Summary
Eine Technik, genetisch zu manipulieren Epithelzellen innerhalb der gesamten
Abstract
Branching Morphogenese tritt während der Entwicklung vieler Organe und die embryonale Maus submandibularis (SMG) ist ein klassisches Modell für die Untersuchung der Verzweigung Morphogenese. In der sich entwickelnden SMG beinhaltet dieses Verfahren iterativen Schritten von epithelialen Knospe und Kanal Formation, um letztendlich Anlass zu einem komplexen verzweigtes Netzwerk von Acini und Leitungen, die zu erzeugen und zu modifizieren / transportieren den Speichel bzw. in die Mundhöhle 1 dienen - 3. Das Epithel-assoziierten Basalmembran und Aspekte der mesenchymalen Abteil, einschließlich der Mesenchymzellen, Wachstumsfaktoren und der extrazellulären Matrix, die von diesen Zellen produziert werden, sind für die Verzweigungsmechanismus, obwohl, wie die zellulären und molekularen Ereignisse koordiniert bleibt kaum verstanden 4 . Die Untersuchung der molekularen Mechanismen, die epithelialen Morphogenese unser Verständnis von Entwicklungsstörungen Mechanismen und bietet einen Einblick in mögliche Regenerationtive Medizin Ansätze. Solche Studien wurden aufgrund des Mangels an effektiven Methoden zur genetischen Manipulation der Speicheldrüse Epithel behindert. Derzeit stellt adenovirale Transduktion die effektivste Methode für die Ausrichtung Epithelzellen in der Erwachsenenbildung Drüsen in vivo 5. Doch in embryonalen Explantate behindert dichten Mesenchym und die Basalmembran umgibt die Epithelzellen viralen Zugang zu den Epithelzellen. Wenn die Mesenchym entfernt wird, kann das Epithel transfiziert mit Adenoviren werden, und wieder aufgenommen werden kann epithelialen Rudimente Verzweigungsmittel Morphogenese in Gegenwart von Matrigel oder Laminin-111 6,7. Mesenchym-free epithelialen Rudiment Wachstum erfordert auch zusätzliche Nahrungsergänzung mit löslichen Wachstumsfaktoren und nicht vollständig rekapitulieren Verzweigung Morphogenese, wie es in intakten Drüsen 8 auftritt. Hier beschreiben wir eine Technik, die adenovirale Transduktion von Epithelzellen und Kultur der transfizierten e erleichtertpithelium mit zugehörigen Mesenchym. Nach Mikrodissektion der embryonalen Maschinenpistolen, Entfernung des Mesenchym und Virusinfektion des Epithels mit einem GFP-haltigen Adenovirus zeigen wir, dass das Epithel sich spontan rekombiniert mit nichtinfizierten Mesenchym rekapituliert intakten SMG glandulären Strukturen und Verzweigungsmittel Morphogenese. Die gentechnisch veränderten epithelialen Zell-Population kann leicht überwacht werden unter Verwendung von Standard Fluoreszenzmikroskopie Methoden, wenn Fluoreszenz-markierten adenovirale Konstrukte verwendet werden. Das Gewebe Rekombination hier beschriebene Verfahren ist derzeit das wirksamste und zugänglich Verfahren zur Transfektion von epithelialen Zellen mit einem Wildtyp-oder mutierten Vektor innerhalb eines komplexen 3D Gewebekonstrukt, das keine Erzeugung transgener Tiere.
Protocol
Das Protokoll enthält vier wesentliche Schritte, wie in Abbildung 1 dargestellt. Alle Schritte werden ausführlich beschrieben. Adenovirus Konstruktion und viralen Reinigung sollte vor der Organraub zur Verwendung in der genetischen Transduktion seziert epithelialen Rudimente durchgeführt werden. Alle Standard-BSL-2 Vorsichtsmaßnahmen sollten bei der Arbeit mit Adenoviren werden.
