Protein Transfektion af Mouse Lung

Summary

Transgene mus eller virale vektorer er blevet anvendt til at øge protein-ekspression i lungen. Men disse teknikker er tidskrævende, teknisk udfordrende og har off-target effekter, der kan forvirre resultaterne. Vores protein transfektionsprotokol anvender en lipidbaserede transfektionsreagens og en ultrafin microsprayer til ensartet levere aktivt protein til lungeceller.

Abstract

Stigende proteinekspression at forskerne til bedre at forstå den funktionelle rolle af dette protein i reguleringen af centrale biologiske processer ^1.. I lungerne, er dette blevet opnået typisk via genetiske tilgange, der udnytter transgene mus ^2,3 eller virale eller ikke-virale vektorer, der løfter proteinniveauer via forøget genekspression ^4.. Transgene mus er dyre og tidskrævende at generere og den tilfældige indsættelse af et transgen eller kronisk genekspression kan ændre normal lunge udvikling og således begrænse anvendeligheden af modellen ^5. Mens betingede transgene afværge problemer forbundet med kronisk genekspression ^6, de omvendte tetracyclin-kontrollerede transaktivator (rtTA)-mus, som anvendes til at generere betinget udtryk, udvikle spontan luftrum udvidelsen ^7. Som med transgene, er brugen af virale og ikke-virale vektorer dyre ⁸ og kan fremprovokere dosis-dependent inflammatoriske reaktioner, der forvirre resultater ⁹ og hindrer udtryk ^10.. Desuden er effekten af gentagne doser begrænset af forbedrede immunreaktioner på vektoren ^11,12. Forskere er ved at udvikle adeno-associerede virale (AAV) vektorer, der fremprovokerer mindre inflammation og har længere ekspression i lungen ^13..

Brug β-galactosidase, præsenterer vi en metode til hurtigt og effektivt at øge protein-ekspression i lungen med en direkte protein transfektion teknik. Denne protokol blander en fast mængde renset protein med 20 ul af en lipidbaseret transfektionsreagens (Pro-Ject, Pierce Bio) for at tillade indtrængen i lungevævet selv. Den liposomale proteinblandingen injiceres derefter i lungerne af mus via luftrøret med en microsprayer (Penn Century, Philadelphia, PA). Den microsprayer genererer en fin sky af flydende aerosol hele lungerne. Ved hjælp af teknikkenvi har vist ensartet afsætning af den injicerede protein hele luftveje og alveolerne af mus ^14.. Lipid transfektion teknik tillader anvendelse af en lille mængde protein for at opnå virkning. Dette begrænser den inflammatoriske respons, som ellers ville blive provokeret af højt proteinindhold administration. Faktisk bruger denne teknik, som vi offentliggjorde, at vi var i stand til at øge PP2A aktivitet i lungen uden at påvirke lungeudskylning cellularity ^15.. Lungeudskylning cellularitet taget 24 timer efter udfordring var sammenlignelig med kontrol (27 ± 4 kontrol vs 31 ± 5 albumin transficeret, N = 6 per gruppe). Desuden øger protein niveauer uden at inducere lunge udviklingsmæssige ændringer eller arkitektoniske ændringer, der kan forekomme i transgene modeller. Dog kan behovet for gentagne administrationer gøre denne teknik mindre gunstig for studier af effekten af ​​langsigtede stigninger i protein udtryk. Dette ville især være True for proteiner med korte halveringstider.

Protocol

1.. Fremstilling af Protein Transfection Reagent

1. Opløs Pro-Ject Reagens ved tilsætning 250 pi methanol eller chloroform til røret med den tørre film.
2. Vortex for 10-20 sekunder ved tophastighed.
3. Pipetter 20 ul Pro-Ject reagens i separate mikrocentrifugerør.
4. Opløsningsmidlet afdampes ved at placere mikrocentrifugerør indeholdende Pro-Ject Reagens under en laminar flow hætte i mindst 6 timer ved stuetemperatur. Det skal være helt tørt. Alternativt tørre Pro-Ject reagens ved hjælp af et vakuum.
5. Opbevar rør ved -20 ° C. De er gode i et år ved denne temperatur.

