Summary
Uma técnica para manipular geneticamente as células epiteliais no quadro da totalidade
Abstract
Ramificação morfogénese ocorre durante o desenvolvimento de muitos órgãos, e a glândula submandibular embrionário de rato (GSM) é um modelo clássico para o estudo da ramificação morfogénese. No desenvolvimento de SMG, este processo envolve passos iterativos de broto epitelial e formação de condutas, para finalmente dar origem a uma rede complexa ramificada de ácinos e ductos, que servem para produzir e modificar / transportar a saliva, respectivamente, para dentro da cavidade oral 1 - 3. A membrana basal epitelial associada e aspectos do compartimento mesenquimal, incluindo as células do mesênquima, factores de crescimento e da matriz extracelular, produzida por estas células, são essenciais para o mecanismo de ramificação, embora como os eventos celulares e moleculares são coordenadas permanece pouco compreendido 4 . O estudo dos mecanismos moleculares condução avanços morfogênese epiteliais nossa compreensão de mecanismos de desenvolvimento e fornece insights sobre Regener possívelAtive abordagens da medicina. Estes estudos têm sido dificultados pela falta de métodos eficazes de manipulação genética do epitélio salivar. Atualmente, a transdução adenoviral representa o método mais eficaz para os células epiteliais nas glândulas adultos in vivo 5. No entanto, em explantes de embriões, mesênquima densa e a membrana basal que envolve as células epiteliais viral impede o acesso às células epiteliais. Se o mesênquima é removida, o epitélio pode ser transfectado utilizando adenovírus, e rudimentos epiteliais pode retomar a morfogénese ramificação na presença de Matrigel ou laminina-111 6,7. Mesênquima livre de crescimento epitelial rudimento também requer suplementação adicional com factores de crescimento solúveis e não totalmente recapitular morfogénese de ramificação tal como ocorre nas glândulas intactas 8. Aqui descrevemos uma técnica que facilita a transdução adenoviral de células epiteliais e cultura do e transfectadaspithelium com mesênquima associado. Após microdissecção dos SMGs embrionárias, a remoção do mesênquima e infecção viral do epitélio com um adenovírus contendo GFP, vamos mostrar que o epitélio espontaneamente recombina com mesênquima não infectado, recapitulando estrutura intacta SMG glandular ea ramificação morfogênese. A população de células geneticamente modificadas epitelial pode ser facilmente controlada por meio de métodos padrão de microscopia de fluorescência, se fluorescentemente marcado com construções adenovirais são utilizados. O método de recombinação tecido aqui descrito é actualmente o método mais eficaz e acessível para a transfecção de células epiteliais com um vector do tipo selvagem ou mutante no interior uma estrutura de tecido complexo 3D que não requer a geração de animais transgénicos.
Protocol
O protocolo contém quatro etapas principais, conforme representado na Figura 1. Todos os passos são descritos em pormenor. Construção do adenovírus e purificação viral deve ser realizada antes da colheita de órgãos para utilização na transdução genética das dissecados rudimentos epiteliais. Todos os padrões de precauções BSL-2 de segurança devem ser seguidas quando se trabalha com adenovírus.
1. Embrionárias de camundongos glândula submandibular colheita (SMG) e Microdissecção
- Euthanize timed-fêmeas grávidas de ratinhos (estirpe CD-1 outbred ou ICR) usando CO 2 narcose, seguido por deslocação cervical e cordas de colheita de embriões de ratinho no dia embrionário 13 (E13, 3-5 brotos epiteliais) seguintes procedimentos aprovados pelo IACUC institucional comitê. O dia da descoberta plug vaginal é designado como E0. As glândulas salivares podem também ser colhidas e cultivadas na fase E12, quando existe um único botão primário e do caule com fendas apenas começandopara iniciar. SMGs anteriores a esta fase requer diferentes condições de cultivo que os indicados aqui.
- Transferir cordas de embriões em estéreis 10 centímetros pratos de cultura de tecido cheias com 25 ml de DMEM / Ham 's Medium F12 (F12) sem vermelho de fenol (Life Technologies), suplementado com 100 U / penicilina ml e 100 ug / ml de estreptomicina (pen-strep, Life Technologies).