Ein. Maus Embryonale submandibularis (SMG) Ernte und Mikrodissektion
- Einschläfern timed-schwangeren weiblichen Mäusen (Auszuchtstamm CD-1-oder ICR) mit CO 2 Narkose, durch Genickbruch und Ernte Saiten Maus-Embryonen am embryonalen Tag 13 (E13, 3-5 Epithelknospen) folgenden Verfahren durch den institutionellen IACUC zugelassen, gefolgt Ausschuss. Der Tag der vaginalen Plug Entdeckung wird als E0 bezeichnet. Speicheldrüsen können auch geerntet und auf dem E12 Bühne kultiviert werden, wenn es eine einzige primäre Knospe und Stiel mit Klüften gerade erst anfangenzu initiieren. SMGs vor diesem Zeitpunkt erfordern unterschiedliche Kulturbedingungen als die hier angegebenen.
- Übertragen Embryos Strings in sterile 10 cm Zellkulturschalen mit 25 ml DMEM / Ham 's F12 Medium (F12) fehlen Phenolrot (Life Technologies) und ergänzt mit 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin (Pen-Strep gefüllt, Life Technologies).
- Mit einem sterilen Skalpell (# 11 Klingen) und Pinzette (# 5, Fine Science Tools, 11252-20), entfernen Sie die Embryonen aus den Säcken in einem separaten 10 cm Schale mit 25 ml DMEM/F12 + Pen-Strep.
- Sever die Embryos Köpfe mit einer abgewinkelten kurz unterhalb des Unterkiefers.
- Isolieren Sie die unteren Kiefer aus den Köpfen unter einem Stereomikroskop Seziermikroskop mit einem Durchlicht Basis (Nikon SMZ645 oder gleichwertig) mit einem Schnitt unterhalb des Oberkiefers. Legen Sie die Gewebe auf der Oberseite eine zusätzliche Stück Glas anstatt direkt auf dem Glas Bestandteil des Mikroskops.
- Sammeln Sie die unteren Kiefer in 3 ml DMEM/F12 + Pen-Strep in einem sterilen 35 mm Gewebekulturschale.
- Platzieren eines Unterkiefers Scheibe auf dem Präpariermikroskop Stufe, so dass die Zunge auf der Unterseite der Scheibe ist, aber in Richtung der 12:00-Uhr-Position zeigt.
- Mit einer Seite von zwei gekreuzten Pinzette in einem scissoring Bewegung, entfernen und entsorgen Sie die untere 1/3 rd des Unterkiefers Scheibe.
- Drehen der Scheibe um 90 ° nach rechts (wenn rechtshändige) und, unter Verwendung eines scissoring Schnitt mit der Zange, schneiden den oberen Teil des Unterkiefers Scheibe (ohne Schneiden der Zunge) zur Hälfte in die Scheibe.
- Ziehen Sie die überschüssige Gewebe entfernt und entfernen Sie die Maschinenpistolen unter aussetzen. Es wird eine an jeder Seite in der Nähe der Basis der Zunge liegen.
- Mit einem Paar Pinzette halten das Gewebe durch die Zunge, verwenden Sie die anderen Pinzette, um die SMG necken weg von der Zunge. Wiederholen Sie dies für die anderen Drüse.
- Sammeln Sie die mikrodissezierten Speicheldrüsen in 3 ml DMEM/F12 + Pen-Strep in eine neue sterile 35 mm Gewebe-Kulturschale. Hinweis: Die größeren submandibularis (3-5 Epithelknospen) zusammen mit dem angeschlossenen kleineren sublingualis (1 Knospe) kultiviert werden können intakt durch Überspringen zu Schritt 4 und Durchführen der Schritte 4,1, 4,3 und 4,4, wie zuvor beschrieben 2,8.
2. SMG Epithelial Rudiment Separation
- Platz 5 (oder mehr) Speicheldrüsen in einen Glasboden, Durchmesser 50 mm Mikrotiter Schale (MatTek Corporation, P50G-1.5-14-F) mit 200 ul balanced salt Hank-Lösung (HBSS fehlt Ca + + oder Mg + +, Life Technologies) mit 0,4% (v / v) Dispase (Life Technologies, cat. Nr. 17105-041) und Inkubation für 15 min bei 37 ° C.
