиных эмбриональных подчелюстной железы (SMG) Сбор и Microdissection
- Усыпить тайм-беременным самкам мышей (беспородных штамм CD-1 или ICR) с использованием CO 2 наркоза, а затем путем смещения шейных позвонков и урожай строк эмбрионов мыши на эмбриональный день 13 (E13, 3-5 эпителия почек) следующих процедур, утвержденных институциональных IACUC комитет. В день открытия вагинальный плагин предназначен как E0. Слюнных желез также может быть собран и культивировали при E12 стадии, когда есть один основной бутон и стебель с трещинами только начинаетсяинициировать. SMGs до этой стадии требуют различных условий культуры, чем указано здесь.
- Перенос эмбрионов строк в стерильные 10 см культуре тканей блюда заполнены 25 мл DMEM / Хэма "с F12 Medium (F12) отсутствие фенола красного (Life Technologies) с добавлением 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина (ручка-стрептококк, Life Technologies).
- Используя стерильный скальпель (# 11 лезвий) и щипцы (# 5, Fine Инструменты наук, 11252-20), удалить эмбрионы из мешков в отдельное блюдо 10 см, содержащий 25 мл DMEM/F12 + ручка-стрептококк.
- Север эмбриона головы с угловой разрез чуть ниже нижней челюсти.
- Изолировать нижней челюсти с головы под стерео рассекает микроскопом с передаваемой базы света (Nikon SMZ645 или эквивалент) с помощью разреза ниже верхней челюсти. Поместите тканей на вершине лишний кусок стекла, а не непосредственно на стекло компонентов микроскопа базы.
- Сбор нижней челюсти в 3 мл DMEM/F12 + ручка-стрептококковая в стерильный 35 мм блюдо культуры ткани.
- Поместите кусочек нижней челюсти рассекая на столике микроскопа так, что язык находится на нижней части среза, но направлен в сторону от 12:00 часов.
- Используя одну сторону из двух скрещенных щипцами в движение ножницами, удалить и уничтожить ниже 1/3 от нижней челюсти срез.
- Поверните срез на 90 ° вправо (если правша) и, пользуясь ножницами разрез с помощью пинцета, вырезать верхнюю часть нижней челюсти срез (без разрезания языка) на полпути в срез.
- Очистите от избыточной ткани и удалить его, чтобы разоблачить пистолетов-пулеметов под ним. Там будет один на каждой стороне у основания языка.
- Используя одну пару щипцов, чтобы удерживать ткань языка, использовать другие щипцы, чтобы дразнить SMG от языка. Повторите эти действия для других желез.
- Сбор микродиссекции слюнных желез в 3 мл DMEM/F12 + ручка-стрептококковая в новом стерильном 35 мм тканейкультуры блюдо. Примечание: чем больше подчелюстных желез (3-5 эпителиальные почки) вместе с подключенной меньше сублингвального железы (1 почка) можно культивировать нетронутыми, пропуская к шагу 4 и выполняя шаги 4.1, 4.3, и 4.4, как описано выше 2,8.
2. SMG Эпителиальные Разделение Рудимент
- Место 5 (или более) слюнные железы в стакан дном, диаметром 50 мм микролуночные блюдо (Маттек Corporation, P50G-1.5-14-F), содержащие 200 мкл сбалансированный солевой раствор Хенкса (HBSS не хватает Ca + + и Mg + +, Life Technologies), содержащей 0,4% (V / V) диспазы (Life Technologies, кот. нет. 17105-041) и инкубировать в течение 15 мин при 37 ° C.
- После инкубации, используя стерильные 200 мкл кончика пипетки, тщательно аспирации из диспазы решение, не нарушая желез. Сразу добавить 200 мкл DMEM/F12 средах, содержащих 5% (вес / объем) BSA (DMEM/F12-BSA, предварительно стерилизованные с 0,22 мкм), чтобы нейтрализовать диспазы. <li> Под рассекает микроскопом, с помощью пары щипцов с тонкими советы (# 5 Dumostar, Fine Инструменты наук, 11295-20), аккуратно отделить ослабил мезенхимы со всего SMG эпителия почек и каналов, заботясь, чтобы оставить нетронутыми эпителия .