- Usando um bisturi estéril (# 11 lâminas) e fórceps (# 5, Ferramentas Ciência Fine, 11.252-20), remova os embriões dos sacos em um prato separado 10 centímetros contendo 25 ml de DMEM/F12 + pen-strep.
- Cortar as cabeças de embriões com um corte angular, logo abaixo do maxilar inferior.
- Isolar as mandíbulas inferiores das cabeças sob um microscópio de dissecação estéreo com uma base de luz transmitida (Nikon SMZ645 ou equivalente), utilizando um corte abaixo do maxilar superior. Colocar os tecidos em cima de uma peça extra de vidro, em vez de directamente sobre o elemento de vidro da base do microscópio.
- Recolha as mandíbulas inferiores em 3 ml de DMEM/F12 + pen-strep em um prato de 35 milímetros estéril de cultura de tecido.
- Coloque uma fatia mandíbula na platina do microscópio de dissecação, de modo que a lingueta está na parte inferior da fatia, mas está a apontar para a posição 0:00 horas.
- Usando um dos lados de duas pinças cruzadas em um movimento de tesoura, remover e descartar o rd 1/3 inferior da fatia de mandíbula.
- Transformar a fatia de 90 ° para a direita (se destro) e, usando um corte de tesoura com o fórceps, cortar a parte superior da fatia da mandíbula (sem corte da língua) na metade da fatia.
- Descascar o tecido em excesso e removê-la para expor as SMGs por baixo. Haverá um de cada lado, perto da base da língua.
- Usando um par de fórceps para segurar o tecido pela língua, usar o fórceps outros para provocar a SMG longe da língua. Repita o processo para a glândula outro.
- Recolher as glândulas salivares microdissecadas em 3 ml de DMEM/F12 + pen-strep em um tecido estéril 35 milímetros novoplaca de cultura. Nota: as glândulas submandibulares maiores (3-5 brotos epiteliais), juntamente com a mais pequena glândula sublingual conectado (1 bud) podem ser cultivadas intactas saltando a etapa 4 e realizando os passos 4.1, 4.3, e 4.4, como descrito anteriormente 2,8.
2. SMG Separação Rudiment epitelial
- Colocar 5 (ou mais) das glândulas salivares para um fundo de vidro de 50 mm de diâmetro de micropoços prato (MatTek Corporation, P50G-1.5-14-F), contendo 200 ul de solução salina equilibrada de Hank (HBSS sem Ca + + ou Mg + +, Life Technologies) contendo 0,4% (v / v) de dispase (Life Technologies, cat. no. 17105-041) e incubar durante 15 min a 37 ° C.
- Após a incubação, utilizando uma ponta de pipeta estéril de 200 ul, aspirar cuidadosamente a solução de dispase, sem perturbar as glândulas. Imediatamente adiciona-se 200 ul de meio DMEM/F12 contendo 5% (w / v) BSA (DMEM/F12-BSA, pré-esterilizado com um filtro de 0,22 ^ M) para neutralizar a dispase. <li> Sob um microscópio de dissecação, usando um par de pinças com pontas finas (# 5 Dumostar, Ferramentas Ciência Fine, 11.295-20), gentilmente separar o mesênquima solto ao redor dos botões SMG epiteliais e dutos, tendo o cuidado de deixar o epitélio intacto .
- Pré-molhada estéril 200 ponteira ul com DMEM/F12-BSA mídia e gentilmente pipetar os rudimentos epiteliais em um 50 milímetros de diâmetro novo prato micropoços contendo 200 ul de DMEM/F12 + caneta strep. Use uma alta qualidade de 200 ul de ponta da pipeta com uma extremidade lisa.
- No prato que contém as peças mesênquima, descartar qualquer tecido não-mesenquimal, incluindo as glândulas sublinguais e quaisquer destacadas botões de glândulas submandibulares.
3. A infecção adenoviral de Rudiments Epiteliais
- Fazer 200 ul de meios de infecções virais através da diluição do adenovirus de interesse em DMEM/F12 + pen-strep em um tubo de microcentrífuga, de modo que o título da solução resultante é 1x10 8 -10 9 PFU. Otítulo óptimo requerido para diferentes vírus podem variar. É importante a utilização de cloreto de césio (CsCl), preparações purificadas virais para a eficiência de absorção óptima.