- Nach der Inkubation mit einem sterilen 200 ul Pipettenspitze vorsichtig absaugen das Dispase-Lösung, ohne die Drüsen. Sofort im 200 ul DMEM/F12 Medium mit 5% (w / v) BSA (DMEM/F12-BSA, mit einer 0,22 um Filter vorsterilisierten), um die Dispase neutralisieren. <li> Unter einem Binokular mit einer Pinzette mit feinen Spitzen (# 5 Dumostar, Fine Science Tools, 11295-20), sanft trennen den gelösten Mesenchym aus der ganzen SMG Epithelknospen und Kanäle, wobei darauf zu verlassen, das Epithel intakt .
- Pre-wet eine sterile 200 ul Pipettenspitze mit DMEM/F12-BSA Medien und vorsichtig pipettieren Sie die Epithelzellen Rudimente in eine neue 50 mm Durchmesser Mikrowell Schale mit 200 ul DMEM/F12 + Pen-Strep. Verwenden Sie ein hochwertiges 200 ul Pipettenspitze mit einem glatten Rand.
- In der Schale, die Mesenchym Stücke enthält, verwerfen alle nicht-mesenchymale Gewebe einschließlich der sublingualen Drüsen und alle freistehenden submandibularis Knospen.
3. Adenoviralen Infektion Epithelial Rudiments
- Make 200 ul Virusinfektion Medien durch Verdünnen des Adenovirus von Interesse in DMEM/F12 + Pen-Strep und in ein Mikrozentrifugenröhrchen, so dass der Titer der resultierenden Lösung 1x10 8 -10 9 PFUs ist. Dieoptimale Titer für verschiedene Viren erforderlich kann variieren. Es ist wichtig, Cäsiumchlorid (CsCl)-gereinigte virale Zubereitungen zur optimalen Aufnahme Effizienz zu verwenden.
- Entfernen Sie die Medien aus der Schüssel mit den fünf epithelialen Rudimente. Schnelles Hinzufügen von 200 ul der Infektion Medien, halten die Rudimente nassen zu allen Zeiten. Die notwendigen Vorsichtsmaßnahmen beim Umgang mit dem Virus und Entsorgung kontaminierter Pipettenspitzen. Desinfizieren Sie alle Virus-kontaminierten Oberflächen mit 10% Bleichlösung.
- Verschieben Sie die Epithelzellen Rudimente weit voneinander entfernt mit einer Pinzette, um sie nicht zusammenkleben und ihnen zu ermöglichen, um die Unterseite der Platte zu begleichen. Inkubieren Rudimente in viralen Medien für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Während der Inkubation, trennen Sie die Ansätze, wenn sie nahe beieinander bewegen. Übermäßige rocking oder Bewegung ermöglicht die Drüsen zu verklumpen.
- Nach der Inkubation, entfernen die viralen-haltigen Medien und entsorgen entsprechend, kümmert sich nicht um die r störenudiments. Fügen Sie 200 ul DMEM/F12 + Pen-Strep. Wiederholen Sie diesen wash mindestens zwei weitere Male und ersetzen mit 200 ul DMEM/F12 + Pen-Strep Medien. Diese Waschmittel sind kritisch für alle Viren, die nicht stark mit den Epithelien befestigt zu entfernen und um die Infektion der Mesenchym verhindern.
- Inkubieren epithelialen Rudimente mit 200 ml DMEM/F12, enthaltend 2% (v / v) Matrigel (BD Biosciences, 356.231) für 20 min. Wir finden, dass diese kurze Inkubation in Matrigel die Regression von vorhandenen Klüften minimiert während der anfänglichen Züchtungsperiode, aber dieser Schritt kann entfallen, wenn die Exposition gegenüber Matrigel nicht erwünscht verzichtet werden.
4. Ex vivo Kultur rekombinierte SMGs
- Legen Sie jedes Rudiment, ein zu einer Zeit, mit einem Pre-wet 200 ul Pipettenspitze auf einem gekerbten (klein geschnitten) 13 mm, 0,1 um Nuclepore Track-Etch Membranfilter (Whatman) schwimmt über 200 ul von Kulturmedien ( 5 Rudimente / Filter) in einem Glasboden-Mikrotiterplatte. Die Kulturmedienist: DMEM/F12 + Pen-Strep die 50 ug / ml Transferrin und 150 ug / ml Ascorbinsäure, wie zuvor 2,8 beschrieben. Transferrin ist bekannt, dass das Überleben zu stimulieren und Verzweigung Morphogenese der Speicheldrüse und andere Organe Explantate 9. Zusatz von Ascorbinsäure wurde gezeigt, stimulieren SMG Verzweigung. 10. Es ist bekannt, dass als Cofaktor in vielen Hydroxylierungsreaktionen von Stoffwechselwegen (wie Prolin Hydroxylierung während Kollagen Faserbildung 11) wirken und stimuliert auch Fibronectin und Laminin Produktion in anderen Organexplantaten 12.
