Summary
Een techniek om genetisch te manipuleren epitheelcellen binnen het gehele
Abstract
Vertakkende morfogenese optreedt tijdens de ontwikkeling van vele organen en de muis embryonale submandibulaire klier (SMG) is een klassieke model voor de studie van vertakking morfogenese. In ontwikkelingslanden SMG impliceert dit proces iteratieve stappen van epitheliale knop en kanaal vorming uiteindelijk leiden tot een complex netwerk van vertakte acini en leidingen, die dienen te produceren wijzigen en / transporteren speeksel, respectievelijk in de mondholte 1 - 3. De epitheel-geassocieerde basaalmembraan en aspecten van de mesenchymale compartiment zoals de mesenchymcellen, groeifactoren en extracellulaire matrix, geproduceerd door deze cellen zijn essentieel voor de vertakking mechanisme, hoewel hoe de cellulaire en moleculaire gebeurtenissen worden gecoördineerd echter niet goed begrepen 4 . De studie van de moleculaire mechanismen die epitheliale morfogenese ons begrip van ontwikkelingsmechanismen en geeft inzicht in mogelijke geregenereerdtieve geneeskunde benaderingen. Deze studies door het ontbreken van effectieve methoden voor genetische manipulatie van de speekselklieren epitheel belemmerd. Momenteel adenovirale transductie de meest effectieve methode voor het richten epitheelcellen in volwassen klieren in vivo 5. Echter in embryonale explantaten, dichte mesenchym en de kelder membraan rond de epitheelcellen belemmert virale toegang tot de epitheelcellen. Als het mesenchym wordt verwijderd, kan het epitheel worden getransfecteerd met adenovirussen en epitheliale beginselen kunnen hervatten vertakking morfogenese in aanwezigheid van Matrigel of laminine-111 6,7. Mesenchym-vrij epitheliale rudiment groei vereist ook extra suppletie met oplosbare groeifactoren en niet volledig herhalen vertakking morfogenese als het zich voordoet in intacte klieren 8. Hier beschrijven we een techniek die adenovirale transductie van epitheelcellen en cultuur van de getransfecteerde e vergemakkelijktpithelium met bijbehorende mesenchym. Na microdissectie van de embryonale SMG, verwijdering van het mesenchym en virale infectie van het epitheel met een GFP-bevattende adenovirus, aangetoond dat het epitheel spontaan recombineert met ongeïnfecteerde mesenchym met vermelding intact SMG glandulaire structuur en vertakking morfogenese. De genetisch gemodificeerde epitheliale celpopulatie kan eenvoudig worden gecontroleerd met standaard fluorescentiemicroscopiemethodes als fluorescent-gemerkte adenovirale constructen gebruikt. Het weefsel recombinatie hier beschreven methode is momenteel de meest efficiënte en toegankelijke methode voor transfectie van epitheelcellen met een wild-type of mutant vector in een complex 3D weefsel construct dat niet nodig genereren van transgene dieren.
Protocol
Het protocol bestaat uit vier stappen, zoals afgebeeld in figuur 1. Alle stappen worden beschreven in detail. Adenovirus constructie en virale zuivering te worden uitgevoerd vóór de orgaanroof voor gebruik in de genetische transductie van epitheliale rudiments ontleed. Alle standaard BSL-2 veiligheidsmaatregelen moeten worden gevolgd bij het werken met adenovirussen.
1. Muis embryonale Submandibulaire Gland (SMG) Oogst en Microdissection
- Euthanaseren timed-zwangere vrouwelijke muizen (outbred stam CD-1 of ICR) met behulp van CO 2 narcose, gevolgd door cervicale dislocatie en oogst snaren van de muis embryo's op embryonale dag 13 (E13, 3-5 epitheliale knoppen) volgende procedures zijn goedgekeurd door de institutionele IACUC commissie. De dag van vaginale plug ontdekking wordt aangewezen als E0. Speekselklieren kunnen worden geoogst en gekweekt in de E12 stadium wanneer er een primaire knop en steel met spleten beginnendete starten. SMG voorafgaand aan deze fase vereisen verschillende kweekomstandigheden dan hier aangegeven.