- Remova a mídia do prato contendo os cinco rudimentos epiteliais. Rapidamente adicionar 200 ul do meio de infecção, mantendo-se os rudimentos húmida em todos os momentos. Tome precauções necessárias ao manuseio do vírus e eliminação de pontas de pipeta contaminados. Desinfectar as superfícies contaminadas com vírus solução de água sanitária a 10%.
- Mover os rudimentos epiteliais longe um do outro, com uma pinça para evitar que fiquem colados e permitir que elas se depositem no fundo da placa. Incubar rudimentos em meios virais durante 1 hora à temperatura ambiente. Durante a incubação, a separação dos rudimentos, se eles se movem juntos. Balanço excessivo ou movimento vai permitir que as glândulas a se aglutinarem.
- Após a incubação, remova a mídia viral contendo e descartar adequadamente, tendo o cuidado de não perturbar o rudiments. Adicionar 200 ul de DMEM/F12 + pen-strep. Repita esta lavagem pelo menos mais duas vezes e substituir com 200 ul de DMEM/F12 + pen-strep mídia. Estas lavagens são críticos para remover qualquer vírus que não está fortemente ligado ao epitélio e para evitar a infecção do mesênquima.
- Incubar rudimentos epiteliais com 200 ml de DMEM/F12 contendo 2% (v / v) de Matrigel (BD Biosciences, 356231) durante 20 minutos. Descobrimos que esta incubação curto em Matrigel minimiza a regressão das fissuras existentes, durante o período de cultura inicial, mas este passo pode ser omitido se a exposição a Matrigel não é desejado.
4. Cultura ex vivo de SMGs recombinados
- Colocar cada rudimento, um de cada vez, usando uma pré-molhado 200 ul ponta de pipeta, em cima de um (pequeno corte) com entalhe 13 mm, 0,1 um Nuclepore Track-Etch membrana de filtro (Whatman) que flutuam mais de 200 uL de meio de cultura ( 5 rudimentos / filtro) em uma microplaca com fundo de vidro. Os meios de culturaé: DMEM/F12 + pen-strep contendo 50 ug / ml de transferrina e 150 mg de ácido ascórbico / ml, conforme descrito anteriormente 2,8. Transferrina é conhecido por estimular a sobrevivência e ramificação morfogénese de glândula salivar e de outros órgãos explantes 9. Adição de ácido ascórbico foi mostrado para estimular SMG ramificação. 10 É conhecido por actuar como um cofactor em reacções de hidroxilação de muitos processos metabólicos (tais como a hidroxilação de prolina durante a formação de colagénio fibra 11) e também estimula a produção de fibronectina e laminina em explantes de outros órgãos 12.
- Remover como meios muito em cima do filtro que possível após a adição de cada um rudimento epitelial. Media muito em cima do filtro pode causar o filtro para afundar, enquanto meios menos torna a colocação dos rudimentos mesênquima e muito mais fácil. Mídia em excesso pode ser removido quer com uma ponta de pipeta ou usando uma pinça para agarrar os meios de comunicação entre as pontas.
- Peças mesenquimais derivadas lugar from 3-4 glândulas na parte superior e / ou em torno de cada um rudimento epitelial. Remova qualquer mídia extra que está ao redor das glândulas para evitar o movimento do mesênquima longe dos rudimentos. Mesênquima derivado mais glândulas não é benéfico, mas pode ser menos prejudicial para o crescimento rudimento epitelial.
- Incubar SMGs recombinados num incubador humidificado (95% de ar / 5% CO 2), a 37 ° C durante 48 -72 horas, conforme desejado.
- Adquirir claro e / ou imagens fluorescentes das glândulas ao vivo a 0 h (se desejado), duas horas após a recombinação e cada hora 24, depois disso, um microscópio de luz invertida, na posição vertical, ou estéreo equipado com uma câmara digital, utilizando um objetivo de ampliação 4X ou 5X para capturar toda a glândula recombinada em um único quadro de vista. Imagens da glândula salivar mostrar o melhor contraste usando a configuração de campo claro ou o anel de fase apropriado colocado a meio caminho para o percurso da luz (que não é possível no totalmente automatizados microscópios). Contraste de fase normal hát necessário uma vez que a glândula é grossa e cria contraste.