- Предварительно мокрой стерильные 200 мкл кончика пипетки с DMEM/F12-BSA СМИ и осторожно пипеткой из эпителиальных зачатков в новом диаметром 50 мм микролуночные блюда, содержащие 200 мкл DMEM/F12 + ручка-стрептококк. Используйте высококачественный 200 мкл кончика пипетки с гладким краем.
- В блюдо, которое содержит мезенхимы частей, отказаться от любого не-мезенхимальных тканей, включая подъязычных желез и любой отдельный подчелюстной железы почки.
3. Аденовирусной инфекции эпителиальных зачатков
- Сделать 200 мкл вирусной инфекции СМИ путем разбавления аденовирус интерес к DMEM/F12 + ручка-стрептококковая в микроцентрифуге трубку так, что титр полученного раствора составляет 1x10 8 -10 9 Pfus.оптимальных титр, необходимых для различных вирусов могут отличаться. Важно использовать хлорид цезия (CsCl)-очищенных вирусных препаратов для оптимальной эффективности поглощения.
- Удалите носитель из блюдо, содержащее пять эпителиальные зачатки. Быстро добавить 200 мкл инфекции СМИ, сохраняя рудименты мокрого во все времена. Принять необходимые меры предосторожности при обращении с вирусом и утилизации загрязненного советы пипетки. Лечить любого вируса загрязненными поверхностями с 10% раствором хлорной извести.
- Переместить эпителиальные зачатки далеко друг от друга с помощью пинцета, чтобы предотвратить их слипание и позволит им оседать на дно тарелки. Инкубируйте зачатки вирусной средствах массовой информации в течение 1 часа при комнатной температуре. Во время инкубации, отделить зачатки, если они движутся близко друг к другу. Чрезмерное качалке или движения позволит желез слипаются.
- После инкубации аккуратно удалить вирусные содержащих средства массовой информации и отказаться соответственно, заботясь, чтобы не нарушить гudiments. Добавить 200 мкл DMEM/F12 + ручка-стрептококк. Повторите это мыть по крайней мере, еще два раза и заменить 200 мкл DMEM/F12 + ручка-стрептококковая СМИ. Эти моет являются критическими удалять любой вирус, который не сильно привязаны к эпителия и, чтобы предотвратить инфекцию мезенхимы.
- Инкубируйте эпителиальных зачатков 200 мл DMEM/F12, содержащий 2% (V / V) Matrigel (BD Biosciences, 356231) в течение 20 мин. Мы считаем, что этот короткий инкубационный в Matrigel сводит к минимуму регресс существующих трещин в начальный период культурой, но этот шаг может не производиться при воздействии Matrigel не требуется.
4. EX VIVO культуры рекомбинированные SMGs
- Место каждого зачатка, по одному за раз, используя предварительного увлажнения 200 мкл кончика пипетки, на вершине зубчатый (небольшой разрез) 13 мм, 0,1 мкм Nuclepore трек-Etch мембранный фильтр (ватман) плавают более 200 мкл культуральной среды ( 5 зачатки / фильтр) в стеклянным дном пластины микролуночные. Медиакультурыявляется: DMEM/F12 + ручка-острый, содержащей 50 мкг / мл трансферрина и 150 мкг / мл аскорбиновой кислоты, как описано выше 2,8. Трансферрин как известно, стимулирует выживание и морфогенеза ветвления слюнных желез и других эксплантов органа 9. Добавление аскорбиновой кислоты было показано, чтобы стимулировать ветвление SMG 10. Известно, что он действует в качестве кофактора во многих реакциях гидроксилирования метаболических путей (например, гидроксилирование пролина в формировании коллагеновых волокон 11), а также стимулирует фибронектин и ламинин производства в других эксплантов органа 12.
- Удалить столько средств массовой информации в верхней части фильтра, как после добавления каждого эпителиального зачатка. Слишком много средств массовой информации в верхней части фильтра может привести фильтра тонуть, а меньше средств массовой информации делает размещение зачатки и мезенхимы гораздо проще. Избыточные средства массовой информации могут быть удалены либо с кончика пипетки или с помощью щипцов для захвата средств массовой информации между советами.
- Место части мезенхимы, полученных сюдам 3:57 железы на верхней и / или вокруг каждого эпителиального зачатка. Извлеките все дополнительные средства массовой информации, которые окружающие железы, чтобы избежать движения мезенхимы от рудиментов. Мезенхимы выведены из более желез не выгодно, но менее может быть вредно для роста эпителиальных зачатков.