- Breng embryo strings in steriele 10 cm weefselkweekschalen gevuld met 25 ml DMEM / Ham 's F12 Medium (F12) zonder fenolrood (Life Technologies), aangevuld met 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine (pen-strep, Life Technologies).
- Met een steriel scalpel (# 11 bladen) en tang (# 5, Fine Science Tools, 11252-20), verwijder de embryo's van de zakjes in een aparte 10 cm schotel met 25 ml DMEM/F12 + pen-strep.
- Sever het embryo hoofden met een schuine snede net onder de onderkaak.
- Isoleer de onderste kaken van de hoofden onder een stereo dissectiemicroscoop met een doorvallend licht-basis (Nikon SMZ645 of gelijkwaardig) met een snee onder de bovenkaak. Plaats de weefsels boven op een extra stuk glas in plaats van direct op het glas component van de microscoop base.
- Verzamel de onderste kaken in 3 ml van DMEM/F12 + pen-strep in een steriele 35 mm weefselkweek schotel.
- Plaats een onderkaak slice op de dissectiemicroscoop fase zodat de tong aan de onderzijde van de plak, maar wijst naar de 12:00 uur positie.
- Met behulp van een kant van twee gekruiste tang in een scharende beweging, te verwijderen en gooi het onderste 1/3 e van de onderkaak slice.
- Draai het segment 90 ° naar rechts (als rechts) en via een scharende cut met de tang, snij het bovenste gedeelte van de onderkaak slice (zonder dat de tong) halverwege het segment.
- Schil de overtollige weefsel weg en verwijder deze om de SMG eronder blootlegt. Er zal aan weerszijden nabij de basis van de tong.
- Met behulp van een pincet ingedrukt te houden het weefsel door de tong, gebruik dan de andere tang om de SMG los te maken uit de tong. Herhaal dit voor de andere klier.
- Verzamel de gemicrodissecteerde speekselklieren in 3 ml DMEM/F12 + pen-strep in een nieuwe steriele 35 mm weefselcultuur schotel. Let op: de grotere submandibulaire klieren (3-5 epitheliale knoppen), samen met de aangesloten kleinere sublinguale klier (1 knop) kan worden intact gekweekt door het overslaan van stap 4 en het uitvoeren van de stappen 4.1, 4.3, en 4.4, zoals eerder beschreven 2,8.
2. SMG Epitheliale rudiment Scheiding
- Place 5 (of meer) speekselklieren in een glazen bodem, 50 mm diameter microwell schaal (MatTek Corporation, P50G-1.5-14-F) met 200 pl gebalanceerde zoutoplossing Hank's (HBSS ontbreekt Ca + + of Mg + +, Life Technologies) bevattende 0,4% (v / v) dispase (Life Technologies, cat.. 17,105-041) en gedurende 15 min geïncubeerd bij 37 ° C.
- Na de incubatie met een steriele pipet 200 pi voorzichtig zuigen de dispase oplossing zonder de klieren. Onmiddellijk voeg 200 ul DMEM/F12 medium dat 5% (w / v) BSA (DMEM/F12-BSA, vooraf gesteriliseerde met een 0,22 urn filter) de dispase neutraliseren. <li> Onder een dissectiemicroscoop, met behulp van een pincet met fijne tips (# 5 Dumostar, Fine Science Tools, 11295-20), voorzichtig scheiden de losgemaakte mesenchym van rond de SMG epitheliale knoppen en kanalen, en zorg te vertrekken, het epitheel intact .
- Pre-nat een steriele 200 ul pipet tip met DMEM/F12-BSA media en voorzichtig pipetteren uit de epitheliale rudiments in een nieuwe diameter van 50 mm microwell schotel met 200 ul van DMEM/F12 + pen-strep. Gebruik een hoge kwaliteit 200 ul pipet tip met een gladde rand.
- In het gerecht dat het mesenchym stukken bevat, moet u alle niet-mesenchymale weefsels waaronder de sublinguale klieren en eventuele vrijstaande glandula submandibularis knoppen.
3. Adenovirale infectie van epitheliale Rudiments
- Maak 200 ul virale infectie media door verdunning van het adenovirus plaats in DMEM/F12 + pen-strep in een microcentrifugebuis zodat de titer van de resulterende oplossing 1x10 8 -10 9 PFUs. Deoptimale titer nodig is voor verschillende virussen kunnen variëren. Het is belangrijk om cesium chloride (CsCl)-gezuiverde virale preparaten voor optimale opname efficiëntie.