- Nas desejados pontos de tempo, SMGs recombinados pode ser fixo durante 20 minutos com solução de fixação constituídos por 2% de paraformaldeído (PFA) em 1X PBS contendo 5% (w / v) de sacarose (para melhor preservar a estrutura celular interna, mantendo as células em um estado isosmótica). Ao contrário de PFA a 4%, 2% PFA irá preservar uma quantidade significativa do sinal de GFP, se o fixador estiver completamente removido após a fixação. Glândulas pode ser armazenado durante até 1 semana, em 1X PBS no escuro a 4 ° C até que toda a imunocitoquímica de montagem e de imagem confocal é realizada, como relatado anteriormente 3,6,13-15. Idealmente, imunocitoquímica e imagem deve ser realizada logo após a fixação de obter imagens de melhor qualidade. Glândulas também podem ser lisadas em tampão RIPA para SDS-PAGE seguido por Western blotting.
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Representative Results
O fluxo dos principais passos experimentais é apresentada na Figura 1. Um exemplo de um SMG intacto, um rudimento isolado epitelial, e sua mesênquima correspondente são mostrados na Figura 2. As imagens de campo claro de SMGs recombinadas, que continuam a sofrer de ramificação morfogénese quando cultivadas ex vivo para os tempos indicados, são mostrados na Figura 3. Glândulas recombinados cultivadas durante 48 horas expressando GFP epitelial são mostrados na Figura 4. Imagens confocais de SMGs recombinadas fixado e representado após 72 horas em cultura, seguido por imunocitoquímica, são mostrados na Figura 5. O marcador epitelial, E-caderina, o demarca expressando GFP-população de células epiteliais do mesênquima circundante. Detecção da proteína da membrana basal, perlecan, localizada na periferia do epitélio demonstra pelo menos reconstituição parcial da membrana basal em glândulas recombinadas. Figura 6. Gânglio submandibular parassimpático sofrem neuritos e inervam as glândulas em culturas de recombinação como demonstrado anteriormente. 19
Figura 1. (A) Fluxograma e (B) esquemático representando os principais passos experimentais.
Figura 2. Brightfield imagens de (A) um dia inteiro embrionário 13 (E13) da glândula salivar mostrando epitélio da glândula sublingual (SL Epi) e do epitélio da glândula submandibular (SMG Epi) rodeado por mesênquima (mes). (B) rudimento epitelial isolada, e (C) Separado mesênquima. Barra de escala = 100 pm.
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Figura 3. Imagens de campo claro de rudimentos epiteliais (delineada por linhas tracejadas brancas) rodeadas por peças mesenquimais cultivadas em cultura ex vivo durante os tempos indicados. As células epiteliais sofrem ramificação morfogênese e condensação mesenquimal é evidente tão cedo quanto 24 horas de cultura. Barra de escala = 100 pm
Figura 4. Brightfield (A), fluorescente (B) e (C sobrepostos) imagens de SMGs recombinadas em que apenas as células epiteliais (em linhas brancas delineado a tracejado) foram infectadas com adenovírus expressando GFP-e cultivadas ex vivo, durante 48 hr. Barra de escala = 100 pm.
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Figura 5. Imagens confocais ou imagens de campo claro (BF) de SMGs recombinadas marcados com (A) núcleo (DAPI, azul) adenoviral GFP, (verde), o marcador epitelial. E-caderina (vermelho), barras de escala = 250 pm, ou, (B) núcleos (DAPI, azul), adenoviral GFP (verde), o marcador epitelial, a E-caderina (vermelho), e o marcador de membrana basal, perlecan ( ciano), barra de escala = 50 um. Tracejada epitélio contorno branco linhas. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 6. Gânglio parassimpático submandibular submeter o crescimento de neurites e inervam as glândulas em culturas de recombinação, barra de escala = 250 pm.