- Инкубируйте рекомбинированные пистолетов-пулеметов в увлажненном инкубаторе (95% воздуха / 5% CO 2) при 37 ° С в течение 48 -72 часов, как хотелось бы.
- Приобретать светлого и / или флуоресцентных изображений живых железы в 0 часов (по желанию), 2 часа после рекомбинации и каждые 24 часа после этого на перевернутую, в вертикальном положении, или стерео световой микроскоп снабжен цифровой камеры с использованием 4х или 5-кратным увеличением целью захватить весь рекомбинированные железы в одном кадре зрения. Изображения слюнных желез показать лучший контраст либо с помощью установки светлого или соответствующего кольца фазы помещен часть пути на свет путем (что невозможно на полностью автоматизированных микроскопов). Стандартный фазового контраста нетт необходимо, поскольку железы толстая и создает контраст.
- В нужное время точки, рекомбинированные пистолетов-пулеметов может быть исправлена в течение 20 минут с фиксирующим раствором, приготовленным из 2% параформальдегида (PFA) в 1X PBS, содержащем 5% (вес / объем) сахарозы (чтобы лучше сохранить внутреннюю клеточную структуру, сохраняя клетки isosmotic состоянии). В отличие от 4% PFA, PFA 2% позволит сохранить значительное количество сигнал GFP, если фиксатор полностью удаляется после фиксации. Железы можно хранить до 1 недели в 1X PBS в темноте при 4 ° С до целого иммуноцитохимия крепления и конфокальной микроскопии осуществляется, как сообщалось ранее 3,6,13-15. В идеале, иммуноцитохимия и изображения должны быть выполнены вскоре после фиксации для получения наилучшего качества изображения. Железы могут быть также лизировали в буфере RIPA для SDS-PAGE с последующим вестерн-блоттинга анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Поток из основных экспериментальных шагов указаны на рисунке 1. Пример нетронутыми SMG, изолированных эпителиальных зачатков, и соответствующий мезенхимы показано на рисунке 2. Светлое изображение рекомбинированных пистолетов-пулеметов, которые продолжают подвергаться морфогенеза ветвления при культивировании естественных бывших в указанное время, показаны на рисунке 3. Рекомбинированные железы выросла на 48 часов выражения эпителиального GFP показано на рисунке 4. Конфокальной изображения рекомбинированные SMGs фиксированной и отображаемого После 72 часов в культуре следует иммуноцитохимия, показаны на рисунке 5. Эпителиальных маркеров, E-кадгерин, разграничивает GFP-экспрессирующих эпителиальных популяции клеток из окружающей мезенхимы. Обнаружение белков базальной мембраны, perlecan, локализован на периферии эпителия свидетельствует хотя бы частичного восстановления базальной мембраны в рекомбинированные желез. Figure 6. Парасимпатическая подчелюстные узлы подвергаются аксонов и иннервируют железы в рекомбинации культур, как показано ранее 19.
Рисунок 1. (A) и блок-схемы (B) Схема изображающие основные экспериментальные шаги.
Рисунок 2. Светлое изображений (A) целый день эмбрионального развития 13 (E13) слюнные железы показывает сублингвального эпителия железы (SL Epi) и подчелюстные железы эпителия (SMG Epi), окруженный мезенхимы (MES). (B) Изолированные эпителиального зачатка, и (C) Отдельно мезенхимы. Шкала баров = 100 мкм.
В-страница = "Всегда"> 
Рисунок 3. Светлое изображений эпителиальных зачатков (они изложены белыми пунктирными линиями), окруженные мезенхимой частей, выращенных в культуре бывших естественных условиях для указанных раза. Эпителиальные клетки подвергаются морфогенеза ветвления и мезенхимальных конденсации очевидно, уже в 24 часов в культуре. Шкала баров = 100 мкм
Рисунок 4. Светлое (A), люминесцентные (B) и выложил (C) изображения рекомбинированные пистолетов-пулеметов, в котором только эпителиальные клетки (они изложены в белой пунктирной линией) были инфицированы GFP-экспрессирующих аденовируса и культурных естественных бывший в течение 48 часов. Шкала баров = 100 мкм.
highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50060/50060fig5.jpg "/>
Рисунок 5. Конфокальной изображения или светлого изображения (BF) рекомбинированных SMGs помечены (A) ядер (DAPI, синий), аденовирусная GFP (зеленый), эпителиальных маркеров. E-кадгерина (красный), масштабные линейки = 250 мкм, или, (B) ядер (DAPI, синий), аденовирусная GFP (зеленый), эпителиальных маркеров, E-кадгерин (красный), и маркер базальной мембраны, Perlecan ( голубой), масштаб баров = 50 мкм. Штриховые белый контур линии эпителия. Нажмите здесь, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 6. Парасимпатической подчелюстные узлы подвергаются аксонов и иннервируют железы в рекомбинации культуры, масштабной линейки = 250 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Экс естественных эпителиальных мезенхимальных рекомбинации техника была впервые опубликована в подчелюстной слюнной железы в 1981 16. В этом протоколе, мы расширяем на оригинальный метод, с помощью аденовирусной инфекции манипулировать эпителиальные клетки экспрессии генов в контексте рекомбинированные железы. Мы показали, что процент эпителиальных клеток, инфицированных аденовирус, в то время как процент клеток, которые заражены зависит от свойств вирусного промотора, титр вируса, и вирусный чистоты. Мы обнаружили, что это необходимо использовать градиент CsCl-очищенных вирусов для эффективной эпителиальных трансдукции, очищение, которое не описано здесь. Поскольку мы также смогли инфицировать клетки мезенхимы до рекомбинации (данные не представлены), независимые генетические манипуляции мезенхимальных населения также возможно. Недавно мы использовали это аденовирусная трансфекции / ткани рекомбинации метод определения ролиза полярностью белка, PAR-1b, в контрольной размещения базальной мембраны эпителия в развивающихся слюнных желез. Kinase-мертвые PAR-1b аденовируса и дикого типа PAR-1b аденовирус оба были использованы в данном исследовании 13 до заражают эпителиальные зачатки и объединены с E13 mesenchymes. Возможность использования вирусов-мутантов, чтобы допросить функции специфических молекул значительно повышает полезность этого метода.
Существует в настоящее время отсутствия эффективных инструментов для решения конкретных молекул в эпителиальной клеточной популяции в интактных эмбриональных слюнных желез, не влияя на мезенхимальные отсека. Несмотря на многочисленные исследования использовали фармакологических ингибиторов манипулировать сигнала в интактной культуре органа, эти ингибиторы влияют как на эпителия и мезенхимы. Чтобы непосредственно оценить эффект ингибиторов на эпителий, эпителиальные зачатки должны культивировать в отсутствие мезенхимы в любом Matrigel оГ ламинин-111 гели 6,7. Малый ингибирующие РНК (siRNAs) являются эффективным методом подавляют экспрессию гена эпителиальных, так как siRNAs, предпочтительно, рассмотрен эпителиальных клеток в присутствии большинства липидных носителей 13,14,17,18. Тем не менее, ни один из этих методов вмешательства уровни белка или функции позволяют избыточная экспрессия дикого типа или мутантного гена. Попытки традиционных (не вирусный) трансфекции эмбриональных целые культуры SMG имели ограниченный успех в том, что лишь небольшое количество эпителиальных клеток могут быть направлены (ML, неопубликованные данные). Для сравнения, аденовирусной трансдукции представляет собой эффективный метод специально для трансфекции слюнных эпителиальных клеток.
Парасимпатические нервы недавно было показано, что решающее значение для нормального слюнных желез разветвления по поддержанию кератина 5-положительных клеток-предшественников населения 19. Преимущество этого метода рекомбинации ткани по МОНenchyme без эпителиального зачатка метод культуры является то, что парасимпатические ганглии могут быть сохранены в системе культуры рекомбинации. Сохраняя осторожность трек приблизительное расположение парасимпатические ганглии, который расположен в мезенхиме рядом с первичных эпителиальных канал 19, то можно гарантировать, что каждый зачаток заканчивает тем, что связано с ганглия. Однако мы считаем, что, объединив 3-4 желез сумму mesenchymes с каждым эпителиальные зачатки, каждый зачаток, связанные с ганглии достаточно иннервирующие почки в некоторой степени (рис. 6), хотя и не всегда так же, как в интактных немодифицированных желез.