- Verwijder de media uit het schaaltje met de vijf epitheliale rudiments. Voeg snel 200 ul van de media infectie, waarbij de beginselen natte allen tijde. Neem de nodige voorzorgsmaatregelen bij het hanteren van het virus en de verwijdering van verontreinigde pipet tips. Desinfecteer enig virus-besmette oppervlakken met 10% bleekwater oplossing.
- Verplaats de epitheliale rudiments ver van elkaar forceps om te voorkomen dat aan elkaar kleven en ze naar de bodem van de plaat mogelijk te maken. Incubeer rudiments in virale media gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Tijdens de incubatie scheiden rudiments, als ze zich dicht bij elkaar. Overmatige schommelstoel of beweging zal de klieren samen te klonteren.
- Na incubatie, verwijdert u de virale-bevattende media en gooi de juiste, zorg ervoor dat u de r verstorenudiments. Voeg 200 ul van DMEM/F12 + pen-strep. Herhaal deze wash minstens twee keer en vervangen door 200 ui DMEM/F12 + pen-strep media. Deze wasbeurten zijn essentieel voor een virus dat niet sterk aan het epitheel verwijderen en infectie van het mesenchym voorkomen.
- Incubeer epitheliale rudiments met 200 ml DMEM/F12 die 2% (v / v) Matrigel (BD Biosciences, 356231) gedurende 20 minuten. We vinden dat dit korte incubatie in Matrigel de regressie van bestaande spleten minimaliseert tijdens de eerste kweekperiode, maar deze stap kan worden afgezien als blootstelling aan Matrigel niet gewenst.
4. Ex vivo cultuur van gerecombineerde SMG
- Plaats elke rudiment, een voor een, met behulp van een pre-wet 200 ul pipetpunt, op een inkeping (sneetje) 13 mm, 0,1 urn Nuclepore Track-Etch membraanfilter (Whatman) zwevend boven 200 pl kweekmedium ( 5 rudiments / filter) in een glazen bodem microwell plaat. De cultuur mediais: DMEM/F12 + pen-strep dat 50 ug / ml transferrine en 150 ug / ml ascorbinezuur, zoals eerder beschreven 2,8. Transferrine is bekend dat het voortbestaan te stimuleren en vertakking morfogenese van speekselklier en andere organen explantaten 9. Toevoeging van ascorbinezuur is aangetoond dat SMG vertakking stimuleren. 10 Het is bekend om als een cofactor in talrijke hydroxylering reacties van metabolisme (zoals proline hydroxylering in collageenvezelvorming 11) en stimuleert fibronectine en laminine productie in andere orgaansystemen explantaten 12.
- Verwijder zoveel media bovenop de filter mogelijk na het toevoegen van elk epitheliale rudiment. Teveel media bovenop de filter kan de filter te zinken, terwijl minder media maakt plaatsing van de beginselen en mesenchym veel gemakkelijker. Overmaat media kan worden verwijderd met een pipet of door forceps van de media tussen de tips grijpen.
- Plaats mesenchym stukken weer afgeleidm drie tot vier klieren geplaatst en / of rond elk epitheliale rudiment. Verwijder eventuele extra media die rond de klieren om beweging van de mesenchym voorkomen uit de buurt van de eerste beginselen. Mesenchym uit meer klieren niet voordelig maar minder schadelijk kunnen zijn voor epitheliale rudiment groei.
- Incubeer gerecombineerde SMG in een bevochtigde incubator (95% lucht / 5% CO2) bij 37 ° C gedurende 48 -72 uur, zoals gewenst.
- Verwerven helderveld en / of fluorescerende beelden van levende klieren bij 0 uur (indien gewenst), 2 uur na recombinatie en elke 24 uur daarna op een omgekeerde, rechtop of stereo licht microscoop uitgerust met een digitale camera met een 4X of 5X vergroting doelstelling vangen de hele gerecombineerde klier in een enkel frame gezien. Beelden van de speekselklier tonen de beste contrast met behulp van de helderveld of plaats het juiste fase-ring geplaatst gedeeltelijk in het lichtpad (wat niet mogelijk is op volledig geautomatiseerde microscopen). Standard fasecontrast geent nodig, omdat de klier is dik en zorgt voor contrast.