- Entfernen Sie so viel Medien auf der Oberseite des Filters wie möglich nach Zugabe jeder Epithelzellen Rudiment. Too much media auf der Oberseite des Filters kann der Filter zu sinken, während weniger Medien macht Platzierung der Rudimente und Mesenchym viel einfacher. Excess Medien können entweder mit einer Pipettenspitze oder mit einer Pinzette, um die Medien zwischen den Spitzen greifen entfernt werden.
- Ort Mesenchym Stücke stammen from drei vor vier Drüsen auf der Oberseite und / oder um jeden epithelialen Rudiment. Nehmen Sie etwaige zusätzliche Medien, die rund um die Drüsen auf die Bewegung des Mesenchym weg von den Grundlagen zu vermeiden. Mesenchym stammt aus mehr Drüsen ist nicht förderlich, aber weniger kann sich nachteilig auf epithelialen Rudiment Wachstum.
- Inkubieren rekombinierten SMGs in einem befeuchteten Inkubator (95% Luft / 5% CO 2) bei 37 ° C für 48 -72 h, wie gewünscht.
- Erwerben Hellfeld und / oder fluoreszierende Bilder von Live-Drüsen bei 0 h (falls gewünscht), 2 Stunden nach Rekombination und alle 24 Stunden danach auf einer invertierten, aufrecht, oder Stereo-Lichtmikroskop mit einer Digitalkamera mit einem 4x oder 5x Vergrößerung Ziel ausgestattet erfassen die gesamte rekombinierten Drüse in einem einzelnen Frame Ansicht. Bilder der Speicheldrüse zeigen die besten Kontrast entweder mit dem Hellfeld Einstellung oder die entsprechende Phase Ring platziert einen Teil des Weges in den Strahlengang (das ist nicht voll automatisierte Mikroskope möglich). Standard Phasenkontrast keinet notwendig, da die Drüse ist dick und schafft Kontrast.
- An den gewünschten Zeitpunkten, können rekombinierte SMGs für 20 Minuten mit Fixiermittel Lösung von 2% Paraformaldehyd (PFA) in 1X PBS, enthaltend 5% (w / v) Saccharose (besser zu erhalten internen zellulären Struktur, indem die Zellen in gemacht festgesetzt ein isosmotische Zustand). Anders als 4% PFA, 2% PFA wird bewahren eine signifikante Menge des GFP-Signals, wenn das Fixiermittel vollständig nach der Fixierung entfernt wird. Drüsen können für bis zu speichernden 1 Woche in 1X PBS im Dunkeln bei 4 ° C bis whole mount Immunzytochemie und konfokale Bildgebung durchgeführt, wie zuvor berichtet 3,6,13-15. Idealerweise sollte Immunzytochemie und Bildgebung bald nach Fixierung durchgeführt werden, um die beste Bildqualität zu erhalten. Drüsen kann auch in RIPA-Puffer für SDS-PAGE durch Western-Blotting-Analyse verfolgt, lysiert werden.
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Representative Results
Die Strömung der großen experimentellen Schritte ist in 1 skizziert. Ein Beispiel eines intakten SMG, einem isolierten Epithelzellen Rudiment, und seine entsprechende Mesenchym sind in Abbildung 2 gezeigt. Hellfeld Bilder von rekombinierten Maschinenpistolen, die zu unterziehen Verzweigungsmittel Morphogenese bei kultivierten ex vivo für die angegebenen Zeiten, in Abbildung 3 dargestellt fort. Rekombinierte Drüsen für 48 hr exprimieren epithelialen GFP gewachsen sind in Abbildung 4 dargestellt. Konfokale Bilder von rekombinierten SMGs fixiert und bebildert nach 72 h in Kultur durch Immunzytochemie gefolgt, sind in 5 gezeigt. Die epithelialen Marker, E-Cadherin, grenzt das GFP-exprimierende Zellpopulation Epithelzellen aus dem umgebenden Mesenchym. Detektion des Basalmembranprotein, Perlecan, an der Peripherie des Epithels lokalisiert veranschaulicht zumindest teilweisen Wiederherstellung der Basalmembran in rekombinierter Drüsen. FBBILDUNG 6. Parasympathischen submandibularis Ganglien unterziehen Neuritenwachstum und innervieren die Drüsen in der Rekombination Kulturen nachgewiesen zuvor. 19
Abbildung 1. (A) Flowchart und (B) Schematische Darstellung der wichtigsten experimentellen Schritte.