Есть альтернативные методы для заражения эпителия в контексте интактной железы. Мы ранее сообщали, что микроинъекции может быть использована для введения аденовирусов в эпителиальные клетки в неповрежденном желез 20,21. Тем не менее, микроинъекции трудно Contrола, может физически повредить желез, и, как правило, приводит к заражению только локализованные подмножество клеток 20. Адено-ассоциированные вирусы (ААВ) было показано, быть полезным для трансфекции различных клеточных популяций в рамках нетронутыми SMG эксплантов органа 22. Серотип scAAV2 было показано, что существенно более эффективными в конкретных трансдукции эпителия интактной пистолетов-пулеметов по сравнению с другими рекомбинантные векторы AAV 23. С AAVs не являются широко коммерчески доступными, и не опыта, чтобы подготовиться AAV существуют в большинстве лабораторий, аденовирусной трансдукции и протокол ткани рекомбинации, предоставленная здесь, в более общем доступным для большинства лабораторий, чем использование векторов ААВ.
Хотя эта ткань повторяет метод рекомбинации эпителиальных мезенхимальных взаимодействия в некоторой степени, это также возможно, чтобы заразить эпителия с аденовирус, а затем рост эпителия за пределы своего родного контекста.Как упоминалось ранее, мы заражены нетронутыми слюнных эпителиальные зачатки с аденовирус, а затем вырос культур в Matrigel с экзогенно добавил факторов роста 17,20,21. Слюнных желез эксплантов орган также может быть культивировали на леса нановолокон, хотя эти леса не повторять полные функции мезенхимы в их нынешней форме 15. Хотя ни один из этих методов повторяет родной мезенхимы, такие методы позволяют для имитации определенных свойств мезенхимы в бывших культуры естественных условиях.
Каждый бывший метода культуры естественных условиях имеет свои преимущества и недостатки, но применима для решения конкретных научных вопросов. В то время как рекомбинированные железы не подвергаются столько морфогенеза ветвления как и неповрежденный слюнных желез органа эксплантов, орган эксплантов, в общем, только резюмировать в естественных условиях морфогенеза ветвления в течение нескольких дней. Решением этой проблемы является, конечно, создаели трансгенные животные, содержащие целевые экспрессии генов в эпителиальной отсека. Так как отсутствие известных промоутеров, которые активируются в частности, в раннем развивающихся SMG эпителия, и трансгенные технологии по-прежнему значительно дороже, чем описанные методы, ткани рекомбинации экспериментов, описанных здесь, представляет собой жизнеспособную модель системы для изучения как эпителиальные и мезенхимальные клетки сигнализации в рано развивается слюнных желез в клетках их тканей контексте.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Дейдра Нельсон за полезные замечания и критическое чтение рукописи. Эта работа финансировалась грантами NIH DE019244, DE019197, и DE021841 к ML, F32DE02098001 к SJS, и C06 RR015464 в университете в Олбани, штата Нью-Йорк.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/Ham's F12 Medium without phenol red | Life Technologies | 21041-025 | |
| Penicillin and Streptomycin | Life Technologies | 15070-163 | 10X stock |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | Freeze single use aliquots at -20C |
| BSA | Sigma | A2934-100G | Fraction V, low endotoxin |
| Adeno-X-GFP | BD Biosciences | 8138-1 | Should be high titer (1x1010 pfu/ml). CsCl purified viruses are more effective than column-purified viruses in this assay. |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 2% in PBS with 5% sucrose (w/v) |
| 1X Phosphate-buffered saline (PBS) | Life Technologies | 70011-044 | Prepared from 10X stock |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14175095 | no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red |
| Transferrin | Sigma | T8158 | 25 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media. Freeze single-use aliquots at -20C |
| L- Ascorbic acid (Vitamin C) | Sigma | A4403 | 75 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media.Freeze single-use aliquots at -20C |
| Table 1. List of reagents required for SMG recombination protocol. | |||
| 10 cm sterile plastic dishes | Corning | 430167 | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| Stereo dissecting microscope with transmitted light base | Nikon | SMZ645 | Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base. |
| 35 mm tissue culture dishes | Falcon | 353001 | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| 50 mm diameter microwell dishes | MatTek Corporation | P50-G-1.5-14F | |
| Nuclepore Track-Etch membrane filters | Whatman | 110405 | 13 mm diameter, 0.1 mm pore size |
| Widefield fluorescence microscope | Carl Zeiss, USA | Axio Observer Z1 | Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera. |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used. |
| Timed-pregnant female mice, strain CD-1 or ICR | Charles River Labs | Embryos are harvested on day 13 (with day of plug discovery designated as day 0). | |
| Scalpel blade #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Dumont #5 forceps inox alloy, 0.05mm X 0.02mm | Fine Science Tools | 11252-20 | Ideal for harvesting glands from embryos |
| Dumont #5 forceps dumostar alloy, 0.05mm X 0.01mm | Fine Science Tools | 11295-20 | Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used. |
| Table 2. Equipment used in SMG recombination protocol. | |||
References
- Tucker, A. S.