- Op de gewenste tijdstippen kan gerecombineerde SMG vast gedurende 20 minuten met fixatief oplossing gemaakt van 2% paraformaldehyde (PFA) in 1X PBS bevattende 5% (w / v) sucrose (interne celstructuur beter in stand houden van de cellen in een isosmotic staat). In tegenstelling tot 4% PFA, 2% PFA slaat een aanzienlijke hoeveelheid van het GFP signaal als het fixeermiddel volledig verwijderd na fixatie. Klieren worden bewaard tot 1 week in 1X PBS in het donker bij 4 ° C totdat whole mount immunocytochemie en confocale beeldvorming wordt uitgevoerd, zoals eerder 3,6,13-15. Idealiter immunocytochemie en imaging snel worden uitgevoerd na bevestiging aan de beste beeldkwaliteit te verkrijgen. Klieren worden gelyseerd in RIPA buffer voor SDS-PAGE gevolgd door Western blot analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De stroom van de belangrijkste experimentele stappen wordt geschetst in figuur 1. Een voorbeeld van een intact SMG, een geïsoleerde epitheliale rudiment en de bijbehorende mesenchym zijn weergegeven in figuur 2. Helderveld beelden van gerecombineerde SMG, die nog steeds ondergaan vertakkende morfogenese indien gekweekt ex vivo gedurende de aangegeven tijden, worden getoond in Figuur 3. Gerecombineerde klieren gekweekt gedurende 48 uur tot expressie epitheliale GFP worden getoond in Figuur 4. Confocale beelden van gerecombineerde SMG vastgesteld en afgebeeld na 72 uur in kweek gevolgd door immunocytochemie, zijn weergegeven in figuur 5. De epitheliale marker, E-cadherine, bakent de GFP-expressie epitheliale celpopulatie uit de omringende mesenchym. Detectie van het basale membraan eiwit, perlecan, gelokaliseerd aan de omtrek van het epitheel toont ten minste gedeeltelijke oplossing van het basale membraan in gerecombineerde klieren. Figure 6. Parasympathische ganglia submandibulaire ondergaan neurietuitgroei en innerveren de klieren in recombinatie culturen, zoals eerder aangetoond. 19
Figuur 1. (A) Stroomdiagram en (B) Schematische voorstelling van de belangrijkste experimentele stappen.
Figuur 2. Brightfield beelden van (A) geheel embryonale dag 13 (E13) speekselklier met de sublinguale klier epitheel (SL Epi) en de submandibulaire klier epitheel (SMG Epi) omringd door mesenchym (mes). (B) Geïsoleerde epitheliale rudiment, en (C) Gescheiden mesenchym. Schaal bar = 100 urn.
in-page = "always"> 
Figuur 3. Brightfield beelden van epitheliale rudiments (aangegeven door witte stippellijnen) omringd door mesenchym stukken gekweekt in ex vivo kweken gedurende de aangegeven tijden. Epitheelcellen ondergaan vertakking morfogenese en mesenchymale condensatie is merkbaar vanaf 24 uur in cultuur. Schaal bar = 100 urn
Figuur 4. Brightfield (A), fluorescent (B) en bedekt (C) beelden van gerecombineerde SMG waarin alleen de epitheelcellen (witte rand stippellijnen) werden geïnfecteerd met GFP-expressie adenovirus en gekweekt ex vivo gedurende 48 uur. Schaal bar = 100 urn.
highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50060/50060fig5.jpg "/>
Figuur 5. Confocale beelden of beelden helderveld (BF) van gerecombineerde SMG gemerkt met (A) kernen (DAPI, blauw), adenovirale GFP (groen), de epitheliale marker. E-cadherine (red), schaal bar = 250 urn, of (B) kernen (DAPI, blauw), adenovirale GFP (groen), de epitheliale marker, E-cadherine (rood) en de basale membraan marker, perlecan ( cyaan), schaalbalken = 50 pm. Onderbroken witte lijnen overzicht epitheel. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 6. Parasympathische ganglia submandibulaire ondergaan neurietuitgroei en innerveren de klieren in recombinatie culturen, schaalbalken = 250 pm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De ex vivo epitheliale-mesenchymale recombinatie techniek werd voor het eerst gepubliceerd voor submandibulaire speekselklieren in 1981 16. In dit protocol, we breiden de oorspronkelijke methode, met behulp van adenovirale infectie aan epitheliale cellen genexpressie te manipuleren in het kader van een gerecombineerde klier. Aangetoond dat het percentage van de epitheliale cellen geïnfecteerd met het adenovirus, dat het percentage cellen die zijn geïnfecteerd afhankelijk van de eigenschappen van de virale promoter, virale titer en virale zuiverheid. We hebben gevonden dat het noodzakelijk is CsCl gradiënt gezuiverde virussen gebruiken voor efficiënte transductie epitheel, de zuivering van wat hier niet beschreven. Aangezien wij ook in staat de mesenchymcellen infecteren vóór recombinatie (gegevens niet getoond), onafhankelijke genetische manipulatie van de mesenchymale bevolking is ook mogelijk. We hebben onlangs gebruik gemaakt van deze adenovirale transfectie / weefsel recombinatie methode om een rol te identificerende polariteit eiwit PAR-1b, bij de controle van de plaatsing van basaal membraan door het epitheel in ontwikkeling speekselklieren. Dood kinase PAR-1b adenovirus en wild-type adenovirus PAR-1b werden beide gebruikt in deze studie 13 tot epitheliale rudiments infecteren en gerecombineerd met E13 mesenchymes. De mogelijkheid om mutantvirussen gebruiken om functies van specifieke moleculen ondervragen vergroot het nut van deze werkwijze.
Er is momenteel een gebrek aan effectieve tools om specifieke moleculen binnen de epitheliale cel populatie in intacte embryo speekselklieren richten zonder dat de mesenchymale compartiment. Hoewel meerdere studies hebben gebruikt farmacologische remmers aan signaaltransductie in intacte orgaan culturen te manipuleren, deze remmers van invloed op zowel het epitheel en mesenchym. Direct om de effecten van remmers op het epitheel, moet epitheliale rudiments worden gekweekt in de afwezigheid van mesenchym in beide Matrigel or laminine-111 6,7 gels. Kleine remmende RNA (siRNA's) is een effectieve methode om neerwaarts reguleren epitheliale genexpressie omdat siRNA's zijn bij voorkeur opgenomen door de epitheelcellen in de aanwezigheid van de meeste lipide dragers 13,14,17,18. Geen van deze methoden voor het verstoren van eiwitniveaus of functie kunnen overexpressie van een wild-type of mutant gen. Pogingen tot traditionele (niet-virale) transfectie van embryonale gehele SMG culturen beperkt succes gehad aangezien slechts een klein aantal epitheelcellen kan worden gericht (ML, ongepubliceerde gegevens). In vergelijking adenovirale transductie is een effectieve methode voor specifiek transfecteren speeksel epitheelcellen.
Parasympathische zenuwen zijn onlangs aangetoond dat essentieel is voor normale speekselklier vertakking door handhaving van een keratine 5-positieve celpopulatie progenitor 19. Een voordeel van deze methode weefsel recombinatie de mesenchyme zonder epitheliale rudiment kweekmethode is de ganglion parasympathische kan worden gehandhaafd in de recombinatie kweeksysteem. Door hem goed bij welke geschatte locatie van het parasympathische ganglion, dat zich in het mesenchym nabij de primaire epitheliale kanaal 19, is het mogelijk te waarborgen dat elke rudiment eindigt behorend bij een ganglion. We merken echter dat het combineren 3-4 klieren waarde van mesenchymes met elke epitheliale rudiment elk rudiment wordt geassocieerd met een ganglion voldoende is om de knoppen innerveren enigszins (Figuur 6), hoewel niet altijd gelijk in de intacte gemodificeerde klieren.