Abbildung 2. Hellfeld Bilder von (A) eine ganze embryonalen Tag 13 (E13) Speicheldrüse zeigt den sublingualis Epithel (SL Epi) und der Submandibularis Epithel (SMG Epi) von Mesenchym (mes) umgeben ist. (B) Isolated epithelialen Rudiment, und (C) Mesenchym getrennt. Maßstabsbalken = 100 um.
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Abbildung 3. Hellfeld Bilder von epithelialen Rudimente (umrissen durch weiße gestrichelte Linien) von Mesenchym Stücke in ex vivo-Kultur für die angegebenen Zeiten gezüchtet umgeben. Epithelzellen unterziehen Verzweigung Morphogenese und mesenchymale Kondensation ist offensichtlich so früh wie 24 Stunden in der Kultur. Maßstabsbalken = 100 um
Abbildung 4. Hellfeld (A), fluoreszierende (B) und überlagerte (C) Bilder von rekombinierten SMGs in dem nur die Epithelzellen (umrissen in weiß gestrichelte Linien) mit GFP-exprimierenden Adenovirus und ex vivo kultiviert für 48 h infiziert. Maßstabsbalken = 100 um.
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Abbildung 5. Konfokale Bilder oder Hellfeld Bilder (BF) von rekombinierten SMGs mit (A) Kerne (DAPI, blau), adenoviralen GFP (grün), der epithelialen Marker markiert. E-Cadherin (rot), Maßstabsbalken = 250 um, oder (B) Kerne (DAPI, blau), adenoviralen GFP (grün), die epithelialen Marker, E-Cadherin (rot) und die Basalmembran Marker, Perlecan ( cyan), Maßstabsbalken = 50 um. Gestrichelte weiße Linien Umriss Epithel. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 6. Parasympathische submandibularis Ganglien unterziehen Neuritenwachstum und innervieren die Drüsen in der Rekombination Kulturen, Maßstabsbalken = 250 um.
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Discussion
Die ex vivo epitheliale-mesenchymale Rekombination Technik wurde erstmals für submandibular Speicheldrüsen im Jahr 1981 16 veröffentlicht. Bei diesem Protokoll, wir auf die ursprüngliche Methode erweitern, unter Verwendung adenoviraler Infektion Epithelzelle Genexpression im Kontext eines rekombinierten Drüse manipulieren. Wir zeigen, dass ein Prozentsatz der Epithelzellen mit dem Adenovirus infiziert sind, während der Prozentsatz an Zellen, die infiziert sind, hängt von den Eigenschaften des viralen Promotor, virale Titer und virale Reinheit. Wir haben festgestellt, dass es notwendig ist CsCl-Gradienten-gereinigten Viren für eine effiziente Transduktion Epithelzellen, die Reinigung von denen hier nicht beschrieben ist bedienen ist. Da wir auch in der Lage gewesen, die Mesenchymzellen vor Rekombination (Daten nicht gezeigt) zu infizieren, ist unabhängig genetische Manipulation der mesenchymalen Population ebenfalls möglich. Wir haben vor kurzem nutzte diese adenoviralen Transfektion / Gewebe Rekombination Methode, um eine Rolle zu identifizierenfür die Polarität Protein, PAR-1b, in der Steuerung der Platzierung der Basalmembran durch das Epithel in Entwicklungsländern Speicheldrüsen. Kinase-dead PAR-1b Adenovirus und Wildtyp-PAR-1b Adenovirus wurden sowohl in dieser Studie 13 zur epithelialen Rudimente infizieren und kombiniert mit E13 mesenchymes. Die Fähigkeit, Virusmutanten verwendet, um Funktionen von spezifischen Molekülen abzufragen verbessert die Nützlichkeit dieser Methode.