- Sakai, T., Onodera, T.
- Patel, V. N., Rebustini, I. T., Hoffman, M. P.
- Sequeira, S. J., Larsen, M., DeVine, T. Extracellular matrix and growth factors in salivary gland development. Frontiers of oral biology. 14, 48-77 (2010).
- Zheng, C., et al. Transient detection of E1-containing adenovirus in saliva after the delivery of a first-generation adenoviral vector to human parotid gland. J. Gene Med. 12, 3-10 (2010).
- Larsen, M., et al. Role of PI 3-kinase and PIP3 in submandibular gland branching morphogenesis. Developmental biology. 255, 178-191 (2003).
- Hoffman, M. P., et al. Gene expression profiles of mouse submandibular gland development: FGFR1 regulates branching morphogenesis in vitro through BMP- and FGF-dependent mechanisms. Development. 129, 5767-5778 (2002).
- Rebustini, I. T., Hoffman, M. P. ECM and FGF-dependent assay of embryonic SMG epithelial morphogenesis: investigating growth factor/matrix regulation of gene expression during submandibular gland development. Methods Mol. Biol. 522, 319-330 (2009).
- Partanen, A. M., Thesleff, I. Transferrin and tooth morphogenesis: retention of transferrin by mouse embryonic teeth in organ culture. Differentiation. 34, 25-31 (1987).
- Naka, T., et al. Modulation of branching morphogenesis of fetal mouse submandibular gland by sodium ascorbate and epigallocatechin gallate. In Vivo. 19, 883-888 (2005).
- Bornstein, P., Traub, W. The chemistry and biology of collagen. The Proteins. Neurath, H., Hill, R. L. 4, 3rd, Academic Press. 412-632 (1979).
- Zhou, L., Higginbotham, E. J., Yue, B. Y. Effects of ascorbic acid on levels of fibronectin, laminin and collagen type 1 in bovine trabecular meshwork in organ culture. Curr. Eye Res. 17, 211-217 (1998).
- Daley, W. P., et al. ROCK1-directed basement membrane positioning coordinates epithelial tissue polarity. Development. 139, 411-422 (2012).
- Daley, W. P., Gulfo, K. M., Sequeira, S. J., Larsen, M. Identification of a mechanochemical checkpoint and negative feedback loop regulating branching morphogenesis. Developmental biology. 336, 169-182 (2009).
- Sequeira, S. J., et al. The regulation of focal adhesion complex formation and salivary gland epithelial cell organization by nanofibrous PLGA scaffolds. Biomaterials. 33, 3175-3186 (2012).
- Nogawa, H., Mizuno, T. Mesenchymal control over elongating and branching morphogenesis in salivary gland development. Journal of embryology and. 66, 209-221 (1981).
- Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M.
- Daley, W. P., Kohn, J. M., Larsen, M. A focal adhesion protein-based mechanochemical checkpoint regulates cleft progression during branching morphogenesis. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 2069-2083 (2011).
- Knox, S. M., et al. Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. Science. 329, 1645-1647 (2010).
- Larsen, M., Wei, C., Yamada, K. M. Cell and fibronectin dynamics during branching morphogenesis. J. Cell Sci. 119, 3376-3384 (2006).
- Wei, C., Larsen, M., Hoffman, M. P., Yamada, K. M. Self-organization and branching morphogenesis of primary salivary epithelial cells. Tissue Eng. 13, 721-735 (2007).
- Zheng, C., Baum, B. J. Evaluation of viral and mammalian promoters for use in gene delivery to salivary glands. Mol. Ther. 12, 528-536 (2005).
- Hsu, J. C., et al. Viral gene transfer to developing mouse salivary glands. J. Dent. Res. 91, 197-202 (2012).