Er zijn alternatieve werkwijzen voor het infecteren van het epitheel in het kader van de intacte klier. We eerder gemeld dat microinjectie kan worden gebruikt om adenovirus te introduceren in epitheelcellen in intacte klieren 20,21. Echter microinjectie moeilijk Control kan beschadigen van de klieren, en typisch leidt tot infectie van slechts een gelokaliseerde subset van cellen 20. Adeno-geassocieerde virussen (AAV) is aangetoond dat nuttig voor transfectie van afzonderlijke celpopulaties binnen de context van intacte SMG orgaan explantaten 22. Het serotype scAAV2 bleek aanzienlijk efficiënter ten specifieke transductie van het epitheel van intact SMG op andere recombinante AAV vectoren 23. Aangezien AAVs niet overal in de handel verkrijgbaar, noch de expertise AAV bestaan bereiden meeste laboratoria, de adenovirale transductie en recombinatie weefsel protocol die hier is algemeen toegankelijk voor de meeste laboratoria dan het gebruik van AAV vectoren.
Hoewel deze methode weefsel recombinatie recapituleert epitheliale-mesenchymale interacties enigszins is het ook mogelijk om het epitheel infecteren met adenovirus en het epitheel groeien buiten de oorspronkelijke context.Zoals eerder vermeld, we intact epitheel speeksel rudiments geïnfecteerd met adenovirus en de culturen in Matrigel groeide met exogeen toegevoegde groeifactoren 17,20,21. Speekselklier orgel explantaten kan ook worden gekweekt op nanovezel steigers, hoewel deze steigers niet herhalen het volledig functioneren van de mesenchym in hun huidige vorm 15. Hoewel geen van deze methoden recapituleert de inheemse mesenchym, zoals methoden laten imitatie van specifieke eigenschappen van het mesenchym in ex vivo cultuur.
Elke ex vivo cultuur methode heeft zijn eigen voor-en nadelen, maar is van toepassing voor het aanpakken van specifieke wetenschappelijke vragen. Hoewel de gerecombineerde klieren niet ondergaan zoveel vertakkingen morfogenese evenals intact speekselklier orgaan explantaten, organen explantaten, in het algemeen slechts herhalen in vivo vertakking morfogenese enkele dagen. Een oplossing voor dit probleem is natuurlijk createn transgene dieren met gerichte genexpressie binnen de epitheliale compartiment. Aangezien er weinig bekend promoters die specifiek worden geactiveerd in vroege ontwikkeling SMG epitheel en transgene technologie is aanzienlijk duurder dan de beschreven werkwijzen het weefsel recombinatie hier beschreven experimenten levensvatbaar modelsysteem zowel epitheliale en mesenchymale celsignalering in bestuderen vroege ontwikkeling speekselklier cellen in het weefsel context.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Dr Deirdre Nelson bedanken voor nuttige opmerkingen en voor het kritisch lezen van het manuscript. Dit werk werd gefinancierd door NIH subsidie DE019244, DE019197 en DE021841 te ML, F32DE02098001 aan SJS en C06 RR015464 aan de Universiteit van Albany, SUNY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/Ham's F12 Medium without phenol red | Life Technologies | 21041-025 | |
| Penicillin and Streptomycin | Life Technologies | 15070-163 | 10X stock |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | Freeze single use aliquots at -20C |
| BSA | Sigma | A2934-100G | Fraction V, low endotoxin |
| Adeno-X-GFP | BD Biosciences | 8138-1 | Should be high titer (1x1010 pfu/ml). CsCl purified viruses are more effective than column-purified viruses in this assay. |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 2% in PBS with 5% sucrose (w/v) |
| 1X Phosphate-buffered saline (PBS) | Life Technologies | 70011-044 | Prepared from 10X stock |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14175095 | no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red |
| Transferrin | Sigma | T8158 | 25 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media. Freeze single-use aliquots at -20C |
| L- Ascorbic acid (Vitamin C) | Sigma | A4403 | 75 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media.Freeze single-use aliquots at -20C |
| Table 1. List of reagents required for SMG recombination protocol. | |||
| 10 cm sterile plastic dishes | Corning | 430167 | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| Stereo dissecting microscope with transmitted light base | Nikon | SMZ645 | Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base. |
| 35 mm tissue culture dishes | Falcon | 353001 | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| 50 mm diameter microwell dishes | MatTek Corporation | P50-G-1.5-14F | |
| Nuclepore Track-Etch membrane filters | Whatman | 110405 | 13 mm diameter, 0.1 mm pore size |
| Widefield fluorescence microscope | Carl Zeiss, USA | Axio Observer Z1 | Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera. |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used. |
| Timed-pregnant female mice, strain CD-1 or ICR | Charles River Labs | Embryos are harvested on day 13 (with day of plug discovery designated as day 0). | |
| Scalpel blade #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Dumont #5 forceps inox alloy, 0.05mm X 0.02mm | Fine Science Tools | 11252-20 | Ideal for harvesting glands from embryos |
| Dumont #5 forceps dumostar alloy, 0.05mm X 0.01mm | Fine Science Tools | 11295-20 | Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used. |
| Table 2. Equipment used in SMG recombination protocol. | |||
References
- Tucker, A. S.