Es besteht derzeit ein Mangel an wirksamen Mitteln, um spezifische Moleküle innerhalb der epithelialen Zell-Population in intakten embryonalen Speicheldrüsen, ohne die mesenchymalen Fach Ziel. Obwohl mehrere Studien pharmakologische Inhibitoren zur Signaltransduktion in intakten Organ Kulturen zu manipulieren, beeinflussen diese Inhibitoren sowohl das Epithel und Mesenchym. Um direkt Beurteilung der Wirkung von Inhibitoren auf das Epithel, muss epithelialen Rudimente in Abwesenheit von Mesenchym in beiden o Matrigel gezüchtet werdenr Laminin-111 6,7 Gele. Kleiner inhibitorischer RNAs (siRNAs) sind eine effektive Methode nach unten zu regulieren epithelialen Genexpression seit siRNAs bevorzugt werden von den Epithelzellen in Gegenwart von höchstens Lipidträger 13,14,17,18 entnommen. Keines dieser Verfahren für stören Proteinspiegel oder Funktion ermöglichen Überexpression eines Wildtyp-oder Mutanten-Gens. Versuche herkömmlichen (nicht-viraler) Transfektion von embryonalen ganze SMG Kulturen haben mit beschränktem Erfolg, daß nur eine geringe Anzahl von Epithelzellen können gezielte (ML, unveröffentlichte Daten) werden erfüllt. Im Vergleich dazu stellt adenoviralen Transduktion ein effektives Verfahren zum spezifischen Transfizieren Speicheldrüsen Epithelzellen.
Parasympathischen Nerven wurden kürzlich gezeigt, dass für den normalen kritischen Speicheldrüse Verzweigung durch Aufrechterhalten eines Keratin 5-positiven Zellpopulation Vorläuferzellen 19. Ein Vorteil dieses Gewebes Rekombination Methode über die mesenchyme-freie epithelialen Rudiment Kulturverfahren ist, dass der parasympathischen Ganglien im Rekombination Kultursystem kann aufrechterhalten werden. Indem sorgfältige Spur des ungefähren Orts des parasympathischen Ganglien, welche in dem Mesenchym benachbart zum primären Epithelzellen Kanal 19 befindet, ist es möglich, sicherzustellen, dass jeder bis Rudiment mit einem Ganglion zugeordnet endet. Jedoch finden wir, dass durch Kombination von 3 bis 4 Drüsen Wert von mesenchymes mit jedem epithelialen Rudiment, wobei jeder mit einem Rudiment Ganglion ausreicht, um die Blüten zu einem gewissen Grad (Abbildung 6) innervieren zugeordnet ist, die aber nicht immer auf die gleichen wie in der intakten unmodifizierten Drüsen.
Es sind alternative Verfahren zum Infizieren des Epithels im Kontext des intakten Drüse. Wir haben bereits berichtet, dass die Mikroinjektion verwendet werden, um Adenovirus in Epithelzellen Einführung in intakten Drüsen 20,21 werden. Jedoch ist die Mikroinjektion schwierig control, kann physikalisch beschädigen die Drüsen, und in der Regel führt zu Infektionen von nur einer lokalisierten Untergruppe von Zellen 20. Adeno-assoziierte Viren (AAV) haben gezeigt, nützlich sein für die Transfektion von verschiedenen Zellpopulationen im Rahmen der intakten SMG Organexplantaten 22. Der Serotyp scAAV2 erwies sich als wesentlich effizienter an spezifischen Transduktion des Epithels der intakten SMGs gegenüber anderen rekombinanten AAV-Vektoren 23. Da nicht AAVs sind kommerziell breit verfügbar, noch hat die Kompetenz zur Vorbereitung AAV bestehen in den meisten Laboratorien, vorausgesetzt der adenovirale Transduktion und Gewebe Rekombination Protokoll ist hier ganz allgemein zugänglich meisten Labors als ist die Verwendung von AAV-Vektoren.