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Discussion
O ex vivo técnica de recombinação epitelial-mesenquimal foi publicado em glândulas salivares submandibulares em 1981 16. Neste protocolo, expandir-se no método original, utilizando infecção adenoviral para manipular a expressão de genes das células epiteliais, no contexto de uma glândula recombinada. Mostra-se que a percentagem de células epiteliais infectadas com o adenovirus, enquanto que a percentagem de células que estão infectadas depende das propriedades do promotor viral, titulação viral e pureza viral. Nós descobrimos que é necessária a utilização de CsCl gradiente-vírus purificados por transdução eficiente epitelial, a purificação de que não é aqui descrita. Uma vez que também foram capazes de infectar as células do mesênquima antes da recombinação (dados não mostrados), a manipulação genética independente da população mesenquimal é também possível. Recentemente utilizado este método de recombinação adenoviral transfecção / tecido para identificar um papelpara a polaridade de proteína, PAR-1b, no controlo da colocação da membrana basal do epitélio em desenvolvimento das glândulas salivares. Quinase morta adenovirus PAR-1b e adenovírus de tipo selvagem PAR-1b foram ambas usadas neste estudo de 13 a infectar rudimentos epiteliais e recombinado com E13 mesenchymes. A capacidade de utilizar vírus mutantes para interrogar as funções de moléculas específicas aumenta grandemente a utilidade deste método.
Existe actualmente uma falta de instrumentos eficazes para atingir moléculas específicas dentro da população de células epiteliais intactas embrionárias em glândulas salivares, sem afetar o compartimento mesenquimal. Embora vários estudos utilizaram inibidores farmacológicos de manipular a transdução de sinal em culturas de órgãos intactos, esses inibidores de afectar tanto o epitélio e mesênquima. Para avaliar directamente efeitos dos inibidores sobre o epitélio, rudimentos epiteliais devem ser cultivadas na ausência de mesênquima em Matrigel ou or laminina-111 géis 6,7. Pequenos RNAs de inibição (siRNAs) são um método eficaz para regular negativamente a expressão de genes epiteliais desde siRNAs são preferencialmente absorvidos pelas células do epitélio na presença da maioria dos veículos lipídicos 13,14,17,18. No entanto, nenhum destes métodos para interferir com os níveis de proteína ou função permitir a superexpressão de um gene de tipo selvagem ou mutante. As tentativas de transfecção tradicional (não-viral) de culturas embrionárias SMG inteiras tiveram um sucesso limitado na medida em que apenas um pequeno número de células epiteliais podem ser segmentados (ML, dados não publicados). Em comparação, a transdução adenoviral representa um método eficaz para a transfecção salivares especificamente células epiteliais.
Nervos parassimpáticos foram recentemente mostrado ser importante para a glândula salivar normal, mantendo uma ramificação queratina 5-positivo população de células progenitoras 19. Uma vantagem deste método de recombinação de tecido ao longo do mesenchyme livre de método de cultura epitelial rudimento é que o gânglio parassimpático pode ser mantida no sistema de cultura de recombinação. Ao controlar cuidadosamente a localização aproximada do gânglio parassimpático, que está localizado no mesênquima adjacente à conduta primária epitelial 19, é possível assegurar que cada rudimento acaba de ser associado com um gânglio. No entanto, descobrimos que pela combinação das glândulas 3-4 no valor de mesenchymes com cada rudimento epitelial, cada um rudimento está associado com um gânglio suficiente para inervam os brotos em certa medida (Figura 6), embora nem sempre com a mesma que na não modificada intacto glândulas.
Há métodos alternativos para infectar o epitélio, no contexto da glândula intacta. Nós relatado anteriormente que a micro-injecção pode ser utilizado para introduzir adenovirus em células epiteliais das glândulas intactas 20,21. No entanto, é difícil de microinjecção Control, pode danificar fisicamente as glândulas, e tipicamente resulta em infecção de apenas um subconjunto de células localizadas 20. Vírus adeno-associados (AAV) têm-se mostrado úteis para a transfecção de populações de células distintas dentro do contexto de explantes de órgãos intactos SMG 22. O sorotipo scAAV2 mostrou-se substancialmente mais eficientes na transdução específica do epitélio do SMGs intactas em relação a outros vectores de AAV recombinantes 23. Desde AAV não são amplamente disponíveis comercialmente, e nem os conhecimentos necessários para preparar AAV existem na maior parte dos laboratórios, a transdução adenoviral e o protocolo de recombinação tecido fornecida aqui é geralmente mais acessíveis para a maioria dos laboratórios do que é a utilização de vectores de AAV.