- Sakai, T., Onodera, T.
- Patel, V. N., Rebustini, I. T., Hoffman, M. P.
- Sequeira, S. J., Larsen, M., DeVine, T. Extracellular matrix and growth factors in salivary gland development. Frontiers of oral biology. 14, 48-77 (2010).
- Zheng, C., et al. Transient detection of E1-containing adenovirus in saliva after the delivery of a first-generation adenoviral vector to human parotid gland. J. Gene Med. 12, 3-10 (2010).
- Larsen, M., et al. Role of PI 3-kinase and PIP3 in submandibular gland branching morphogenesis. Developmental biology. 255, 178-191 (2003).
- Hoffman, M. P., et al. Gene expression profiles of mouse submandibular gland development: FGFR1 regulates branching morphogenesis in vitro through BMP- and FGF-dependent mechanisms. Development. 129, 5767-5778 (2002).
- Rebustini, I. T., Hoffman, M. P. ECM and FGF-dependent assay of embryonic SMG epithelial morphogenesis: investigating growth factor/matrix regulation of gene expression during submandibular gland development. Methods Mol. Biol. 522, 319-330 (2009).
- Partanen, A. M., Thesleff, I. Transferrin and tooth morphogenesis: retention of transferrin by mouse embryonic teeth in organ culture. Differentiation. 34, 25-31 (1987).
- Naka, T., et al. Modulation of branching morphogenesis of fetal mouse submandibular gland by sodium ascorbate and epigallocatechin gallate. In Vivo. 19, 883-888 (2005).
- Bornstein, P., Traub, W. The chemistry and biology of collagen. The Proteins. Neurath, H., Hill, R. L. 4, 3rd, Academic Press. 412-632 (1979).
- Zhou, L., Higginbotham, E. J., Yue, B. Y. Effects of ascorbic acid on levels of fibronectin, laminin and collagen type 1 in bovine trabecular meshwork in organ culture. Curr. Eye Res. 17, 211-217 (1998).
- Daley, W. P., et al. ROCK1-directed basement membrane positioning coordinates epithelial tissue polarity. Development. 139, 411-422 (2012).
- Daley, W. P., Gulfo, K. M., Sequeira, S. J., Larsen, M. Identification of a mechanochemical checkpoint and negative feedback loop regulating branching morphogenesis. Developmental biology. 336, 169-182 (2009).
- Sequeira, S. J., et al. The regulation of focal adhesion complex formation and salivary gland epithelial cell organization by nanofibrous PLGA scaffolds. Biomaterials. 33, 3175-3186 (2012).
- Nogawa, H., Mizuno, T. Mesenchymal control over elongating and branching morphogenesis in salivary gland development. Journal of embryology and. 66, 209-221 (1981).
- Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M.
- Daley, W. P., Kohn, J. M., Larsen, M. A focal adhesion protein-based mechanochemical checkpoint regulates cleft progression during branching morphogenesis. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 2069-2083 (2011).
- Knox, S. M., et al. Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. Science. 329, 1645-1647 (2010).
- Larsen, M., Wei, C., Yamada, K. M. Cell and fibronectin dynamics during branching morphogenesis. J. Cell Sci. 119, 3376-3384 (2006).
- Wei, C., Larsen, M., Hoffman, M. P., Yamada, K. M. Self-organization and branching morphogenesis of primary salivary epithelial cells. Tissue Eng. 13, 721-735 (2007).
- Zheng, C., Baum, B. J. Evaluation of viral and mammalian promoters for use in gene delivery to salivary glands. Mol. Ther. 12, 528-536 (2005).
- Hsu, J. C., et al. Viral gene transfer to developing mouse salivary glands. J. Dent. Res. 91, 197-202 (2012).