Während dieses Gewebe Rekombinationsverfahren rekapituliert Epithel-Mesenchym-Wechselwirkungen zu einem gewissen Grad, ist es auch möglich, das Epithel mit Adenovirus infiziert und wachsen dann das Epithel außerhalb seiner nativen Kontext.Wie zuvor erwähnt, infiziert man intakte Speicheldrüsen epithelialen Rudimente mit Adenovirus und dann wuchsen die Kulturen in Matrigel mit exogen zugesetzten Wachstumsfaktoren 17,20,21. Speicheldrüse Orgel Explantate können auch auf Nanofaser Gerüsten kultiviert werden, obwohl diese Gerüste nicht rekapitulieren die volle Funktion des Mesenchyms in ihrer derzeitigen Form 15. Während keine dieser Methoden rekapituliert die nativen Mesenchym, ermöglichen solche Methoden zur Nachahmung der spezifischen Eigenschaften des Mesenchym in ex vivo Kultur.
Jeder ex vivo Kultur Methode hat ihre eigenen Vor-und Nachteile, aber gilt für die Adressierung spezifischer wissenschaftlicher Fragen. Während die rekombinierte Drüsen nicht unterziehen soviel Verzweigungsmittel Morphogenese als intakte Speicheldrüse Organexplantaten, Organexplantaten, im Allgemeinen zu tun, nur in vivo Verzweigungsmittel Morphogenese für einige Tage rekapitulieren. Eine Lösung für dieses Problem besteht natürlich creaß transgenen Tieren mit gezielten Genexpression im Epithel Fach. Da es einen Mangel an bekannten Promotoren, die speziell in der frühen Entwicklung SMG Epithel aktiviert und transgene Technologie noch deutlich teurer als die beschriebenen Methoden stellen die Gewebe Rekombination hier beschriebenen Experimenten eine lebensfähige Modellsystem, um sowohl epithelialer und mesenchymaler Zellsignalprotein in studieren Anfang der Entwicklung Speicheldrüsenzellen in ihrem Gewebe Kontext.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Dr. Deirdre Nelson für hilfreiche Kommentare und für die kritische Durchsicht des Manuskripts danken. Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse DE019244, DE019197 und DE021841 um ML, F32DE02098001 um SJS und C06 RR015464 der University at Albany, SUNY finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/Ham's F12 Medium without phenol red | Life Technologies | 21041-025 | |
| Penicillin and Streptomycin | Life Technologies | 15070-163 | 10X stock |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | Freeze single use aliquots at -20C |
| BSA | Sigma | A2934-100G | Fraction V, low endotoxin |
| Adeno-X-GFP | BD Biosciences | 8138-1 | Should be high titer (1x1010 pfu/ml). CsCl purified viruses are more effective than column-purified viruses in this assay. |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 2% in PBS with 5% sucrose (w/v) |
| 1X Phosphate-buffered saline (PBS) | Life Technologies | 70011-044 | Prepared from 10X stock |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14175095 | no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red |
| Transferrin | Sigma | T8158 | 25 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media. Freeze single-use aliquots at -20C |
| L- Ascorbic acid (Vitamin C) | Sigma | A4403 | 75 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media.Freeze single-use aliquots at -20C |
| Table 1. List of reagents required for SMG recombination protocol. | |||
| 10 cm sterile plastic dishes | Corning | 430167 | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| Stereo dissecting microscope with transmitted light base | Nikon | SMZ645 | Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base. |
| 35 mm tissue culture dishes | Falcon | 353001 | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| 50 mm diameter microwell dishes | MatTek Corporation | P50-G-1.5-14F | |
| Nuclepore Track-Etch membrane filters | Whatman | 110405 | 13 mm diameter, 0.1 mm pore size |
| Widefield fluorescence microscope | Carl Zeiss, USA | Axio Observer Z1 | Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera. |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used. |
| Timed-pregnant female mice, strain CD-1 or ICR | Charles River Labs | Embryos are harvested on day 13 (with day of plug discovery designated as day 0). | |
| Scalpel blade #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Dumont #5 forceps inox alloy, 0.05mm X 0.02mm | Fine Science Tools | 11252-20 | Ideal for harvesting glands from embryos |
| Dumont #5 forceps dumostar alloy, 0.05mm X 0.01mm | Fine Science Tools | 11295-20 | Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used. |
| Table 2. Equipment used in SMG recombination protocol. | |||
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