Embora este método de recombinação recapitula tecido epitelial-mesenquimal as interacções, em certa medida, também é possível infectar o epitélio com adenovírus e em seguida o crescimento do epitélio fora do seu contexto nativo.Como anteriormente mencionado, nós infectado intactas salivares rudimentos epiteliais com adenovirus e, em seguida, as culturas cresceram em Matrigel com factores de crescimento adicionados exogenamente 17,20,21. Explantes órgãos das glândulas salivares também podem ser cultivadas em andaimes de nanofibras, embora estes andaimes não recapitular a função total do mesênquima na sua forma actual 15. Apesar de nenhum destes métodos recapitula o mesênquima nativa, tais métodos para permitir a imitação de propriedades específicas do mesênquima em cultura ex vivo.
Cada método de cultura ex vivo tem suas próprias vantagens e desvantagens, mas é aplicável para abordar questões específicas científicos. Enquanto as glândulas recombinados não sofrem tanto ramificação morfogênese como fazer intactas explantes glândulas salivares órgãos, explantes de órgãos, em geral, só recapitular in vivo ramificação morfogênese por alguns dias. Uma solução para este problema é, naturalmente, a creComeram animais transgénicos que contêm a expressão de genes alvo no interior do compartimento epitelial. Uma vez que existe uma falta de promotores conhecidos que são activados especificamente no desenvolvimento precoce epitélio SMG, e tecnologia transgénica permanece significativamente mais caros do que os métodos descritos, as experiências de recombinação de tecidos aqui descritos constituem um sistema modelo para estudar tanto a viabilidade das células epiteliais e mesenquimais sinalização desenvolvimento inicial de células de glândula salivar no seu contexto do tecido.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Nelson Deirdre pelos comentários úteis e para a leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo NIH DE019244, DE019197, e DE021841 a ML, F32DE02098001 a SJS, e C06 RR015464 para a Universidade de Albany, SUNY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/Ham's F12 Medium without phenol red | Life Technologies | 21041-025 | |
| Penicillin and Streptomycin | Life Technologies | 15070-163 | 10X stock |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | Freeze single use aliquots at -20C |
| BSA | Sigma | A2934-100G | Fraction V, low endotoxin |
| Adeno-X-GFP | BD Biosciences | 8138-1 | Should be high titer (1x1010 pfu/ml). CsCl purified viruses are more effective than column-purified viruses in this assay. |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 2% in PBS with 5% sucrose (w/v) |
| 1X Phosphate-buffered saline (PBS) | Life Technologies | 70011-044 | Prepared from 10X stock |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14175095 | no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red |
| Transferrin | Sigma | T8158 | 25 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media. Freeze single-use aliquots at -20C |
| L- Ascorbic acid (Vitamin C) | Sigma | A4403 | 75 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media.Freeze single-use aliquots at -20C |
| Table 1. List of reagents required for SMG recombination protocol. | |||
| 10 cm sterile plastic dishes | Corning | 430167 | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| Stereo dissecting microscope with transmitted light base | Nikon | SMZ645 | Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base. |
| 35 mm tissue culture dishes | Falcon | 353001 | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| 50 mm diameter microwell dishes | MatTek Corporation | P50-G-1.5-14F | |
| Nuclepore Track-Etch membrane filters | Whatman | 110405 | 13 mm diameter, 0.1 mm pore size |
| Widefield fluorescence microscope | Carl Zeiss, USA | Axio Observer Z1 | Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera. |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used. |
| Timed-pregnant female mice, strain CD-1 or ICR | Charles River Labs | Embryos are harvested on day 13 (with day of plug discovery designated as day 0). | |
| Scalpel blade #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Dumont #5 forceps inox alloy, 0.05mm X 0.02mm | Fine Science Tools | 11252-20 | Ideal for harvesting glands from embryos |
| Dumont #5 forceps dumostar alloy, 0.05mm X 0.01mm | Fine Science Tools | 11295-20 | Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used. |
| Table 2. Equipment used in SMG recombination protocol. | |||
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