2.. Tilføjelse Protein til Pro-Ject Reagent

1. Tilsæt 50 gl PBS, indeholdende 2,0 ug af proteinet af interesse, ind i et rør indeholdende 20 ul tørret Pro-Ject transfektionsreagens.
2. Efter tilsætning af proteinet, blande opløsningen ved hvirvelbehandling ved lav hastighed feller 3-5 sek efterfulgt af inkubering i 30 minutter ved stuetemperatur.

3.. Intratrakeale Administration af protein

1. Bedøver mus ved intraperitoneal injektion af ketamin / xylazin (100 mg / kg og 10 mg / kg).
2. Efter sedation opnås, musene suspenderet fra deres øvre fortænder hjælp af en specielt designet platform (fig. 1).
3. Ved hjælp af pincet og en papirclips som et laryngoskop er oropharynx åbnes, således at kateteret kan blive indført (Figur 2). Stemmebånd visualiseres ved at placere en lyskilde mod luftrøret på musen.
4. Proteinet / projektleder reagensblanding (50 ul) injiceres gennem luftrøret med en Penn Century Microsprayer.

Representative Results

For at demonstrere effektiviteten af ​​vores teknik, vi brugte en microsprayer (Penn Century) for at injicere luftrøret af mus med 2 ug muse albumin (Sigma) opløst i 50 pi PBS, der indeholdt 20 ul Pro-Ject transfektionsreagens. De albumin behandlede mus blev sammenlignet med mus, der blev behandlet på samme måde med 2 ug af beta-galactosidase-protein (Pierce Bio). Efter 24 timer blev musene aflivet, og lungerne blev forarbejdet til histologisk analyse. Immunhistokemi for beta-galactosidase blev udført på formalinfikserede lunge vævssnit fra albumin og beta-galactosidase-behandlede mus. Selv 24 timer efter protein transfektion detekteret vi intens farvning i luftvejene (store pile) af beta-galactosidase-behandlede mus, men ikke de albumin behandlede mus (fig. 3A og 3B).

_upload/50080/50080fig1.jpg "/>
Figur 1. At placere mus i intratracheal injektion, blev en træ platform konstrueret som har en rampe ved en 45 ° vinkel fra sin base ^16.. Musene suspenderes fra fortænder ved en metaltråd, der er fastgjort til to metal kroge på toppen af rampen. Tungen forsigtigt flyttes med en pincet og papirclips laryngoskop bruges til at åbne luftvejene.

Figur 2. Efter markedsføringen af en lyskilde på halsen, kan strubehovedet visualiseres for intratrakeal injektion ^16.

Figur 3. β-galactosidase immunostains blev udført på 4-um lungesnit fra mus injiceret intratrachealt med 2 ug afalbumin (A) eller β-galactosidase (B). Pile angiver β-galactosidasefarvning i luftvejene. Billeder er på 40X forstørrelse. Skala bar = 100 um.

Discussion

Fordelen ved denne teknik i forhold til andre metoder er, at den producerer stigninger i protein niveauer og aktiviteten inden lungevævet selv. Desuden trænger til de mest distale regioner af lungen i modsætning til opholder blot inden for luftvejene. Vi har målt øget protein aktivitet i vores injektatet selv efter lavaging luftvejene med saltvand ^15.. Vævsaktivitet analyser viser, at proteinet ind celler og ikke forbliver i luftmellemrum musen. Dette blev yderligere bekræftet ved immunohistokemi viser diffus farvning af vores injiceret protein i alveolerne og luftveje mus (figur 3). Vigtigere, er denne protokol ikke provokere lunge betændelse eller protease udtryk. Således kan eventuelle ændringer, der opstår tilskrives virkningerne af indgivet protein. Manglen på inflammatorisk respons muliggør anvendelse af gentagne injektioner at undersøge effekter over en longer tidsrum.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pro-Ject	Pierce Bio	89850
Microsprayer	Penn Century	FMJ-250
Beta-galactosidase	Pierce Bio	89850
Beta-galactosidase antibody	Santa Cruz Bio	SC-19119
Mouse serum albumin	Sigma Aldrich	A3139
Ketamine/xylazine	Sigma Aldrich	K113